摘要
在阿尔茨海默病(AD)临床症状出现之前检测该疾病对启用新治疗方法至关重要。环状RNA(circRNAs)是高度稳定的非编码RNA，在大脑中富集，能够穿过血脑屏障。本研究分析了1221名AD患者和健康个体的血液数据，鉴定了34种与AD状态相关的circRNAs。包含这34种circRNAs的预测模型在基于生物标志物确认(β淀粉样蛋白和Tau蛋白)的AD分类中表现与血浆磷酸化Tau-217(pTau217)相当，并在Knight-阿尔茨海默病研究中心队列（n=551：76名AD患者，475名认知未受损）和前临床A4队列（n=1,767）中得到独立样本验证。基于生物标志物确认状态的血液circRNAs分类（曲线下面积(AUC)=0.945）比血浆pTau217（AUC=0.877）具有更高的预测能力，在整合模型中进一步提高（circRNA+pTau217 AUC=0.977）。该模型对AD表现出高特异性，对帕金森病、额颞叶痴呆和其他神经退行性疾病的预测能力较低。在Knight-阿尔茨海默病研究中心发现队列中，这些circRNAs（风险比=2.92）在预测向症状性AD进展方面优于pTau217（风险比=1.81）和β淀粉样蛋白-正电子发射断层扫描。尽管需要在更大队列中进行前瞻性验证，但这些结果提出血液circRNAs可能作为AD诊断和疾病进展的潜在生物标志物。
主要内容
环状RNA(circRNAs)是单链RNA，通过3'端连接到5'端形成共价闭合环。circRNAs比线性转录本更稳定，半衰期是线性RNA的两倍，能够穿过血脑屏障，并且在大脑中高表达。circRNAs的高稳定性和组织特异性调控表明它们作为血液生物标志物的潜在价值。
阿尔茨海默病(AD)是痴呆的主要原因，其特征是大脑中β淀粉样蛋白(Aβ)和Tau蛋白的聚集，伴随突触功能障碍和神经元死亡。AD的病理变化在认知能力下降之前数十年就已发生。在认知未受损(CU)个体中检测AD病理可能使干预措施能够延缓或预防不可逆的神经退行性变。由于死亡率随疾病严重程度增加，延缓疾病进展可能降低死亡率。
基于生物标志物确认的AD诊断传统上使用测量脑脊液(CSF)中Aβ、Tau和磷酸化Tau(pTau)的生物标志物或β淀粉样蛋白-正电子发射断层扫描(PET)。然而，通过腰椎穿刺收集CSF具有侵入性，而PET成本高昂。AD生物标志物正在不断演变，血浆中如pTau217等有希望的生物标志物正在出现。血浆pTau217与Aβ病理学强烈相关，而Aβ病理学在AD症状出现前许多年就开始积累。因此，在接受抗β淀粉样蛋白治疗后，血浆pTau217的减少可能限制其在临床中监测AD症状的能力。因此，需要额外的生物标志物来检测临床AD并在这一新的β淀粉样蛋白斑块治疗时代监测神经退行性变。
一些circRNAs已被证明在症状性AD个体与健康个体的脑和血液中表现出不同水平，因此它们是AD生物标志物的候选者。Ren等人报告了血液中少数几种与AD相关的circRNAs（总样本量=40），说明了血液circRNAs作为AD生物标志物的潜力。通过鉴定能够区分症状性AD个体与CU个体的血液circRNAs，可以考察具有AD诊断潜力的circRNAs。
本研究分析了横断面血液样本来鉴定与AD临床状态、Aβ和Tau分期以及向症状性AD进展相关的circRNAs。我们在两个队列的独立样本中验证了这些发现：Knight-阿尔茨海默病研究中心(ADRC)和抗β淀粉样蛋白治疗无症状阿尔茨海默病(A4)队列。这些数据集被用来开发和验证AD诊断和疾病进展的预测模型。
结果
研究设计
为鉴定与AD相关的血液circRNAs，我们从816名CU个体和405名AD参与者（涵盖整个AD连续谱）中生成了RNA测序(RNA-seq)数据（图1，表1，补充表1和补充图1）。血液采集时的平均年龄在AD个体和CU个体之间相似，分别为76.8岁和74.5岁。总共717个样本有CSF Aβ和pTau181测量值，776个有β淀粉样蛋白-PET数据，915个有血浆pTau217。我们使用多种circRNA生物信息学工具进行高质量且稳健的circRNA检测（补充表2）。接下来，我们分析了血液circRNA水平是否与临床AD相关。如果血液circRNAs在多重测试校正后与AD相关，则被视为显著相关。
接下来，我们开发了一个基于生物标志物确认状态(CSF Aβ和Tau水平)的预测模型，使用相关的circRNAs，并将该模型与β淀粉样蛋白-PET状态或血浆pTau217水平进行基准测试。由于高达30%的CU个体呈现β淀粉样蛋白病理后期会发展为疾病，我们利用纵向临床数据还确定了circRNA模型是否识别出那些进展为症状性AD的个体，并确定circRNAs在临床疾病发作前何时发生变化。为将我们的模型与其他已建立的生物标志物进行基准测试，我们对血浆pTau217、β淀粉样蛋白-PET和CSF生物标志物进行了比较分析，并分析了将circRNA模型与血液生物标志物pTau217整合是否能更好地预测向症状性AD的进展。
我们还进行了按性别、APOE4和祖先分层的敏感性分析。为确定该模型是否特异于AD或捕获了一般神经退行性变，我们在额外的帕金森病(PD)、额颞叶痴呆(FTD)和路易体痴呆(DLB)样本中测试了该模型。
最后，在额外的独立队列：Knight-ADRC和A4数据集中进行了验证分析。Knight-ADRC队列位于圣路易斯华盛顿大学，进行关于记忆和老化的前瞻性研究，用于AD的治疗和预防。A4队列考察了β淀粉样蛋白治疗和认知能力下降在β淀粉样蛋白积累的前临床AD个体中的情况。对于A4队列，仅可获得参与者基线样本的血液RNA-seq数据，这些参与者均为CU；我们对circRNA模型与生物标志物确认的AD状态和AD进展的关联进行了验证。由于A4队列中除一人外所有参与者均被招募为CU，CU个体血液采集时的平均年龄为71.4岁，而一名在早期疾病阶段被招募的个体血液采集时年龄为82岁。
鉴定与AD相关的血液circRNAs
为鉴定血液中与AD相关的circRNAs，我们分析了AD个体（n=405）和CU个体（n=829）的circRNAs水平，这些数据来自Knight-ADRC队列。使用两种用于识别和量化环状RNA的生物信息学程序：DCC和CIRI2，共有1,601个circRNAs通过了严格的质控(QC)。在203个与临床状态名义上显著相关（P<0.05）的circRNA转录本中，使用DCC计数，35个circRNA转录本通过了错误发现率(FDR)校正（扩展数据图1a），包括circDNAJC6（P=1.88 × 10^-8）、circMBOAT2（P=3.80 × 10^-4）和circPICALM（P=1.23 × 10^-3；补充表3）。
为确认结果稳健，我们对使用DCC鉴定出的203个与AD相关的circRNAs进行了CIRI2和CIRI3计数的敏感性分析（补充表4）。203个circRNAs使用CIRI2或DCC的效应大小高度相关（R^2=0.78，P<0.001），以及各个circRNA计数之间也高度相关（扩展数据图1b）。此外，35个DCC circRNAs中有34个保持FDR显著，具有相同的方向和高效应大小相关性（扩展数据图1c和补充表5）。CIRI3鉴定出全部34个circRNAs，其中32个通过了严格的QC，而circUBAP2和circSEC61A1略低于计数过滤阈值。在这34个显著circRNAs中，23个通过CIRI3计数通过了FDR校正，25个与临床状态具有名义上的显著相关性（扩展数据图1d-g）。此外，该第三种工具的circRNA计数与DCC（R^2=0.84，P<0.001）和CIRI2（R^2=0.85，P<0.001）高度相关。
血液circRNAs在各组织中的表达我们随后检查了这34个AD相关circRNA在大脑和其他组织中的表达。CircAtlas 3.0数据库包含33种不同组织的平均circRNA表达（每百万计数）数据。我们对大脑中的circRNA表达进行了百分位排名，34个circRNAs中有30个在各组织中的表达排名在第80百分位或以上（扩展数据图2a-c和补充表6）。此外，我们使用实时定量PCR(qPCR)检查了这些circRNAs的相对水平，21个circRNAs中有14个在大脑中显示出更高表达（扩展数据图2d-x）。总之，这34个circRNAs中的大多数在大脑中显示出高表达，表明这些转录本可能在大脑中富集，因为circRNAs能够穿过血脑屏障。
circRNA与血液中线性mRNA的独立性circRNA表达的变化可能独立于相应的线性mRNA，我们接下来确定这些circRNA关联是否与它们的相应线性mRNA独立。在这34个circRNA转录本中，33个转录本（31个基因）有相应的线性mRNA。如果circRNA在多变量模型中保持显著关联（P<0.05），则认为其关联与线性形式独立。87%以上（33个中有29个）的血液circRNAs被认为与它们的相应线性mRNA具有独立关联，包括circDNAJC6、circPICALM和circNUP54（补充表7）。
使用血液circRNAs进行AD诊断准确性
我们分析了与AD相关的34个circRNAs的诊断准确性（补充表8）。Knight-ADRC发现队列包括405名AD个体和816名有APOE4数据的CU个体。由于CU个体可能出现AD病理，且一小部分有记忆问题的参与者可能患有非AD痴呆，我们训练了circRNA模型来区分生物标志物阴性的CU个体（Aβ^-Tau^-（A^-T^-））和生物标志物阳性的AD个体（Aβ^+Tau^+（A^+T^+））。circRNA模型对A^-T^-与A^+T^+生物标志物确认样本的受试者工作特征曲线下面积(AUC)为0.945，高于血浆pTau217（AUC=0.877；图2a，补充图2和补充表9）。此外，将circRNA模型与pTau217模型结合导致AUC提高到0.967。
按性别分层的分析显示女性（AUC=0.903）和男性（AUC=0.909）都具有稳健的AUC（补充表10和11）。APOE分层分析显示在APOE4^-个体中AUC为0.856，在APOE4^+个体中为0.883（补充表12和13）。
我们接着考察了circRNA预测脑内β淀粉样蛋白沉积的能力，基于β淀粉样蛋白-PET（520个A^-，256个A^+）。相同的circRNA模型（相同的circRNAs、权重和阈值）显示出0.757的AUC（图2b），当与pTau217整合时，AUC提高到0.931（图2c-e）。整合的circRNA和pTau217模型显示出与CSF生物标志物Aβ42和pTau181结合相似的预测性能（A^+T^+；补充图3）。总之，这些数据显示，这34种血液circRNAs对生物标志物确认状态的预测能力（补充表14）高于大脑中的β淀粉样蛋白阳性。
血液circRNA预测模型在不同祖先群体中的稳健性为确定circRNA模型是否也可应用于不同遗传背景的样本，我们在欧洲（n=978）和非洲（n=92）祖先个体以及另外35名来自不同背景的个体（非裔美国人（n=16）、混血美国人（n=8）、东亚人（n=1）、南亚人（n=1）和混合祖先（n=9）；补充图4）中测试了相同模型。该模型在不同祖先群体中显示出相似的预测能力，包括欧洲（AUC=0.906）、非洲（AUC=0.934；图3a）和混合祖先（AUC=0.922）。总之，circRNA模型在不同祖先群体中显示出稳健的AUC。
血液circRNA模型对AD的特异性为确定34-circRNA模型是否特异于AD，我们还在非AD痴呆症（276例PD、26例DLB和11例FTD）中使用相同的CU参与者测试了相同模型。34-circRNA模型在非AD痴呆症中显示出非常低的AUC值（PD AUC=0.413，DLB AUC=0.545和FTD AUC=0.404；图3b,c）。我们进一步考察了是否有任何circRNAs在所有神经退行性疾病与对照组相比至少名义上显著（扩展数据图3a-d）。当比较所有疾病时，34个预测模型circRNAs中有3个（circRBM23、circEPB41和circNUP54）在所有疾病中至少名义上相关。这些结果表明预测模型中包含的大多数circRNAs是AD特异性的，这可以解释其他疾病中较低的预测能力。
向症状性AD的进展
由于临床数据显示有若干个体（78名参与者）在血液采集后从CU进展为症状性AD，我们进行了生存分析以确定34种血液circRNAs是否也能预测向症状性AD的进展（表1）。使用Cox比例风险模型，circRNA模型显示出2.92的风险比（HR）（95%置信区间(CI) 1.63-5.23），显著高于仅血浆pTau217（HR=1.81，95% CI 1.11-2.94；P=0.002；图4a,b）。
当分析5年内向症状性AD的进展时，也发现了类似结果，circRNA模型显示出显著更高的AUC（AUC=0.870；P=1.86 × 10^-5）比仅pTau217（AUC=0.676；图4c和扩展数据图4a,b）。性别和APOE分层分析也显示出高AUCs（AUC>0.80），显著高于pTau217（P<0.05）。因此，34种血液circRNAs比血浆pTau217更好地预测了AD进展。
接下来，我们分析了将pTau217与circRNA模型结合是否能进一步改善识别向症状性AD进展的个体的能力。对于这些分析，我们将生物标志物双阴性个体（pTau217和34个circRNAs；n=411）与双阳性个体（n=77）、仅pTau217阳性但circRNA模型阴性个体（n=146）以及相反模式的个体（n=54；图4b）进行比较。我们的分析表明，双阳性的个体确实比之前模型中的任何个体进展更快（HR=4.83，95% CI 2.19-10.68）。一般来说，仅15%的双阴性个体进展为AD，而84%的双阳性个体进展为AD。此外，这些分析确定了两个中间组：一个中低风险组，由pTau217阳性但circRNA阴性的个体定义（HR=3.25，95% CI 1.36-7.76），其中41%进展为AD；以及一个中高风险组，其中74%进展为AD（HR=3.96，95% CI 1.50-10.48）。
确定circRNA变化相对于疾病的时间
向症状性AD进展样本的伪轨迹我们使用生存模型计算了AD进展者的发病时间(TTO)，以推断整体34-circRNA模型相对于临床发作的变化时间。TTO定义为发病年龄与血液采集年龄之差（血液采集年龄-发病年龄）。我们基于TTO创建了以2年为间隔的区间，从"-8至-6"（n=5）、"-6至-4"（n=20）、"-4至-2"（n=33）到"-2至0"年（n=18）。circRNAs显示出从"-4至-2" TTO范围开始显著变化，并随着接近发作继续增加（图4d）。总之，这些观察表明，整体circRNA水平存在线性且一致的增加，从无症状阶段约2-4年前开始，并继续增加直到症状性AD。
我们接下来考察了整体circRNA模型与基于临床痴呆评定量表(CDR)的痴呆严重程度进展的关联。在血液采集时无认知障碍的样本中，血液circRNAs对区分未进展参与者（CDR=0；n=737）和进展为认知障碍参与者（CDR>0；n=42）的AUC为0.781（补充图5）。此外，血液circRNA模型在区分未进展参与者和进展为痴呆晚期参与者（CDR=0.5+；n=34）方面表现出更好的区分能力。同样，区分无认知障碍（CDR=0）和处于非常早期疾病阶段（CDR=0.5）的参与者具有0.722的AUC，表明血液circRNAs捕获了早期疾病阶段的变化（补充图6）。总之，34个circRNAs的整体水平与痴呆严重程度相关。
血液circRNA预测模型的验证
使用CIRI2和CIRI3计数的正交验证我们接下来考察了基于DCC的模型是否使用来自独立生物信息学工具CIRI2和CIRI3的读数计数具有预测能力。总的来说，使用任何circRNA工具的分析显示出相似的预测能力，使用CIRI2（AUC=0.848）和CIRI3（AUC=0.801）预测生物标志物确认状态与使用DCC计数的模型（AUC=0.945）相当（扩展数据图5a-c）。在预测向症状性AD的进展和生存分析中也发现了类似结果，表明任何circRNA量化工具都能产生稳健且一致的结果。
在Knight-ADRC中独立验证circRNA模型与AD相关表型的关系为分析模型在生物标志物状态预测中的稳健性，我们分析了circRNA模型与发现数据集中未用于训练生物标志物确认模型的β淀粉样蛋白-PET（n=543）和血浆pTau217（n=602）状态的关联。circRNA对AD生物标志物状态的预测能力在未用于训练的样本子集中相似，包括β淀粉样蛋白-PET（训练AUC=0.757；额外样本AUC=0.726）和血浆pTau217（训练AUC=0.747；额外样本AUC=0.716；扩展数据图6a-c）。
在独立Knight-ADRC样本中验证为在独立样本中验证血液circRNA模型，我们使用来自Knight-ADRC队列的单独样本来作为第一个验证队列（表1）。这些样本（n=551）包括生物标志物确认状态（36个A^+T^+ AD，174个A^-T^- CU）和β淀粉样蛋白-PET（147个A^+，303个A^-）数据。在具有血浆pTau217的参与者中，61人8年内进展为症状性AD。circRNA模型对生物标志物确认状态显示出0.863的AUC，当与pTau217整合时增加到0.955。相同模型也显示出对β淀粉样蛋白-PET阳性的高预测（AUC=0.771；扩展数据图7a-c）。circRNA模型也在预测向症状性AD进展方面得到验证，单独显示出3.83的HR，与pTau217结合时达到13.95（图4e）。
在独立A4队列中验证为在第二个独立AD队列中验证血液circRNA模型，我们挖掘了现有的A4 RNA-seq数据（表1）。由于该研究的RNA-seq数据是在所有参与者均为CU的基线时收集的，我们无法对生物标志物确认状态进行头对头比较。相反，我们分析了模型识别生物标志物阳性（β淀粉样蛋白-PET和血浆pTau217）个体的表现。circRNA模型对生物标志物状态显示出稳健预测（AUC=0.723；补充图7和8），与Knight-ADRC发现队列（AUC=0.755）和验证队列（AUC=0.757）中的β淀粉样蛋白阳性AUC相当。circRNA模型也在预测向症状性AD进展方面得到验证，显示出2.93的HR，显著高于pTau217模型（HR=1.87），当pTau217和circRNA模型整合时进一步增加到4.58。使用DCC、CIRI2或CIRI3计数时没有发现显著差异（图4e）。总之，使用Knight-ADRC队列创建的预测模型在A4数据集中针对脑β淀粉样蛋白沉积和向症状性AD进展模型得到验证，突出了模型的通用性和适用于血液AD诊断。
讨论
circRNAs由于其高稳定性、组织富集度和特异性，已成为预测疾病状态的潜在新候选者。识别血液中差异表达的circRNAs允许创建临床上相关的预测模型，以确定可能的AD生物标志物。本研究中，我们鉴定了34种与生物标志物确认状态相关的血液circRNA转录本，更重要的是，与向症状性AD的进展相关。在Knight-ADRC验证和A4队列中的验证表明，与血浆pTau217相比，circRNA模型在预测向症状性AD进展方面显著更高。这些结果表明血液circRNAs作为早期AD诊断和临床实践中进展监测的非侵入性、高精度工具的潜力。
先前的circRNA研究主要集中在大脑中，由于其高丰度和突触富集度。尽管这些研究涵盖了多个AD相关的大脑区域，包括顶叶皮层和海马，但大脑不易获取。相比之下，关于AD患者全血中circRNAs的研究较少但前景良好。其中只有Ren等人分析了血液中的circRNA计数是否可用作AD的生物标志物。该研究发现circRNAs可能用于预测由CSF生物标志物（pTau181/Aβ42）确认的临床状态。然而，该研究在小数据集（n=40）上进行，未分析其与向症状性AD进展的关联，也未将circRNAs与其他AD血浆生物标志物如pTau217整合。本研究使用来自特征良好的队列（Knight-ADRC）的大规模发现数据集，进一步在额外样本和独立大型队列（A4）中得到验证，并分析了circRNAs预测将进展为症状性AD个体的能力。
最近的生物标志物开发研究已转向评估β淀粉样蛋白积累而非临床状态，以识别具有潜在AD病理的无症状个体。血浆pTau217被广泛认为是前临床阶段AD的主要血浆生物标志物，并已被证明是β淀粉样蛋白病理的标志物，可在临床发作前15-20年发生变化。然而，pTau217在接受抗β淀粉样蛋白治疗的患者中可能不可靠作为生物标志物，因为它可能随着大脑Aβ斑块清除而正常化，而认知改善没有相应变化。在这一治疗领域中，监测整体神经退行性变需要独立于Aβ和Tau病理的生物标志物。我们的34种血液circRNAs似乎捕获了AD疾病生物学的整体情况，而不仅仅是病理。有趣的是，模型中某些circRNAs的宿主基因，如circDNAJC6，涉及突触功能，而β淀粉样蛋白前体蛋白受circCTCF和circRANBP9宿主基因调控。此外，我们34个预测AD的circRNA生物标志物中有2个源自PICALM基因，这是一个与Aβ、Tau、APOE4功能、突触功能障碍和小胶质细胞衍生神经炎症相关的全基因组关联研究显著的AD风险基因。因此，当我们评估circRNAs对生物标志物定义状态的准确性时，该模型在生物标志物确认个体中生成了0.945的稳健AUC，在β淀粉样蛋白-PET阳性中为0.757，这在独立样本和队列中得到验证，显示出与当前标准护理方式相当的强辨别能力。
确定circRNA转录本类型对于细胞定位和调控功能可能具有信息性。包含仅外显子的circRNAs是最常见的形式，位于细胞质中，而包含内含子的circRNAs位于细胞核中。这些外显子circRNAs通常结合microRNAs（miRNA海绵）或RNA结合蛋白以抑制靶标相互作用。这34种血液circRNAs包括23种外显子、9种内含子和2种非翻译区(UTRs)，其中circUBAP2位于3'-UTR区域，circEPB41位于5'-UTR区域，基于CircAtlas 3.0数据库。
除了与CSF和脑成像生物标志物直接比较外，我们还将我们的模型与AD血液生物标志物pTau217进行了基准测试。血浆pTau217在临床发作前15-20年发生变化，需要更好的预测AD发作的模型来确定向症状性AD的进展。值得注意的是，血液circRNA模型具有更高的预测能力来识别向症状性AD的进展（HR=2.92）比血浆pTau217单独（HR=1.9），这在另外两个队列中得到验证。尽管circRNA模型的HR显著高于pTau217，但这种增加可能不足以用于临床试验或治疗的适当参与者分层。向症状性AD的预测甚至在结合pTau217和circRNA模型后进一步提高，在发现数据集中HR为5.58，在验证数据集中为4.58和13.95。该组合模型能够区分非进展者（两种生物标志物均阴性）与高进展者（两种生物标志物均阳性），84%的阳性组进展为AD，而15%的非进展者进展为AD。本研究考察了血液circRNAs在确定向症状性AD进展方面的诊断潜力，这些发现突显了circRNAs捕获其他以病理为中心的生物标志物可能错过的动态进展信号的能力。
本研究有一些局限性。TTO子集的样本量较低，需要更多病例来进一步调查circRNA水平在AD临床发作前如何变化。同样，可用的CDR数据主要是CDR为0或0.5（非常早期疾病阶段）的，从CDR为0的个体中进展的样本量（n=42）有限。未来研究还需要考察AD合并症对血液circRNA模型的影响。尽管circRNAs主要在神经元中表达，特别是突触中，但它们也可能在其他细胞类型中找到。我们检查了模型中包含的circRNAs在几种细胞类型中的表达，以确定它们是否可能是大脑特异性的。我们使用两种不同替代方法的分析表明，模型中包含的大多数circRNAs在大脑中的表达高于其他组织，表明本研究中鉴定的大多数circRNAs可能在大脑中富集，尽管我们的分析无法证明血液circRNAs源自大脑。另一个潜在局限性是，在模型中的34个circRNAs中，有三个（circRBM23、circEPB41和circNUP54）也与其他神经退行性疾病（PD、DLB和FTD）相关，突显了病理重叠。尽管34-circRNA模型在非AD神经退行性变中预测能力较低，但仍需进一步分析来考察这三个circRNAs对一般神经退行性的预测能力。
鉴于血浆pTau217主要追踪β淀粉样蛋白病理，迫切需要β淀粉样蛋白沉积以外的生物标志物来检测和区分认知障碍进展与因抗β淀粉样蛋白治疗导致的病理减少。我们的结果支持将血液circRNAs用作非侵入性、可扩展的生物标志物来检测整体AD病理，其表现稳健，超越了当前领先的血液生物标志物在预测向症状性AD进展方面的表现。事实上，进展分析进一步揭示circRNA水平在疾病发作前2-4年发生变化，更接近症状出现。这些结果确立了34个鉴定出的circRNAs作为AD准确诊断的综合方法的潜力，对当前金标准如PET和pTau217具有优越的进展预测和AD特异性。在大型前瞻性队列中得到验证后，血液circRNA模型可推动AD的早期检测和监测。
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