前瞻性出生队列研究中的口腔健康评估 - 硒与微生态

摘要

背景

在出生队列研究中，需要进行稳健的口腔健康数据收集，以了解口腔微生物组与口腔健康及整体健康之间的关系。

目标

本文旨在描述参与关注微生物组发育的出生队列的幼儿口腔健康数据收集方法。通过此，我们旨在支持对微生物组数据变异的解释。

方法

阿姆斯特丹婴儿微生物组研究（Amsterdam Infant Microbiome Study，AIMS，n ≈ 500）是一项纵向前瞻性出生队列研究，评估从出生到三岁的儿童的微生物群、整体健康状况、人口统计学、（口腔）健康行为和饮食行为。口腔健康研究（Oral Health Study，OHS）是AIMS的一个子研究，评估儿童及其母亲的口腔健康状况。对母亲，收集牙周健康（临床附着丧失、牙龈出血）、口腔卫生（牙菌斑、牙石）和龋齿（DMFS）的数据。对儿童，收集龋齿患病率（国际龋齿检测和评估系统，ICDAS）和感染（pufa）、口腔卫生（牙菌斑、牙石）、阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）、口肌功能和苦味敏感度的数据。

结果

OHS的招募始于2022年10月，计划持续到2028年12月。截至2024年10月，已有64对母子被纳入研究。

结论

数据收集预计将于2028年1月完成。结果将在国际会议上分享，并通过同行评审的出版物发表。

引言

口腔健康是整体健康不可或缺的组成部分，口腔疾病是全球最常见的公共卫生问题之一[1]。龋齿和牙周炎与糖尿病、代谢性疾病和心血管疾病一样，是全球最常见的非传染性疾病[2]。已有研究证实口腔疾病与特定非传染性疾病严重程度之间存在关联[3]。最近的一项系统综述证实，包括刷牙和牙缝清洁在内的口腔卫生实践对降低2型糖尿病或高血压风险有积极影响，而牙周治疗已被证明可减少心血管风险生物标志物[4, 5]。在妊娠期间，牙周疾病可能加重胰岛素抵抗并促进妊娠糖尿病的发展[6]。由于儿童期口腔健康问题的不良后果可能延续至成年期，早期生命阶段的口腔健康问题对整个生命周期的健康构成重大威胁。据估计，全球46%的六岁以下儿童受龋齿影响，并且已知龋齿会对学校出勤率、教育表现以及生长发育产生负面影响[7,8,9]。

龋齿是一种复杂的多因素非传染性疾病，受多种生物、行为、心理社会和环境因素影响，这些因素已被广泛研究[10]。较少被探索的方面之一是味觉与龋齿的关系。有报道称苦味受体与严重的幼儿早期龋齿相关[11]。个体通过品尝检测苦味的能力称为苦味敏感度。对苦味物质的敏感性与喜食含糖食物相关[12]。具体而言，TAS2R38基因导致对苯硫脲（PTC）和6-n-丙基硫脲（PROP）等苦味化合物不敏感[12]，这些物质已被用于科学实验中识别苦味不敏感个体。除影响味觉偏好外，检测苦味物质的口腔味觉受体可能通过介导口腔宿主-微生物组相互作用影响龋齿[13]。TAS2R苦味受体家族参与对细菌的先天免疫反应，包括与龋齿相关的变形链球菌。具体而言，TAS2R14对变形链球菌分泌的群体感应分子作出反应，从而诱导快速先天免疫反应[14]。此外，口腔微生物群也被认为会影响风味感知[15]。然而，苦味敏感度对幼儿期饮食偏好的影响尚未完全理解，因为食物选择不仅基于对特定味觉模块的敏感性，还受其他因素影响，如父母或照料者对特定食物的暴露、嗅觉刺激、食物颜色和质地以及进食行为方面[16,17,18]。

另一个研究不足的方面是口面肌功能发育在龋齿中的作用。如口呼吸、舌推、吮指和反向吞咽等习惯可能影响颌骨发育，并与口面生长异常和多种口腔健康问题（如龋齿和牙龈炎）相关[19, 20]。颌面结构的大部分生长发生在生命最初4年和青春期[21]。然而，据我们所知，目前尚无针对幼儿的纵向研究评估肌功能口腔习惯与口腔健康结果之间的关系。

口腔健康通常被孤立处理，而越来越多的共识认为口腔健康对整体健康有影响，应作为整体健康的组成部分来对待[22]。在儿童中，龋齿和超重呈相关性，而早期体重增加不仅预示着超重，还加速乳牙萌出和增加龋齿风险[23, 24]。此外，口腔微生物群组成与婴儿快速体重增加相关[25]。

为了解从儿童期开始的非传染性疾病病因和进程中涉及的生物过程，已启动多项纵向出生队列研究。这类研究适用于阐明早期生命发展与非传染性疾病之间的联系，或理解口腔微生物组与（口腔）健康之间的关系。例如，一项多学科前瞻性队列研究——阿姆斯特丹婴儿微生物组研究（AIMS）（www.aimsonderzoek.nl）——已由荷兰阿姆斯特丹公共卫生服务（GGD）启动，旨在了解生命最初三年内微生物群与健康之间的相互作用。

在大多数关注肠道和口腔微生物组的队列研究中，口腔健康数据的收集要么不包括在内，要么以限制早期龋齿检测的方式进行[26, 27]，或包括可能影响微生物组的口腔因素的自我报告[28, 29]。在AIMS的一个子队列（称为口腔健康研究，OHS）中，正在收集口腔健康相关数据。OHS的目的是从生物学角度支持对微生物组数据的解释。

本文旨在描述参与关注微生物组发育的出生队列的幼儿口腔健康数据收集方法。通过此，我们旨在支持对微生物组数据变异的解释。

方法

本文描述了如何收集参与纵向出生队列的幼儿及其母亲的口腔健康数据。所收集的口腔健康数据将与相关研究中收集的参数结合使用。组合数据的分析不属于本文内容，将另行完成。

口腔健康研究在其他研究中的嵌入

OHS是阿姆斯特丹婴儿微生物组研究（AIMS）（

图1

OHS在大规模纵向队列研究中的嵌入。

伦理考量与招募

OHS的研究方案已获得阿姆斯特丹医疗中心医学伦理委员会（NL64399.018.17，2022年6月15日）的批准，作为AIMS研究方案的修正案。由于OHS的观察性质，参考并适当使用了STROBE指南。OHS已在开放科学框架库（OSF）（

儿童的临床口腔检查

在儿童的临床口腔检查中，收集有关口腔卫生、口腔健康、口肌功能和苦味敏感度的参数。所有儿童的口内检查都在陪同人员坐在牙科椅上、孩子坐在陪同人员腿上的情况下进行。如果孩子不愿意坐在牙科椅上，孩子可以躺在换尿布垫上，或在陪同人员和检查者的膝对膝位置上。首先，使用Quigley和Hein指数评估牙菌斑量，并使用简化牙石指数（CI-S）[30,31,32]评估牙石量。所有六个牙面的覆盖表面以及龈上牙石量按4分制评分（0 = 无牙石；3 = 龈上牙石覆盖超过三分之二的暴露牙面，或连续的重度龈下牙石，或两者兼有）。接下来，根据WHO口腔健康调查基本方法和国际龋齿检测和评估系统（ICDAS）[33, 34]对龋齿的存在进行评分。简言之，牙齿由检查者用牙刷清洁，并用纱布干燥，然后使用球头探针和口内镜检查牙齿，记录ICDAS评分（2-6）。从这些数据中，将计算早期龋坏阶段（ICDAS评分2）、已确立龋坏（ICDAS评分3或更高）、缺失面（m）和充填面（f）的牙齿和牙面数量作为dmft/s指数。在第二次就诊时（当孩子约3岁时），除上述内容外，还收集有关龋齿相关口腔感染、口肌功能、牙齿位置和阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）风险的测量数据。在ICDAS评分后，使用Pufa指数测量严重龋齿导致的牙髓受累、溃疡、瘘管和脓肿等口腔感染[35]。通过询问陪同家长有关副功能口腔行为（磨牙、吮指或吮手指、使用奶嘴、口呼吸）并由检查者检查（口呼吸行为、吞咽模式、高拱腭和错颌畸形如反颌、拥挤、开颌和深覆颌）来评估口肌功能。接下来，根据OSA-5筛查问卷（附录A），请家长回答五个问题，以筛查有OSA（阻塞性睡眠呼吸暂停）风险的儿童[36]。

苦味敏感度

科学文献中已描述并使用了多种检测苦味敏感度的方法（附录B）。由于儿童对味质的安全担忧（PTC，PROP[37]）或参与者可能反对进行基因分析，并非每种方法都可行，因此在OHS中，使用了先前描述的方法[15, 38, 39]，该方法结合了味质摄入和基于摄入量和面部表情评估敏感度。

苦味刺激物是瓶装水中0.18 M浓度的尿素，呈现的体积限制在15 mL。向儿童呈现四杯固定序列（水-味质-水-味质）。为确定摄入量，每杯在消费前后称重。对于每种味道，分析仅限于在序列中从两个杯子消耗至少1.0 g的婴儿。通过检查者使用从"强烈拒绝"（评分1）到"强烈接受"（评分5）的五分制，根据婴儿的味觉-面部和鼻-面部反射评估儿童对刺激物的喜好[40]。对婴儿的研究确定，对味道的面部反应是天生的，并且在成年后基本保持不变[41,42,43]。例如，如果孩子皱眉、推开杯子并停止饮用，检查者标记"1"（强烈拒绝），而如果孩子微笑、面部放松并饮用杯中的液体，检查者标记"5"（强烈接受）。

母亲的临床口腔检查

如果母亲同意参与研究，则在孩子检查的同时对其口腔健康状况进行临床检查。母亲的口内检查在参与者躺在牙科椅上的情况下进行。根据WHO口腔健康调查基本方法评估口腔健康状况，包括牙齿状况和牙周健康。对于牙齿状况，每颗牙齿的每个表面（第三磨牙除外）评分如下：0：健康；1：龋齿；2：有龋齿的充填；3：无龋齿的充填；4：因龋齿缺失；5：因其他原因缺失；6：缺失牙齿的固定修复；或7：其他原因的修复（贴面、牙冠、创伤）[33]。从这些数据中，将计算已确立龋坏（D）、缺失面（M）和充填面（F）的牙齿和牙面数量（DMFT/DMFS指数）。龋齿（牙齿腐烂）定义为ICDAS评分3或更高。牙周健康和口腔卫生测量包括探诊时牙龈出血、牙石量和牙菌斑、牙周袋深度和临床附着丧失，记录在十个指数牙齿（17、16、11、26、27、31、36、37、46和47）上[44]。首先，牙齿干燥，然后使用Quigley和Hein指数评估牙菌斑量，并评估龈上牙石的存在/缺失[30, 31]。接下来，使用Williams牙周探针测量从釉牙骨质界开始的袋深度和牙龈附着水平（mm）。临床附着丧失（CAL）基于这些测量计算。探诊出血（BOP）根据社区牙周指数（CPI修改版；条件存在/缺失）评分[33]。

ICDAS检查员培训

临床检查员（A.M.K.）接受了临床龋齿检测的校准。通过与高级检查员（C.M.V.）的两次步骤确定了检查员间的可靠性。首先，评估了十五张彩色照片，然后评估了三名1.5至3岁儿童。通过至少间隔一周对210个表面的评估确定了检查员内的可靠性。检查员间的可靠性将每年重新校准一次。在研究过程中招募了额外的检查员，并将相应进行校准。

校准

ICDAS的检查员内可靠性为0.97（2023年2月）。第一次校准会议（2023年10月）的检查员间可靠性为0.93（用于彩色照片评估）和1.0（用于临床评估）。年度校准目前正在进行中，彩色照片评估计划进行，临床评估已完成（κ = 0.87）。

研究终点

OHS的主要终点将是口腔健康，由儿童龋齿的患病率和严重程度以及母亲的龋齿患病率和牙周健康（如临床附着丧失、探诊出血）确定。次要终点将是副功能口腔行为、OSA风险和苦味敏感度。这些数据将与AIMS在妊娠期间和出生后头三年收集的数据结合使用，包括口腔和肠道微生物群、（口腔）健康行为、饮食行为、社会人口统计学、父母（口腔）健康以及儿童生长轨迹。

统计

本文代表了作为更大观察性研究一部分的口腔健康数据收集的考虑。OHS中收集的口腔健康数据的分析将与AIMS中收集的数据结合使用。分析方法仍在进行中，因此将另行描述。上述口腔健康数据的记录如下。首先，BOP百分比通过将出血部位数除以总部位数并乘以100计算。斑块评分（%）相应计算。副功能口腔行为、苦味敏感度（品尝者vs.非品尝者）和OSA风险（高风险vs.低风险）将在名义水平上记录。

结果

第一批母子对在2022年10月被纳入研究。由于AIMS队列（n = 498）的孕妇招募在2024年11月完成，OHS的招募预计将持续到2028年12月。在OHS的前1.5年招募期（2022年10月至2024年2月），招募率为27%。为提高招募率，AIMS团队在作为AIMS研究一部分的面对面访问中向AIMS参与者介绍了OHS，并在分发给AIMS参与者的新闻通讯中添加了有关研究的信息。在随后的时期（2024年3月至2024年9月），招募率提高到37%，总共纳入了64对母子对。为进一步提高招募率的下一步措施是，通过定期在AIMS参与者中分发的新闻通讯向AIMS参与者通报OHS的进展情况。预计数据收集将于2028年1月完成。

校准

讨论

在本文中，我们描述了作为新生儿家庭更大观察性研究一部分的口腔健康数据收集的考虑，该研究在孩子生命的头三年内检查孩子的口腔健康，如果同意参与，还包括其母亲。所描述的口腔健康评估（OHS）是纵向队列研究（AIMS）的一部分。OHS中收集的口腔健康数据将与AIMS队列中收集的微生物群、生长轨迹和关于（健康）行为、饮食行为、（父母）健康状况和社会人口统计学的问卷数据结合使用。分析方法仍在进行中，因此将另行描述。据我们所知，这是第一个关于微生物、行为、人口统计和父母健康因素与口腔疾病和肥胖发展之间关系的纵向前瞻性出生队列研究。

微生物获取和建立的纵向研究需要广泛的数据收集。失访可能会由于研究的纵向性质而减少完成研究的参与者数量。为限制失访，仅纳入在招募时计划不搬离阿姆斯特丹的参与者。另一个潜在限制可能是选择偏倚，因为遵守此类研究方案需要参与者的时间和精力。尽管已采取许多措施使参与本研究尽可能容易（例如，在家中收集样本），但遵守AIMS方案，包括OHS，仍需要参与者长期投入。举几个挑战，参与AIMS需要良好的规划技能，因为生物样本需要以特定方式收集和存储，并在特定时间段内完成。此外，在婴儿生命的第一年，数据收集频率很高，共有7个测量点。在AIMS中，这可能导致选择偏倚。特别是对于OHS，如果父母因牙科焦虑而拒绝参与，则可能发生选择偏倚，据报道，荷兰人口中有24%至40%存在牙科焦虑[45, 46]。较高的牙科焦虑水平与较差的口腔卫生习惯相关[45]。由于临床收集口腔健康数据所用设备影响数据质量，我们发现除牙科诊所外的其他场所进行数据收集并不理想，尽管这可能增加特定患者群体的参与度。为鼓励参与并限制父母牙科焦虑的影响，研究方案允许仅让孩子参与。

先前已使用多种龋齿存在和严重程度评估方法，从使用WHO标准在龋洞水平进行龋齿检测，到使用ICDAS标准检测非龋洞病变[47, 48]。不同指数的使用使不同研究结果的比较变得复杂；然而，在先前研究中，据报道，当截断点设为ICDAS-3（龋洞病变）时，使用ICDAS-II的检查与WHO标准相当[49]。由于纳入非龋洞病变显然会增加发现的龋齿病变数量，因此使用ICDAS评分系统可能更敏感地检测关联，这使得能够跟踪检测到的非龋洞病变的脱矿和再矿化。因此，ICDAS评分被认为是识别该人群中儿童龋齿的最合适方法。

虽然牙医临床检查是龋齿评估的金标准，但作为一种替代方案，已提出通过训练有素的牙医进行口内照片收集和龋齿评分作为实用替代方案。这种方法在纵向出生队列研究中使用，并显示出良好的观察者间可靠性（0.72–0.80）以及良好的敏感性（85.5%）和特异性（83.6%）[26, 50]。这种方法的潜在缺点可能是与临床视觉检查相比，龋齿检测仅限于可见表面，并且需要高质量的照片，因此需要研究参与者的配合。作者描述，在8,305名六岁儿童中，有1,003名参与者因照片质量不足而被排除[26]。此外，在152例中无法拍摄牙科照片，在208例中仅收集了正面照片，排除了前磨牙和磨牙区域的龋齿检测[26]。将此方法应用于18和36个月大的幼儿将不可行，因为他们的年龄较小，并且认为临床检查仍是幼儿龋齿评估的首选方法。这种方法的潜在限制是龋齿仅评估到三岁。由于龋齿的发生和进展是一个过程，在龋齿临床可见之前需要几个月时间，因此在建议的长度内，预期龋齿发病率将有限。然而，终点时样本中较低的龋齿率不会阻碍我们了解与口腔健康相关的口腔微生物组获取和维持的目标。然而，为了研究旨在比较活跃龋齿和无龋齿儿童的研究问题，当前方法可以通过在更晚年龄添加龋齿评估进行调整。

我们的研究是少数在获得同意的情况下对幼儿和母亲的口腔健康进行临床评估的出生队列研究之一。特别是在生命最初几年，家庭在儿童口腔健康相关行为的启动和维持中起着根本作用。与母亲龋齿经历较低的儿童相比，2至3岁儿童中母亲龋齿经历较高的儿童患早期儿童龋齿的风险更大[47]。母亲-儿童对的联合临床口腔健康数据使我们能够纵向研究这一关键时期的代际口腔健康行为和龋齿。所描述方法的一个限制是未收集共同父母的临床口腔健康数据。因此，共同父母在儿童口腔健康和口腔健康行为中的作用仍未得到充分探索。未来工作可考虑纳入共同父母。

除了儿童和母亲口腔健康外，OHS还评估了先前出生队列研究中未作为龋齿发展潜在风险因素评估的肌功能习惯。我们预计，从肌功能评估中获得的数据将为习惯（如口呼吸和吮指）与口腔健康之间的关系提供有价值的见解。在一项针对7-14岁儿童的研究中，发现口呼吸儿童的口腔、鼻腔和咽部微生物群与鼻呼吸儿童不同[51]。可能，张口姿势会导致口腔干燥，因为唾液容易从口腔蒸发。这阻碍了唾液的机械清洁，导致食物残渣和牙菌斑积累增加，促进耐酸和产酸口腔微生物群，从而增加龋齿风险。在成年人中，已证明与睡眠时鼻呼吸相比，睡眠时口呼吸期间口腔内pH值降低并在更长时间内保持较低，这可能是龋齿的风险因素[52]。

其次，与其他先前的出生队列研究不同，OHS评估了幼儿的苦味敏感度与口腔健康和超重的关系。对苦味物质的低敏感性与较高的苦味食物摄入量相关，包括蔬菜等健康食物，而与苦味感觉相关的基因变异已与严重的幼儿早期龋齿和龈上菌斑组成相关[53,54,55]。虽然基因检测可以确定对苦味的敏感性，但由于参与者可能的担忧，这未包含在AIMS中。OHS中使用的临床苦味测试的一个限制是，与基因检测相比，它需要参与者接受额外的程序。本文描述的味觉敏感性方法是苦味敏感度评估的几种现有方法之一[25]。由于对幼儿的评估基于非语言因素，我们选择了摄入方法，因为它涉及儿童熟悉的研学方法（啜饮）。本文提出的涉及面部表情评估的方法已在先前研究中得到验证，并在多项研究中使用。尽管如此，所收集数据的质量可能会受到检查员经验的影响。为解决此问题，两名检查员之间对面部表情进行了校准。提高此方法可重复性的方法可能是使用视频记录，使检查员能够多次观看面部表情。另一个建议可能是更标准化地对面部表情进行评分，例如，通过与面部动作编码系统保持一致[56, 57]。

总之，OHS子队列的结果将允许将口腔健康参数与AIMS队列中获得的口腔和肠道微生物群、（口腔）健康行为、饮食行为、社会人口统计学、父母（口腔）健康以及儿童生长轨迹联系起来，从而提供关于生命最初三年内这些因素之间相互作用的宝贵见解。