化疗引起的周围神经病变（CIPN）是由广泛使用的抗癌药物如紫杉醇导致的神经退行性并发症。尽管CIPN发病率高且限制了化疗的使用，但目前尚无有效的治疗方法。最近，刺激线粒体自噬被提出作为治疗神经退行性疾病的潜在策略，但其在CIPN中的作用研究较少。本研究探讨了一种新型线粒体自噬诱导剂ALT001对紫杉醇诱发的果蝇和小鼠模型周围神经病变的治疗效果。
重要的是，在果蝇模型中，ALT001显著改善了紫杉醇引起的感神经元异常及热痛觉过敏表型，并依附于线粒体自噬机制。此外，研究还表明ALT001可以显著缓解小鼠模型中紫杉醇引发的机械性异常疼痛以及表皮内神经纤维密度的减少。有趣的是，ALT001不会干扰紫杉醇对肺癌或乳腺癌细胞的细胞毒性作用。这些结果表明ALT001是治疗紫杉醇诱发周围神经病变的潜在候选药物，同时刺激线粒体自噬是一种不影响化疗细胞毒性的CIPN治疗策略。
结果
新型异喹啉衍生物线粒体自噬诱导剂ALT001缓解果蝇模型中紫杉醇引起的感神经元变化
异喹啉衍生物ALT001是一种新发现的线粒体自噬诱导剂，能够高效刺激线粒体自噬且毒性较低。为了评估ALT001在CIPN中的治疗效果，我们使用了先前建立的果蝇紫杉醇诱发周围神经病变模型，该模型可定量评估热痛觉过敏及感神经元形态学变化。为了验证ALT001在线粒体自噬方面的效果，我们利用表达pH敏感线粒体自噬探针mt-Keima的果蝇幼虫，该探针特异性表达在C4da感神经元中。共聚焦显微镜分析显示，红点数量随着ALT001浓度增加而增多，这表明线粒体自噬水平与ALT001剂量相关。使用先前建立的方法量化线粒体自噬水平后发现，ALT001在750 µM剂量下使C4da神经元中的线粒体自噬水平增加了约59%。定量RT-PCR分析进一步显示，ALT001处理降低了线粒体DNA编码基因如ND5、Cyt-b和Cox2的mRNA水平，同时上调了关键线粒体生物发生调节因子PGC-1α、TFAM和EWG（人类NRF-1同源物）的表达。这些结果与我们之前的发现一致，表明ALT001不仅在哺乳动物细胞中促进线粒体自噬和线粒体生物发生，还能在果蝇中实现相同效果。
接下来，我们研究了ALT001如何影响紫杉醇引起的C4da神经元树突结构变化。C4da神经元树突结构的变化与紫杉醇治疗后周围神经病变表型的发展密切相关。使用质膜标记CD4-tdTomato可视化C4da神经元树突后发现，紫杉醇治疗显著增加了C4da神经元的树突长度和分支点数量。紫杉醇治疗使树突长度增加了23.6%，分支点数量增加了35.7%。值得注意的是，联合使用ALT001完全阻止了紫杉醇引起的C4da神经元树突长度和分支点数量的增加。对多个C4da神经元进行定量分析后发现，在ALT001存在的情况下，紫杉醇并未引起树突长度或分支点数量的显著变化。这些结果表明ALT001可能通过抑制树突分枝化来缓解紫杉醇引起的热痛觉过敏。
ALT001缓解紫杉醇引起的热痛觉过敏
接下来，我们研究了ALT001如何影响紫杉醇引起的痛觉过敏这一CIPN的关键特征。热伤害感受试验结果显示，紫杉醇治疗（20 µM）显著缩短了平均撤退潜伏期（MWL），即触发厌恶性螺旋滚动反应所需的时间。紫杉醇治疗将MWL从7.2秒降至4.5秒，减少了大约56%。这表明发生了痛觉过敏表型，与之前的研究一致。重要的是，ALT001联合治疗完全防止了紫杉醇引起的MWL降低，表明ALT001缓解了紫杉醇治疗引起的热痛觉过敏表型。
有趣的是，ALT001治疗并未显著改变MWL，表明ALT001对果蝇幼虫的热伤害感受反应没有影响。此外，与对照组相比，接受ALT001治疗的幼虫未显示出显著的体型差异，表明ALT001不影响幼虫生长。正如先前研究所述，紫杉醇显著抑制幼虫生长，即使在ALT001联合治疗下，这种效应依然存在，表明ALT001不会减轻紫杉醇对幼虫生长的影响。
ALT001通过替代性线粒体自噬途径缓解紫杉醇引起的热痛觉过敏
我们进一步研究了线粒体自噬是否对于ALT001治疗紫杉醇引起的痛觉过敏至关重要。我们此前证明，ALT001以ULK1-Rab9依赖的方式诱导线粒体自噬，而不依赖ATG7或PINK1。与这一观察一致，敲低C4da神经元中的ATG5或ATG7基因（这两个基因是经典线粒体自噬途径中的必需基因）并未干扰ALT001对紫杉醇引起的痛觉过敏的治疗效果。然而，敲低ULK1、Rab9或ATG6（Beclin1）基因（这些基因在替代性线粒体自噬途径中起关键作用）则完全消除了ALT001的治疗效果。这些结果表明，ALT001通过替代性线粒体自噬途径诱导线粒体自噬，从而缓解紫杉醇引起的伤害感受敏化。
ALT001改善小鼠模型中紫杉醇引起的机械性异常疼痛并防止表皮内神经纤维密度下降
为进一步验证ALT001的治疗效果，我们在紫杉醇诱发的小鼠周围神经病变模型中测试了其效果。紫杉醇给药会导致包括机械性异常疼痛和表皮内神经纤维（IENF）减少在内的周围神经病变表型。实验结果显示，接受重复紫杉醇注射（16 mg/kg，腹腔注射）的小鼠在第15天的von Frey试验中，爪子撤退阈值显著低于对照组。重要的是，ALT001（10 mg/kg腹腔注射）联合治疗显著缓解了紫杉醇引起的阈值降低。IENF损失是化疗诱发神经病变的代表性特征，紫杉醇给药已知会在动物和患者中引起IENF减少。我们的评估一致显示，相对于对照组，后爪皮肤中IENF数量减少了约25%。ALT001联合治疗也显著抑制了IENF的损失。这些结果表明ALT001不仅在果蝇模型中，还在小鼠模型中缓解了紫杉醇诱发的周围神经病变相关的感官功能障碍和神经退化。
ALT001不削弱紫杉醇在肺和乳腺癌细胞中的细胞毒性作用
为评估ALT001对紫杉醇细胞毒性潜力的潜在影响，我们在A549肺癌细胞和MCF7乳腺癌细胞中进行了克隆生存测定。克隆生存分析显示，ALT001联合治疗并未显著改变紫杉醇处理的A549和MCF7细胞的存活率。这些结果表明，ALT001至少在肺癌和乳腺癌细胞中不会削弱紫杉醇的细胞毒性作用。
讨论
开发既能预防化疗引起的神经退化又能保留其抗癌功效的药物对于治疗CIPN至关重要。在本研究中，我们证明了新开发的线粒体自噬诱导剂ALT001在果蝇和小鼠模型中对紫杉醇诱发的周围神经病变具有治疗效果。ALT001治疗缓解了果蝇模型中紫杉醇引起的感神经元变化和热痛觉过敏表型。此外，ALT001有效减轻了小鼠模型中紫杉醇引起的机械性异常疼痛并保护了IENF的损失。重要的是，ALT001并未削弱紫杉醇诱发的癌细胞死亡。这些结果表明ALT001在保留紫杉醇抗癌效力的同时对其毒性提供了神经保护。
线粒体自噬的诱导越来越被视为解决各种神经退行性疾病模型中线粒体功能障碍的有效治疗策略。通过线粒体自噬有针对性地清除受损线粒体对于维持线粒体功能和避免受损线粒体积累至关重要。线粒体功能缺陷可能损害神经元功能和生存，先前在各种细胞和动物模型中的研究表明，抗癌药物会损害周围神经元中的线粒体功能，从而显著促成CIPN的发生。
最近的研究揭示，包括紫杉醇在内的抗癌药物会引起各种线粒体缺陷，如肿胀、氧气利用率下降和ATP生成受损。此外，虽然线粒体毒素如鱼藤酮和寡霉素会加重紫杉醇引起的感官表型，但旨在促进线粒体功能的干预措施则改善了CIPN症状。我们此前报道过PINK1的表达或使用PINK1激活剂尼氯酰胺可缓解紫杉醇引起的热痛觉过敏。根据这些研究结果，刺激在线粒体功能中起重要作用的线粒体自噬可能为CIPN提供可行的治疗选择。与这一观点一致，在本研究中，ALT001作为一种特定替代性线粒体自噬途径的诱导剂，成功缓解了果蝇和小鼠模型中紫杉醇引起的神经退化和感官症状。我们的结果进一步支持了刺激线粒体自噬是CIPN治疗的有前景策略的观点。鉴于化疗引起的神经退化在CIPN中的核心作用，促进线粒体自噬可能有助于缓解其他化疗药物相关的周围神经病变。
我们的研究还强调，靶向替代性线粒体自噬途径可能对CIPN治疗有益。先前的深入研究已经确立了PINK1-Parkin依赖的经典途径在清除受损线粒体中的关键作用。然而，最近的研究揭示了替代性线粒体自噬途径在维持线粒体功能中的重要作用。我们最近的研究表明，ALT001可缓解阿尔茨海默病小鼠模型中海马区域的线粒体功能障碍和认知缺陷。ATG5和ATG7并非替代性线粒体自噬途径所必需，而是ULK1、Rab9和ATG6（Beclin1）在适当诱导中起关键作用。一致地，我们发现ALT001在ATG5和ATG7果蝇幼虫中缓解了紫杉醇引起的热痛觉过敏，但敲低ULK1、Rab9或ATG6则消除了ALT001介导的治疗效果。我们的结果表明，刺激ULK1-Rab9替代性线粒体自噬途径在紫杉醇治疗过程中有益于缓解神经退化。尽管我们的研究表明ALT001可以缓解紫杉醇诱发的周围神经病变，但线粒体自噬诱导如何防止紫杉醇引起的神经退化的分子机制仍不清楚。最近的一项研究表明，刺激线粒体自噬通过抑制慢性压迫性损伤小鼠模型中的炎性小体活化来缓解神经性疼痛。需要进一步研究以评估ALT001是否通过类似机制发挥神经保护作用。尽管我们的果蝇和小鼠模型提供了重要的体内证据，但未来使用人类神经元细胞系的研究对于剖析细胞机制和验证ALT001的转化潜力至关重要。此外，尽管在给予含5% DMSO和10% Tween 80的溶剂对照组中未检测到不良反应，但应使用不含DMSO的制剂验证ALT001的药理作用，以最终归因于化合物本身的生物学效应。同样，考虑到实验和临床制剂之间的潜在差异，未来研究中考虑使用临床批准的紫杉醇制剂可能会提高转化适用性。
总之，尽管替代性线粒体自噬途径对紫杉醇引起的神经损伤提供神经保护的确切分子机制仍有待阐明，但我们的研究确定ALT001是治疗紫杉醇诱发周围神经病变的有希望的候选药物。这项研究强调了在缓解化疗相关神经病变症状方面诱导线粒体自噬的治疗潜力，同时保留了化疗药物的抗癌效力。
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