皮肤微生物组多样性与健康人类不同类型皮肤的生物物理特性相关性 - 健康研究

1. 引言

皮肤是人体最大的器官，作为宿主与外部环境之间的主要界面[1]。除了其公认的结构和免疫屏障功能外，皮肤还栖息着多样化的微生物生态系统，统称为皮肤微生物组，有助于维持皮肤生理和健康[2]。最近的研究强调了皮肤微生物组在维持稳态方面的重要作用，包括调节免疫反应、提供针对病原体的定植抗性以及支持皮肤屏障的完整性[3,4]。

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是皮肤上最广为人知的共生细菌之一。该菌种通过代谢汗液和皮脂成分产生抗菌脂肪酸和甘油，从而有助于屏障功能和抵御病原微生物[5,6]。表皮葡萄球菌产生的脂肪酸有助于维持皮肤的微酸性pH值，可以抑制病原微生物的定植，而甘油则有助于皮肤保湿和表皮屏障完整性[2,7]。这些代谢物共同被认为在皮肤健康中起重要作用。因此，表皮葡萄球菌通常被视为有益的共生细菌，有助于维持皮肤稳态和抵抗病原体[2,8]。

另一种主要的人类皮肤共生细菌——痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes，曾称为Propionibacterium acnes)，主要栖息在毛囊和皮脂腺中，代谢皮脂产生短链脂肪酸，包括丙酸。这些代谢副产物有助于维持皮肤表面的微酸性环境，可以抑制病原微生物的定植[2,3]。然而，痤疮丙酸杆菌的失调或过度增殖已被发现与炎症反应相关，最显著的是寻常痤疮[9]。这些现象共同突显了皮肤共生菌的环境依赖性作用，并强调皮肤健康不仅由单一分类单元的存在决定，而是由微生物群落的平衡活动塑造，影响屏障功能、免疫调节和抵抗病原定植的能力[4,10]。

下一代测序技术的进步，特别是16S rRNA基因分析，扩展了我们对皮肤微生物多样性的理解[10,11]。研究表明，皮肤微生物组包含比表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌等广为人知的物种更为广泛的细菌类群。然而，其中许多类群的功能作用、相互作用及其生态贡献尚不清楚[10]。解决这一知识缺口对于更全面地理解微生物群落如何塑造皮肤生理和病理至关重要。

先前的研究主要采用二分法框架，将皮肤状况分为"疾病状态"(如特应性皮炎或银屑病)或"健康状态"[10,12,13]。虽然这种方法提供了有价值的见解，但它忽视了临床上健康皮肤中存在的实质性异质性。因此，在本研究中，我们专注于健康皮肤，并进一步基于皮肤水分和皮脂含量的定量测量，将其分为四类——正常、油性、干性和混合性皮肤[14,15,16]。正常皮肤代表生理平衡状态，而油性、干性和混合性皮肤则反映了水合和脂质产生方面的不同失衡。通过分析这些类别中的皮肤微生物组，本研究旨在阐明微生物群落组成的差异如何与不同的皮肤健康状态相关联，从而推进当前对皮肤微生物生态系统与皮肤生理之间关系的理解。

2. 材料与方法

2.1. 皮肤水分和皮脂含量测量

对21-22岁健康女性受试者(n=43)的皮肤水分和皮脂含量进行测量，并采集皮肤细菌样本。参与者根据定量测量被分为四类皮肤类型，每组参与者数量如下：正常皮肤(n=19)、油性皮肤(n=13)、干性皮肤(n=5)和混合性皮肤(n=6)。测量部位为鼻梁，测量在5月至6月间进行。选择鼻梁作为取样部位是因为它代表了一个皮脂丰富的区域，具有相对较高的微生物密度，常用于皮肤微生物组研究，以捕获与皮肤生理相关的变异。所有参与者在入组前均签署了书面知情同意书，该研究已获得 Sugiyama Jogakuen University 伦理委员会的批准(批准编号：2022-2和2023-17)。

测量在室内环境温度保持在22-25°C的条件下进行。测量当天，参与者避免使用化妆品或护肤产品。参与者是健康个体，无已知的皮肤疾病。排除标准包括近期使用抗生素、皮肤疾病以及影响皮肤生理的局部或全身治疗。使用Triple Sense设备(Moritex，日本神奈川)测量皮肤水分和皮脂含量。根据制造商推荐的阈值进行皮肤类型分类，该阈值通常用于化妆品和临床应用中的标准化皮肤评估。每个参数测量三次并取平均值进行分析，标准差通常在平均值的5-10%以内，表明可接受的重现性。

2.2. 皮肤共生细菌定量

使用以下程序收集和培养皮肤共生细菌。用无菌棉签(J.C.B. Industry Limited，东京，日本)蘸取无菌水，对鼻梁区域(1×2 cm²)进行擦拭，同时施加一致的压力。收集后，将棉签浸入2 mL无菌水中，彻底涡旋以制备皮肤共生细菌悬浮液。将所得悬浮液进行系列稀释(10⁻¹至10⁻³)，取100 µL各稀释度涂布在营养琼脂和GAM琼脂平板上。培养基在37°C下有氧或厌氧培养48小时。厌氧培养使用AnaeroPack系统和厌氧罐(Sugiyama Gen，东京，日本)进行。培养后，计数形成的菌落数，并将细菌丰度表示为每平方厘米菌落形成单位(CFU/cm²)。

2.3. 16S rRNA基因扩增子测序样品准备

使用DNeasy® PowerBiofilm试剂盒(Qiagen，德国北莱茵-威斯特法伦州希尔登)从细菌沉淀中提取基因组DNA，按照制造商的说明进行。将提取的DNA在无菌蒸馏水中洗脱，并使用NanoDrop™ 2000分光光度计(Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)评估DNA浓度和纯度。

使用针对V3-V4高变区的16S rRNA基因扩增子测序分析皮肤微生物组。PCR扩增使用引物对314F (5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNN-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R (5′-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-NNNNN-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)进行。PCR使用TaKaRa Ex Taq® Hot Start Version (TaKaRa，日本京都)在Takara PCR Thermal Cycler Dice上进行，条件如下：95°C初始变性3分钟；30个循环的95°C变性30秒、55°C退火30秒和72°C延伸60秒；随后在72°C最终延伸10分钟。

测序文库基于DNA浓度标准化，汇集后在Illumina MiSeq平台上使用2×300 bp双端V3-V4测序试剂盒进行测序。平均测序深度约为每样本27,500个读段(范围：18,652-38,119个读段)，质量控制后无样本被排除。

在DNA提取和PCR扩增过程中包含阴性对照，并与所有样本一起处理以监测潜在的污染。这些对照中未观察到扩增。

2.4. 微生物群落分析

使用QIIME 2软件(版本2021.11)[17]进行微生物群落分析。将解复用的双端序列导入QIIME 2，并使用DADA2 denoise-paired插件进行质量过滤、去噪和嵌合体去除，从而生成扩增子序列变体(ASVs)。

在稀释深度为每样本18,000个读段的稀释数据上进行α和β多样性分析。使用Chao1丰富度估计器和Shannon多样性指数评估α多样性。基于非加权UniFrac距离评估β多样性，并使用主坐标分析(PCoA)进行可视化。使用针对V3-V4区域修剪的SILVA SSU rRNA数据库(版本138)训练的朴素贝叶斯分类器进行分类学分类。在可能的情况下，序列被分配到属水平。平均而言，94.9%的读段被分配到属水平(范围：73.8-100%)，表明高分类学分辨率。未分类读段的比例较低，且未观察到主要的未分类类群。

使用Galaxy网络平台( LDA得分阈值>2.0，识别不同皮肤类型之间的差异丰度分类单元。根据LEfSe结果生成系统发育树。

2.5. 统计分析

所有统计分析均使用EZR(版本1.68；日本Tochigi县Jichi医学院Saitama医疗中心)和R软件(版本4.5.2；R统计计算基金会，奥地利维也纳)[19]进行。

使用Kruskal-Wallis检验评估组间差异。当检测到显著差异时，使用Steel-Dwass检验进行事后成对比较，该检验考虑了多重比较。使用Spearman秩相关系数进行相关性分析。

统计显著性设定为p<0.05，0.05≤p<0.10被视为表明趋势。

3. 结果与讨论

3.1. 皮肤生物物理特性与不同皮肤类型微生物丰度的关系

首先，根据从鼻部区域获得的皮肤水分和皮脂含量的定量测量结果确定每位参与者的皮肤类型，结果如图1所示。绘制了每位参与者的皮脂和水分含量的个体数据点，显示了四类皮肤类型的水分和皮脂水平的明显模式：正常皮肤(水分：41-67；皮脂：0-46)、油性皮肤(水分：43-62；皮脂：61-99)、干性皮肤(水分：7-23；皮脂：0-23)和混合性皮肤(水分：3-24；皮脂：44-90)。

使用无菌棉签从每位参与者的鼻部区域收集皮肤细菌。将样本接种到标准营养琼脂平板上并在有氧条件下培养，以及接种到GAM琼脂平板上并在厌氧条件下培养。有氧和厌氧细菌计数分别显示在图2A、2B中，它们的总和用于估计可培养的总细菌负荷(图2C)。各类皮肤类型的细菌计数范围如下：正常皮肤，1.6-7.9×10⁴ CFU/cm²；油性皮肤，0.6-9.7×10⁴ CFU/cm²；干性皮肤，5.2-9.7×10⁴ CFU/cm²；混合性皮肤，2.3-10.0×10⁴ CFU/cm²。皮肤类型之间未观察到细菌计数的统计学显著差异，尽管油性、干性和混合性皮肤的细菌计数在数值上高于正常皮肤。先前的研究报道，皮肤细菌定植增加与恶化的皮肤状况相关[20]。因此，正常皮肤(被认为处于更平衡状态)与其他皮肤类型之间观察到的细菌计数的微小差异可能反映了皮肤状况的细微变化。

3.2. 不同皮肤类型皮肤微生物组组成的比较分析

从每位参与者鼻部皮肤收集的细菌中提取染色体DNA，并通过测序16S rRNA基因的V3-V4区域分析皮肤微生物组。各类皮肤类型的微生物组如图3所示。实验前，我们假设正常皮肤会表现出高相对丰度的表皮葡萄球菌和低相对丰度的痤疮丙酸杆菌。相比之下，其他皮肤类型预计会显示表皮葡萄球菌的较低丰度和痤疮丙酸杆菌的较高丰度。然而，结果不支持这一假设。图3显示，不同皮肤类型之间的表皮葡萄球菌(蓝色)和痤疮丙酸杆菌(橙色)的相对丰度无显著差异。为了进行更详细的比较，图4A、4B以箱线图形式展示了各类皮肤类型中表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的分布。随后，考虑了表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌之间的平衡作为可能有助于皮肤健康的因素(图4C)。在所有比较中，皮肤类型之间均未观察到显著差异。

先前比较健康皮肤与疾病状态(如特应性皮炎)的研究报道了关键共生类群(包括葡萄球菌属和痤疮丙酸杆菌属)的丰度存在显著差异，表明这些细菌的变化与病理状况密切相关[21,22]。相比之下，本研究仅关注临床上健康的皮肤，并进一步基于其生物物理特性将其细分为四类皮肤类型。在此框架内，表皮葡萄球菌或痤疮丙酸杆菌的相对丰度在各类皮肤类型之间差异不大。这些发现表明，虽然这些类群的变化可能作为疾病相关失调的有意义指标，但它们在区分健康皮肤内的生理变异方面可能效用有限。因此，健康个体之间皮肤类型的差异可能不是由单一细菌物种的优势决定，而是由群落结构、多样性的更细微变化或较少丰度类群的存在塑造的。

3.3. 皮肤微生物组多样性与皮肤类型的关系表征

使用多种α多样性指标评估皮肤类型(正常、油性、干性和混合性)对微生物多样性的影响(图5A-C)。

Chao1丰富度在皮肤类型之间总体存在显著差异(Kruskal-Wallis检验，p=0.028)。正常皮肤显示出该丰富度指标的最高中位数值；然而，成对比较未显示各组之间的统计学显著差异。相比之下，Shannon多样性指数在组间无显著差异(p=0.283)，表明总体群落均匀性在皮肤类型间可能相对稳定。由于Shannon指数反映了丰富度和均匀性，这一结果表明皮肤类型之间的差异不太可能是由均匀性变化强烈驱动的。值得注意的是，系统发育多样性(Faith's PD)在组间显示出显著差异(p=0.004)，成对比较表明混合性皮肤的多样性显著低于正常皮肤(p=0.022)和油性皮肤(p=0.042)。综合起来，这些结果表明皮肤微生物组在皮肤类型间的差异可能更多地反映在系统发育多样性上，而非物种丰富度或均匀性。虽然基于丰富度的指标表明正常皮肤的多样性倾向较高，但由于成对比较中缺乏统计学显著性，这些差异应谨慎解释。这种模式可能反映了由于亚组大小不平衡导致的统计功效有限。

先前关于特应性皮炎等皮肤病的研究报道，病变皮肤的微生物多样性低于健康对照皮肤，这与疾病状态中微生物失调的模式一致[23,24]。相比之下，本研究关注临床上健康个体内的变异，并表明生理皮肤类型之间的差异可能更为微妙，主要反映在群落结构而非优势类群或总体均匀性上。皮脂含量和水分水平等皮肤生物物理参数被认为是塑造微生物群落结构的关键环境因素，通过在皮肤表面创建不同的生态位[2]。先前研究表明，皮脂和水合水平的变异显著影响健康个体中皮肤微生物组的组成和多样性[25]。此外，最近的研究开始检查健康人群中微生物组组成与生理皮肤特征之间的关联，尽管此类研究仍然有限[26]。然而，大多数先前研究关注的是部位特异性差异，而非同质人群中生理皮肤类型之间的系统比较。这些发现表明微生物多样性可能与生理平衡的皮肤状况相关；然而，这些差异的功能意义仍有待阐明。此外，Chao1丰富度或检测到的分类单元数量等多样性指标的差异不一定转化为皮肤微生物组的功能或临床差异。重要的是，由于本研究基于横断面设计，这些关联不应被解释为因果关系的证据。目前尚不清楚较高的微生物多样性是否有助于平衡的皮肤状况，还是其结果。

为进一步探索这些差异是否与皮肤生物物理参数相关，我们进行了相关性分析。Spearman秩相关分析显示，皮肤水分与微生物丰富度(Chao1；ρ=0.397，p=0.008)和系统发育多样性(Faith's PD；ρ=0.362，p=0.017)呈正相关(图6A,B)。相比之下，皮脂水平与Chao1丰富度呈负相关(ρ=-0.312，p=0.041)，并与Faith's PD呈中度负相关(ρ=-0.455，p=0.002)(图6C,D)。水分或皮脂水平与Shannon多样性之间未观察到显著相关性(p>0.05)。

这些结果表明，微生物多样性可能主要与分类学丰富度和系统发育广度相关，而非总体群落均匀性。较高的水分水平可能与更广泛类群的共存相关，而升高的皮脂水平可能作为生态过滤器，有利于脂质适应谱系并减少系统发育多样性，而不会显著改变优势结构。

使用非加权UniFrac距离计算的β多样性，通过主坐标分析(PCoA)进行分析，揭示了皮肤类型间群落结构的差异(图7)。正常、油性和混合性皮肤类型显示出部分不同的细菌群落聚类模式。使用PERMANOVA进行的群落相似性成对比较表明，正常皮肤与油性皮肤以及正常皮肤与混合性皮肤之间存在显著差异，表明其微生物群落组成的相似性较低(p<0.05)。相比之下，正常皮肤与干性皮肤之间未观察到显著差异，这可能归因于相对较小的样本量。结合观察到的α多样性差异，这些β多样性模式表明正常皮肤栖息着与其他皮肤类型相对不同的微生物生态系统，这与先前报道的健康与疾病状态之间皮肤微生物群落结构变化一致[10,20]。

3.4. 基于线性判别分析效应大小(LEfSe)的皮肤类型相关微生物分类单元鉴定

由于优势类群的差异本身无法解释观察到的α和β多样性变化，我们接下来应用LEfSe来识别与正常皮肤相关的微生物类群(图8)。结果显示，在正常皮肤中富集了10个细菌属。在这10个细菌属中，有四个已被报道与皮肤状况相关，即乳杆菌属(Lactobacillus)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)和库克菌属(Kocuria)。乳杆菌属的成员已被报道与皮肤健康的有益效果相关，特别是通过应用细菌裂解物或发酵产物(后生元)[27,28]。几项研究表明，局部应用乳杆菌衍生产品(如细菌裂解物或发酵裂解物(后生元))可以改善皮肤屏障功能和健康[29,30]。玫瑰单胞菌属是皮肤定居细菌。在先前的研究中，从健康皮肤中分离的玫瑰单胞菌属应用于特应性皮炎患者，症状得到改善[31]。瘤胃球菌属是粘蛋白分解的肠道细菌。在患有特应性皮炎的小鼠中口服瘤胃球菌属已被报道可以改善其状况[32]。库克菌属的成员常见于正常皮肤微生物组中，与可能抑制炎症和病原体过度生长的皮肤环境相关，这与共生皮肤细菌可以帮助抵抗病原体定植的观察一致[33]。这些类群可能代表平衡皮肤生理的候选微生物标志物；然而，需要功能验证研究。

值得注意的是，尽管在LEfSe中未被识别为显著特征，但肠杆菌目(Enterobacterales)的成员在油性、干性和混合性皮肤类型中丰度较高。与正常皮肤相比，其相对丰度在油性皮肤中高13.7倍，干性皮肤中高14.8倍，混合性皮肤中高8.4倍。肠杆菌目通常是健康皮肤微生物组中低丰度或机会性成员。因此，它们在油性、干性和混合性皮肤类型中的相对丰度增加可能反映了与皮脂和水分失衡相关的皮肤微生物环境的细微变化。在某些皮肤病中已报道了类似的模式，其中微生物失调的特征是低丰度类群的变化[34,35]。非正常皮肤类型中肠杆菌目的富集可能反映了皮肤微环境的差异；然而，其与皮脂和水分失衡的任何关联仍然是推测性的，应被解释为一种假设。

与正常皮肤相关的观察到的皮肤微生物组差异可能受到水分和皮脂水平等生物物理因素的影响，这些因素已知会调节微生物定植和生长[2,36]。或者，正常皮肤中富集的特定细菌类群可能与皮肤稳态相关，可能通过机制如病原体的竞争排斥、局部免疫反应的调节或抗菌化合物的产生[6,22]。由于这些发现源于基于生物信息学的分析，因此需要进一步研究，包括从正常皮肤中分离和功能表征这些细菌属。总之，本研究的结果为阐明皮肤健康与皮肤微生物组之间的关系奠定了基础，并可能有助于识别有助于维持皮肤稳态的微生物因素。

4. 结论

在本研究中，使用16S rRNA基因扩增子测序技术调查了皮肤微生物组多样性与四种不同的健康皮肤类型(正常、油性、干性和混合性皮肤)之间的关系。微生物丰富度和系统发育多样性在正常皮肤中显著较高，正常皮肤通常被认为是四种类型中生理平衡状态更好的类型。相关性分析表明，皮肤水分与微生物丰富度和系统发育多样性呈正相关，而皮脂水平与系统发育多样性呈负相关。这些发现表明皮肤生物物理特性与皮肤微生物组的系统发育结构相关，并可能作为环境过滤器，在健康个体内塑造微生物群落组成。此外，该分析确定了主要与正常皮肤类型相关的细菌类群。未来的研究需要整合宏基因组学、培养和功能分析，以阐明这些类群在维持皮肤稳态中的生态和生理作用。

本研究有几个局限性，在解释发现时应予以考虑。队列相对较小且同质，仅包括窄年龄范围内的健康年轻女性，并且在有限的季节窗口内从单一解剖部位收集样本。由于鼻部区域具有特征性的皮脂特性，这些测量反映整个面部皮肤类型(特别是混合性皮肤)的程度可能有限。这些因素可能限制了研究结果向其他人群(包括不同年龄组、性别、种族背景和解剖部位)的推广性。饮食、激素状态和环境暴露等潜在混杂因素也未得到充分控制。此外，在样本收集过程中未包括基于棉签的阴性对照，这可能限制了对潜在环境污染的评估。尽管存在这些局限性，本研究为健康个体中生理皮肤类型的微生物组变异提供了新的见解，并突显了皮肤生物物理特性在塑造微生物群落结构中的作用。

作者贡献

概念化，R.K.；方法和数据收集，A.K.(Ayano Kondo)、A.M.、A.K.(Aoi Kuribayashi)、E.U.、H.T.和R.K.；软件和验证，A.K.(Ayano Kondo)、A.M.和R.K.；调查，A.K.(Ayano Kondo)、A.M.、A.K.(Aoi Kuribayashi)、E.U.和H.T.；数据收集和撰写—原始草稿准备，R.K.。所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。