NAD+补充通过抑制过度营养信号恢复肥胖相关心力衰竭中的心脏保护性自噬和线粒体自噬
代谢性心肌病是肥胖的主要并发症，常进展为具有临床表现的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）。这种以心脏代谢为主的心力衰竭形式是一个日益严重的公共卫生问题，但目前缺乏基于证据的有效疗法。在此背景下，我们之前的研究表明，临床HFpEF与心脏中低水平的代谢辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）相关，并且口服NAD+前体烟酰胺（NAM）可改善多种啮齿动物模型中的HFpEF前期症状。然而，NAD+是一种多功能分子，其在HFpEF中的作用机制尚不明确。
由于自噬是一种受NAD+刺激的机制，对于维持细胞稳态和线粒体健康至关重要，特别是在长期处于代谢应激下的长寿心肌细胞中，我们推测自噬流的增加可能有助于NAM补充对抗代谢性心肌病及其相关的HFpEF。为了确定NAD+补充是否能刺激心脏自噬，我们在饮用含NAM水的ZSF1肥胖大鼠模型中评估了自噬标志物的mRNA和蛋白质水平。与之前的报告不同，我们使用了40%更低、因此更为临床可行的NAM剂量（饮用水中0.3% w/v），这使治疗组大鼠的心脏NAD+水平较对照组增加了30 ± 11%（均值±标准差）。NAD+的适度升高并未显著改变射血分数（图1A），但有效改善了HFpEF的关键症状。具体而言，NAM减少了心脏肥大和舒张功能障碍，如超声心动图测量的左心室（LV）质量、LV重塑和功能指标以及肺充血（胫骨长度标准化的肺重量）所示（图1A）。
这些NAM的心脏保护作用伴随着与自噬-溶酶体途径相关的几种mRNA表达的增加（图1B）。一致地，NAM刺激了微管相关蛋白1A/1B轻链3B（LC3B）的脂化，导致LC3B-II增加，同时降低了自噬底物sequestosome 1（SQSTM1，通常称为p62）至瘦型对照组的水平（图1B）。总的来说，这些发现表明NAM在肥胖相关HFpEF中的有益效果与恢复心脏自噬有关。值得注意的是，NAM还增加了表达线粒体自噬生物传感器Mito-Keima的小鼠中心脏线粒体的选择性降解（图1B），提示NAM可能通过改善线粒体质量控制来部分改善心脏功能。
从机制上讲，NAD+可以通过去乙酰化关键自噬蛋白（如ATG5、ATG7和LC3）的sirtuin-1激活自噬。然而，在基线或NAM治疗后，肥胖大鼠中这些自噬蛋白的乙酰化状态未发生显著变化（图1C）。因此，我们进行了全心脏乙酰化分析，结果显示NAM诱导了少量与自噬相关的蛋白的去乙酰化，但在任何组中均未检测到关键自噬机制蛋白的乙酰化（图1C）。因此，我们检查了心脏转录组，以揭示NAM治疗大鼠中自噬激活的分子基础。
有趣的是，胰岛素/IGF-1通路——一种主要的营养感应和心脏自噬抑制通路——在无偏基因集富集分析中成为重要结果之一（Benjamini-Hochberg调整后的P = 0.006；KEGG）。相应地，NAM将IGF-1受体的表达降低至瘦型对照组心脏的水平，并减少了IGF-1信号的活性，表现为下游效应器丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt在Thr 308和Ser 473位点磷酸化的减少（图1C）。更重要的是，IGF-1给药减少了NAM诱导心肌细胞自噬流的能力（图1D），这一结果在串联标记自噬报告小鼠模型（CAG-RFP-EGFP-LC3）中得到了验证。
综上所述，这些发现表明减弱的IGF-1信号传导，而非自噬机制蛋白的去乙酰化，是NAM在心脏中促自噬活性的基础。接下来，我们使用心肌细胞特异性Atg5缺陷（Atg5−/−）小鼠来检验自噬是否因果性地要求NAM的抗HFpEF效果。这些小鼠在心肌细胞中缺乏组成性自噬，直到15周龄时未检测到超声心动图上的收缩和舒张功能障碍。
因此，我们使用5周龄的Atg5−/−小鼠及其对照同窝小鼠（Atg5+/+），通过高脂饮食（HFD）和一氧化氮合酶抑制剂N[ω]-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）构建了一个“双击”HFpEF模型。在联合给予HFD和L-NAME 6周后，Atg5−/−和Atg5+/+小鼠均表现出射血分数保留，但出现了舒张功能障碍、LV重塑和肥大（图1E）。然而，与Atg5+/+小鼠相比，我们发现在HFD + L-NAME处理后，Atg5−/−小鼠的LV肥大更为明显（图1E）。NAM显著改善了HFD + L-NAME喂养的Atg5+/+小鼠的舒张功能障碍和LV重塑，但在Atg5−/−小鼠中未能发挥类似的心脏保护作用（图1E）。值得注意的是，NAM同样减少了Atg5−/−和Atg5+/+小鼠的体重增加（未显示），支持了NAM的心脏特异性作用。
最后，我们在一个前瞻性HFpEF患者队列（NETDiamond研究）中评估了我们的发现的转化潜力。我们量化了循环中的NAM及其降解代谢物甲基-NAM。具有较高甲基-NAM/NAM比值的HFpEF患者，表示NAD+生物合成中NAM的生物利用度降低，更可能是女性并且具有升高的B型利钠肽（BNP），但在其他经典心血管共病方面与较低甲基-NAM/NAM比值的患者没有显著差异（图1F）。更重要的是，在随访一年后的分层分析中，较高的甲基-NAM/NAM比值与不良结局（包括心血管死亡、HF住院、急性HF发作或利尿剂强化的复合终点）的显著更高风险相关（图1F）。在调整年龄、性别、肌酐和BNP水平后，这种关联仍然显著（图1F）。
本研究有一些局限性。虽然这里使用的代谢性HFpEF动物模型表现出相似的代谢和血液动力学压力，但它们的病因不同。ZSF1肥胖大鼠因过度进食导致肥胖和自发性高血压，而HFD + L-NAME小鼠则因高热量饮食和持续的一氧化氮合酶抑制分别变得肥胖和高血压。此外，由于Atg5−/−小鼠在生命早期出现心脏扩张，我们仅在年轻时短时间给予HFD和L-NAME。我们也承认，血浆中测量的甲基-NAM/NAM比值仅构成NAD+稳态的代理指标，因为NAD+本身在血浆中无法检测到。
尽管存在这些限制，我们得出结论，通过减少IGF-1信号传导恢复心脏自噬对于NAM改善代谢性HFpEF至关重要。我们的发现重申了通过下调过度营养信号刺激自噬在HFpEF中的治疗潜力，并与SGLT2抑制剂的提出作用机制一致，这是首个基于证据的HFpEF治疗方法。因此，有必要进行临床研究以确定通过NAD+前体补充激活自噬是否将成为治疗HFpEF患者的有效策略。为此，必须进行系统的剂量反应研究，以确定本文报道的较低NAM剂量（相当于平均体重70公斤的成年人每天1.5克）是否具有临床效果。
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