摘要
Cyclospora cayetanensis（C. cayetanensis）是一种机会性细胞内球虫，可引发威胁生命的慢性腹泻暴发，尤其在免疫功能低下患者中危害严重。现有针对环孢子虫病的治疗药物因严重副作用和高复发率存在局限性。本研究旨在利用绿色合成的硒纳米颗粒（SeNPs）评估其对免疫抑制小鼠模型环孢子虫病的治疗效果。通过粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）生物合成SeNPs，并采用多种分析技术表征其特性。经分子鉴定寄生虫株系后，用10,000个C. cayetanensis孢子化卵囊感染免疫抑制小鼠，评估口服SeNPs（10 mg/kg/日）7天的疗效，包括寄生虫学、超微结构、组织病理学和生化指标。结果表明，SeNPs在感染后第30天使粪便卵囊负荷量显著降低97.96%，扫描电镜显示治疗组卵囊形态严重变形。治疗组小鼠肠道结构和炎症显著改善，持续至感染后第30天。比色分析显示，SeNPs使血清还原型谷胱甘肽（GSH）水平升高300%，同时抑制丙二醛（MDA）达63.46%。本研究首次揭示生物源SeNPs作为安全、高效的抗氧化纳米药物治疗实验性环孢子虫病的潜力。
引言
人类环孢子虫病是一种新兴的水媒介和食源性疾病，由C. cayetanensis、C. ashfordi和C. henanensis引起。其中C. cayetanensis是常见的人类感染物种，但尚未证实动物为其自然宿主。实验室已成功在豚鼠、瑞士白化小鼠、亚洲淡水蛤蜊和牡蛎中建立感染模型。54个热带和亚热带国家报告过C. cayetanensis感染病例，其中13国存在季节性暴发。发展中国家儿童、免疫低下者及外籍人士感染风险高于本土人群，而发达国家各年龄组均可感染。尽管多数感染者为自限性疾病，但免疫抑制患者可能出现严重腹泻甚至胆囊炎等肠外并发症。
目前尚无有效疫苗。复方磺胺甲噁唑（CMX）是首选药物，但存在骨髓抑制、肝肾毒性及磺胺过敏等副作用。环丙沙星和硝唑尼特疗效较低，但可作为替代。长期治疗导致耐药性和高复发率，亟需开发新型高效治疗方案。
材料与方法
药物
环磷酰胺（70 mg/kg/周）用于免疫抑制，CMX（5 mg/kg TMP+25 mg/kg SMX）作为对照药物。
生物合成与表征
从地中海亚历山大湾海水样本中分离的粪产碱杆菌菌株46N，在营养肉汤中培养后与Na2SeO3反应生成SeNPs。通过紫外-可见光谱、X射线衍射（XRD）、透射电镜（TEM）、能谱分析（EDX）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、动态光散射（DLS）等技术表征其光学、结构、形貌及功能特性。
动物实验
42只雄性瑞士白化小鼠分四组：未感染未治疗组（6只），感染未治疗组（12只），CMX治疗组（12只）和SeNPs治疗组（12只）。感染后第6天开始治疗，持续7天。感染后第14天和第30天各取6只小鼠处死，评估疗效。
评估方法
- 寄生虫学研究：感染后第6、10、14、30天采集粪便，经改良抗酸染色和藏红花素染色后计数卵囊。
- 超微结构研究：扫描电镜观察卵囊表面形态变化。
- 组织病理学：取回肠组织固定、包埋、切片，HE染色评估绒毛高度和炎症浸润。
- 生化分析：检测血清GSH和MDA水平。
- 安全性评估：12只未感染小鼠分两组，观察SeNPs（10 mg/kg）7天的临床、生化及组织病理学安全性。
结果
SeNPs表征
- 视觉与光学特性：生物合成的SeNPs呈现红色，UV-Vis光谱显示373 nm处有尖锐吸收峰。
- 结构特性：XRD图谱显示（100）、（101）、（102）、（111）、（201）、（210）晶面峰，与标准谱一致。
- 形貌特性：TEM显示单分散球形纳米颗粒，平均粒径81±15 nm。
- 功能特性：FTIR证实SeNPs表面结合蛋白质、磷脂、多糖等生物分子。
- 表面特性：DLS显示粒径分布均一（PDI=0.45），zeta电位-22.2 mV。
抗寄生虫效果
- 卵囊负荷：SeNPs治疗组在感染后第30天卵囊减少率达97.96%（p<0.001），而CMX组复发率达75.55%。
- 超微结构：SeNPs治疗组卵囊出现严重变形、大泡、多发性息肉和溃疡（见图6）。
- 组织病理学：SeNPs治疗组绒毛高度从136.4 μm恢复至303.8 μm（增加137.9%），炎症完全消退（见图7）。
- 生化指标：SeNPs使血清MDA降低63.46%，GSH升高300%（p<0.001）。
安全性评估
SeNPs治疗组小鼠体重、生化指标（ALT、AST、肌酐）及肝肾组织病理均正常（见表4、5）。
讨论
本研究首次证明生物源SeNPs对免疫抑制模型环孢子虫病的卓越疗效，其机制可能包括：
- 静电相互作用：SeNPs表面负电荷与卵囊壁蛋白结合导致结构破坏。
- 氧化应激：过量活性氧（ROS）引发寄生虫凋亡。
- 抗氧化修复：通过硒酶提升宿主抗氧化能力，清除MDA并恢复GSH水平。
与CMX相比，SeNPs在治疗后30天维持疗效且无复发，显示更优的长效性。此外，SeNPs通过调节肠道炎症和氧化应激显著改善组织损伤，其安全性已在多项毒理学研究中得到验证。
结论
本研究证实绿色合成的SeNPs可作为环孢子虫病的新型纳米治疗药物，具有显著抗寄生虫活性、肠道保护作用及低复发率。这是首次在免疫抑制小鼠模型中评估生物合成SeNPs对实验性环孢子虫病的疗效。未来需进一步研究不同剂量及药代动力学特性。
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