Highlights（亮点）
- 基于琼脂糖的384孔板球体支持可扩展的癌症药物筛选。
- 结直肠癌和视网膜母细胞瘤球体显示出模型特异性的药物反应。
- 高内涵成像捕获活细胞/死细胞平衡和球体形态。
- 紧凑型球体比松散聚集体提供更强的筛选指标。
- 3D筛选通过常规2D检测完善了候选药物选择。
摘要
癌症病例数量不断增加，治疗失败情况普遍，这凸显了对替代疗法和更具预测性的筛选方法的需求。在此背景下，3D培养领域（称为球体、类器官或肿瘤类器官模型）近年来发展迅速，产生了比标准2D培养方法更具生理相关性的多种模型。然而，由于其复杂的设置、维护要求和高成本，许多这些模型在药物发现中的可扩展性受到限制。作为回应，我们为两种不同类型的实体瘤（结直肠癌和视网膜母细胞瘤）提出了一种简单但稳健的球体模型，特别设计用于高通量药物筛选。该模型可重复且成本效益高，利用商用组件和自动化技术。我们将该模型应用于化疗药物筛选，并使用高内涵图像分析来识别潜在的候选药物。这种球体模型有潜力推进药物发现，特别是在癌症研究中具有挑战性的领域。
关键词
视网膜母细胞瘤、结直肠癌、球体、高通量筛选、药物发现
1. 引言
2023年，美国食品药品监督管理局（FDA）现代化法案2.0的实施标志着药物发现流程的重大转变。通过接纳替代性临床前模型，该法案减少了对动物实验的依赖，解决了动物模型与人类之间固有的物种差异问题，这些差异对药理基因组学具有重要意义。人们普遍认为，体外3D肿瘤模型（通常称为球体、类器官或肿瘤类器官）是一种突破，有助于在比传统细胞培养更接近真实肿瘤的环境中评估抗癌药物和纳米药物。它们的关键特征，包括空间组织、复杂的细胞间和细胞-细胞外基质相互作用、扩散梯度、复杂的细胞信号传导、药物抗性和代谢适应，比2D培养更接近临床情况。3D球体在阐明时空药物分布方面起着关键作用，并提供比传统2D培养更有见地的终点。3D肿瘤模型在尺寸、培养持续时间和实验设置方面的适应性，使其可以针对特定应用进行设计。生成球体、类器官或肿瘤类器官模型的方法多种多样，从优化培养条件（如培养基成分、基质材料、培养皿材料和形状）的无支架方法，到包括生物反应器、基于支架的系统、基于水凝胶的方法、生物打印、微流控和器官芯片技术在内的先进技术。然而，球体的生成通常需要复杂的设置，以便标准化和控制多个重复和批次的生产。与2D培养相比，更高的批次间和可重复性异质性、定量评估和标准化的困难，以及有时的可扩展性问题和高成本，仍然是高效药物筛选过程面临的挑战。
结直肠癌（CRC）在2022年成为第三大最常见和第二大致命癌症。主要与年龄增长和男性性别相关，其在发展中国家的发病率明显更高。结直肠癌的异质性需要量身定制的治疗策略，从而强烈需要研究针对肿瘤发生和发展关键通路的治疗药物。尽管人们对结直肠癌的分子机制有了很多了解，但需要进一步深入研究，以将这些知识转化为更好的患者护理。虽然早期结直肠癌通常可以通过手术成功治疗，无论是否辅以辅助化疗，但晚期和转移则构成了严峻的临床挑战。全身化疗仍然是延长患者生存期的一线治疗方法。尽管有效，但常用的化疗药物主要作为DNA损伤剂发挥作用，影响所有快速分裂的细胞，导致显著的毒性并限制其长期使用。此外，结直肠癌细胞对化疗产生耐药性，需要探索替代治疗途径。靶向疗法（如VEGF抑制剂）和免疫疗法的引入标志着结直肠癌治疗的重大进展。然而，一部分肿瘤对这些新治疗方法表现出耐药性，突显了应对结直肠癌多样化挑战的持续复杂性和进一步进步的需要。
视网膜母细胞瘤（Rb）是一种儿童早期癌症，早期诊断和当代疗法能够实现高生存率。创新的局部药物递送技术，如动脉内、玻璃体内和前房内化疗，已经彻底改变了治疗，提高了保守治疗的成功率，同时最小化全身暴露。尽管取得了这些进展，目前视网膜母细胞瘤的药物库仍限于从其他儿科恶性肿瘤中经验选择的化疗药物。因此，摘除眼球通常仍然是对耐药或复发肿瘤的唯一可行治疗选择。鉴于将新治疗方法整合到儿科疾病临床实践中的挑战，在进行首次人体试验之前进行全面表征至关重要。将药物再利用作为策略能够为新适应症引入已批准的治疗方法，最终提高成功结果的潜力。为了简化这一过程，需要能够准确预测治疗反应的临床前模型。
尽管结直肠癌（CRC）和视网膜母细胞瘤（Rb）在发病率和临床病程上有所不同，但两者都体现了药物耐药性和有限治疗选择阻碍长期结果的癌症。这使它们成为评估标准化球体模型是否能提供临床相关见解并加速药物再利用努力的理想测试案例。
在此，我们介绍了一种简单而有效的球体模型，通过3D细胞聚集培养方法生成各种身份的肿瘤球体。简化协议已优化用于球体创建、处理、数据收集和分析，非常适合高通量药物筛选。概念验证药物筛选研究证实了半自动化球体模型的有效性，确定了针对Rb和CRC的有希望的候选药物，这两种代表性恶性肿瘤的高效治疗策略开发尤其具有挑战性。
2. 结果
在这项研究中，我们选择了一种无支架、基于聚合物琼脂糖的低细胞粘附方法，以诱导细胞在培养中形成3D聚集，进入凹形琼脂糖微孔，形成球体。为了实现这一目标，使用预热的自动分配器以最高速度将琼脂糖熔融溶液分配到384孔板的孔中，表面张力自然在每个孔中创建了一个凹形中央"单个子孔"腔室（图1A）。一旦琼脂糖固化，细胞以类似方式分配，在30分钟沉降后，它们开始向孔中心聚集。球体的形成是时间依赖性的：通过显微镜观察，4天大的球体似乎比3天大的球体形成更致密的结构，特别是在Rb球体中。球体的形态在不同细胞系之间有所不同，人结肠癌上皮细胞系HCT116衍生的球体表现出最明确的球形形状和最长的培养时间（补充图S1A-C）。这种方法允许在384孔板级别生成一系列球体，大小和形状均匀（补充图S1D）。培养4天后，再进行3天药物暴露，球体显示出高水平的细胞死亡，即使在载体（DMSO）条件下也是如此，这对药物筛选是一个挑战，这是由于营养渗透受限导致球体核心逐渐坏死。这种系统性基线细胞死亡是模型的固有特征，而不是实验伪影。尽管它可能影响细胞毒性解释和化合物功效，但其影响通过使用时间匹配对照归一化得到有效控制。为了在整个协议期间为球体充分供应营养，并避免使用灌注室或微流控设备的繁琐操作，我们实施了新鲜培养基补充步骤。两个用于吸出旧培养基和分配新鲜培养基的蠕动泵设置为最低速度（比真空泵速度低），并将泵针放置在每个孔的角落，以最小化在培养基交换过程中吸出球体和损坏琼脂糖涂层的风险（补充图S1D）。对于球体处理，将96孔板中的储备药物通过象限转移到384孔板中，生成每个条件的四个重复。药物暴露72小时后，用Calcein-AM（CalAM）标记球体以检测活细胞，用Ethidium homodimer-1（EthD-1）识别死细胞，用Hoechst染色所有细胞核，并使用自动化高通量荧光显微镜对板进行成像。通过CellProfiler、Knime和Python软件中的半自动管道，执行球体的图像堆栈重建和最大投影图像、包括但不限于荧光强度、大小、面积和完整性的各种特征的量化，以及药物反应的计算（图1B）。DMSO（本研究中所有药物使用的溶剂）和已知能快速诱导程序性细胞死亡的藤黄酸（gambogic acid）分别用作筛选中的阴性和阳性对照（图1C）。阴性和阳性对照之间死细胞（EthD-1）和活细胞（CalAM）的相对强度比提供了良好的筛选窗口，Z'因子分别为0.57（HCT116，人结直肠癌细胞系）、0.53（Y79，人视网膜母细胞瘤细胞系）和0.13（WERI-Rb1，人视网膜母细胞瘤细胞系）（图1D）。在测试的模型中，CRC球体表现出最高的形态紧凑性，而WERI-Rb1衍生的球体则显示出更松散的组织结构。这种松散形态在其他WERI-Rb1衍生的体外模型中一致观察到。化疗处理后球体形态的代表性图像显示在图1E中。作为比较，我们还使用相同方法测试了其他生物模型。例如，Panc-1和A549细胞分别是人胰腺癌和人肺腺癌的经典模型，在球体和异种移植试验中广泛使用。在我们的培养条件下，它们似乎同样形成组织良好的球体，表现出特定于每个模型的固有细胞死亡率，并对药物处理表现出敏感性（补充图S1E和S1F）。
为验证球体模型，我们使用各种读数在一组肿瘤模型上进行了概念验证药物筛选：标准CRC细胞系（HCT116）、CRC患者衍生的类器官和RB细胞系（Y79和WERI-Rb 1）（补充图S2）。为CRC筛选的80种药物是根据更新的临床反馈选择的，包括已证明的有效性、治疗益处、良好的安全性、监管纳入和信息数据，因此包括FDA批准的或处于临床试验阶段的药物。为Rb筛选的38种药物采用类似方法选择，即FDA批准的具有儿科肿瘤适应症或历史的药物（补充表S2-3）。
在球体中评估药物性能，并将CRC和Rb模型的性能与它们的2D对应物进行比较（图2A-B），基于从自动化高内涵分析中提取的80个特征。在CRC 2D模型中，还使用各种读数评估了药物性能（图2A和补充图S3），即使用Presto-Blue代谢试剂的标准活力测定，基于数字全息显微镜的定量相位成像，提取量化汇合和相位偏移（OPD，光程差）值作为毒性读数，基于细胞核荧光染色的细胞自动计数，以及基于CalceinAM和Ethidium homodimer-1染色的荧光活/死比例。所有读数对80种测试药物显示出非常相似的结果，每对读数的平均皮尔逊相关系数为0.53（范围为0.32-0.71）。最低相关性对应于患者衍生细胞培养与单球体之间的结果，表明患者衍生细胞总体上比已建立的细胞系更具可塑性和敏感性，从而由于药物特异性反应而降低皮尔逊相关性（补充图S3G）。药物性能跨模型和读数显示，在80种测试化合物中，有20至55种被统计上确定为验证命中。此分类基于标准筛选标准，定义为与DMSO对照相比差异大于3个标准差，当考虑单个单参数读数（即PrestoBlue、汇合、OPD、细胞计数或荧光比例）时。多参数分析的层次聚类显示了对特定药物的类似反应模式，这解释了总体高相关性。例如，标准非特异性药物如微管靶向药物紫杉醇、长春地辛或鬼臼毒素表现出这种情况，而选择性激酶抑制剂则对任何模型都无活性，即pilaralisib、凡德他尼或defactinib（图2A）。
2D测定在Y79和WERI-Rb1细胞中产生可比的命中率（分别为22和21个命中；图2B），而在3D测定中则观察到明显差异。在Y79球体中，活性化合物数量减少到15，表明筛选窗口更窄且更具选择性。相比之下，WERI-Rb1球体产生了30个命中，与它们松散的结构和有限的过滤能力一致。这种差异反映了固有的细胞形态差异——WERI-Rb1细胞在单文件悬浮液中生长并形成脆弱的球体，而Y79细胞则在紧凑的聚集体中簇集，能更好地区分药物活性。层次聚类证实，除了Rb的已建立药物（如DNA损伤药物依托泊苷和替尼泊苷以及泛微管抑制剂长春新碱、长春瑞滨和长春碱）之外，具有不同机制的化合物，包括酪氨酸激酶抑制剂（entrectinib和crizotinib），在两个模型中也具有活性。在14个跨模型命中中，crizotinib、entrectinib和长春瑞滨在Y79和WERI-Rb1衍生的球体中均实现了完全和完全的细胞毒性，证明了它们在3D球体中的功效（补充图S4）。半抑制浓度在微摩尔范围内：crizotinib（Y79衍生球体中为15.4 μM，WERI-Rb1衍生球体中为22.1 μM）和entrectinib（Y79衍生球体中为28.8 μM，WERI-Rb1衍生球体中为30.4 μM）。然而，这种细胞毒性与视网膜色素上皮细胞的选择性无关，表明治疗窗口有限（补充图S5和补充表S1）。尽管如此，此类化合物为进一步开发提供了基础，其中配方策略或新一代抑制剂可能增强安全性并超越当前护理标准的转化潜力。筛选在所有模型中均可重复，皮尔逊相关系数分别为HTC-116球体0.97、Y79球体0.92和WERI-Rb1球体0.61（图2C）。为了评估这些命中在更复杂的血管化环境中是否也显示出可测量的活性，我们进一步在鸡胚尿囊膜（in ovo CAM）模型中检查了crizotinib和entrectinib。组织化学分析证实，Y79-GFP细胞在CAM内层形成实心肿瘤团块，GFP和Ki-67共定位验证了肿瘤身份，并检测到Ki-67阳性细胞位于主团块之外，表明活跃迁移。在这一经过验证的系统中，crizotinib对GFP定义的肿瘤面积和Ki-67阳性区域产生了轻微减少，而entrectinib则显示出较弱和更异质的效果（补充图S6）。胚胎间的变异可能反映了局部应用化合物的不均匀扩散。鉴于上述crizotinib和entrectinib的选择性有限，需要进一步研究以验证其转化潜力。总之，这些结果表明，从3D球体筛选中脱颖而出的命中在更先进的in ovo模型中仍保持活性，支持视网膜母细胞瘤模型级联中一致的活性谱。
然后，使用t分布随机邻居嵌入（t-SNE）将筛选的多参数结果投影到二维图上（图3），允许直接比较不同模型上的聚类活性化合物。CRC模型的结果表明，标准2D培养物主要强调"经典"毒性药物（即长春地辛、鬼臼毒素、衣霉素G）或一些全局靶向抑制剂（即volasertib，一种阻断细胞分裂的PLK-1抑制剂或ganetespib，一种HSP-90抑制剂）（图3A），而基于3D的培养模型则额外识别了其他活性化合物聚类，具有更具体的模式或靶点（即一系列酪氨酸激酶抑制剂，包括foretinib和regorafenib）（图3B，补充图S7B-D）。值得注意的是，球体培养物几乎获得了相同的结果，无论是单个还是阵列球体（补充图S3）。此外，CRC阵列类器官模型为活性药物提供了另一层特异性，如预期的那样，有一系列EGFR和VEGFR抑制剂（即凡德他尼，一种EGFR依赖性细胞增殖和存活的抑制剂）（补充图S7D）。
在Y79模型中，2D培养物的t-SNE映射显示活性药物广泛分布在不相关的类别中，从核苷类似物和抗叶酸剂到拓扑异构酶和激酶抑制剂（图3C）。在3D Y79球体中，活性集缩小为一个更连贯的聚类，主要由长春碱和激酶抑制剂主导（图3D）。在WERI-Rb1中观察到类似模式，2D培养物显示经典细胞毒性和靶向药物的广泛范围（图3E），而3D球体则产生更受限但较松散的活性化合物选择（图3F）。
3. 讨论
与常规2D细胞培养相比，在患者衍生的类器官上进行的每种化合物筛选成本平均高4-10倍。这种差异主要取决于专门培养基的必要性，包括生长因子和昂贵的支架（如Matrigel®），与标准培养基和廉价的一次性塑料器皿相比。与2D培养相比，类器官的有限可扩展性与标准2D细胞培养更容易的自动化和批量处理可能性相比，也增加了成本。然而，与2D培养相比，类器官具有优势，因为它们对患者间变异的响应性更高，而培养细胞的一致单层则显得一致。在生物相关性方面，2D培养由于缺乏组织架构而被认为预测性较低，相比之下，更生理相关的类器官模拟了肿瘤异质性和微环境。
在此背景下，本文介绍的标准化球体模型为不同类型癌症的药物筛选提供了一个简单、可重复和可扩展的平台，可以被视为介于简单标准2D细胞培养和复杂类器官结构之间的中间体。使用此方法进行的筛选相对成本仅略高于标准2D细胞培养（高1.5-2倍，取决于协议自动化的程度），因此仍远低于所有更昂贵的类器官方法的范围。通过对结直肠癌和视网膜母细胞瘤应用相同协议，我们证明了该模型对常见和罕见疾病的适用性，从而强调了其通过改进与筛选成本相关的预测能力来优化药物发现工作的潜力。
在CRC中，球体模型产生了与更复杂类器官系统获得的药物反应模式相当的结果，表明可以从简化培养中提取可靠信息。在Rb中，该模型实现了对形态-反应关系的更深入探索，说明了球体如何在患者衍生材料有限的罕见儿科癌症中构建发现工作流程。总之，这些结果将球体模型定位为传统2D测定和复杂类器官系统之间的一个实用桥梁，提供可扩展性、可重复性和适合临床前药物发现工作流程的筛选窗口。
球体模型已在有限数量的细胞系上测试，需要在更大范围的细胞模型上评估其性能，以得出关于其普遍适用性和肿瘤学预测能力的结论。球体形态在不同细胞系之间有所变化，并与其2D生长特性相关：HCT-116贴壁单层产生密集包装、高度球形的球体，而悬浮Y79和WERI-Rb1细胞产生更松散、更脆弱的结构。这种形态与其他3D模型（如基于支架的肿瘤类器官）一致，其中WERI-Rb1表现出类似松散的结构和较低的药物筛选指标（Z'因子）。其他3D系统也报告相对较低的Z'因子，通常在同一平台上的细胞系依赖性。我们表明，引入额外步骤（如培养基交换）可改善球体活力，从而提高测定性能。因此，球体模型可能需要根据细胞系进行协议优化。我们还强调，在所有步骤中绝对需要轻柔处理，以促进形成并最小化球体解体。需要进一步分析以确定导致较弱筛选指标的确切因素，例如可能混淆化合物特异性效应的自发细胞死亡。
总之，球体模型是一种简化的3D系统，可以在各种细胞系上优化，并在药物筛选工作流程中提供命中质量、时间和成本之间的平衡权衡。
4. 方法
4.1 细胞培养
人结肠癌细胞系HCT116、人视网膜母细胞瘤细胞系Y79和WERI-Rb1、人视网膜色素上皮细胞系RPE-1、人胰腺导管癌细胞系Panc-1和人肺癌细胞系A549均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。HCT116细胞在McCoy5a培养基（McCoy5a，含GlutaMAX；货号36600-021，Gibco Life Technologies）中培养，补充10%热灭活胎牛血清（FBS；货号10101-145，Invitrogen）。HCT116细胞使用胰蛋白酶-EDTA（0.05%；货号25300062，Life Technologies）每周传代2-3次。Y79和WERI-Rb1细胞在完全Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI 1640；货号61870-010，Gibco）中培养，补充20% FBS（货号F4135，Sigma-Aldrich）用于Y79或10% FBS用于WERI-Rb1。RPE-1细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；货号61965-059，Gibco）中培养，补充10% FBS。Panc-1细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；货号31966-021，Gibco）中培养，补充10% FBS。A549细胞在Dulbecco改良Eagle培养基/F12（DMEM/F12；货号31331-028，Gibco）中培养，补充10% FBS。细胞每周传代两次，最多在解冻后传代25次。所有细胞均在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中培养。
Y79-GFP细胞系是通过在含8 μg/mL polybrene的培养基中用含有PL-SIN-PGK-GFP载体的慢病毒颗粒感染Y79细胞生成的。通过流式细胞术确认GFP表达，在80%以上的细胞中得到证实。慢病毒由EPFL的Bertarelli基因治疗平台提供。
4.2 2D悬浮培养的初级药物筛选
药物使用声波液体处理器Echo 550（Labcyte Inc., Sunnyvale, CA）分配到无菌条码96孔板（货号655180, Greiner bio-one, 瑞士）中。药物以双重形式排列，并进行了两次独立实验。药物在10 μM的固定浓度下进行测试。作为未处理和处理对照细胞和球体的参考，分别使用0.1%最终DMSO溶液和10 μM最终藤黄酸。将100 μL细胞以最终浓度4·10⁵ cells/mL接种到准备好的板中，并在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中孵育72小时。处理后，按照制造商说明，以1:10的比例向培养物中添加PrestoBlue™细胞活力试剂（货号A13262, Invitrogen, 美国），并在37°C下孵育1.5小时。使用Tecan Infinite 500微孔板读数器（Tecan, 瑞士）检测560/590 nm的荧光。进行了两次独立实验。
4.3 球体生成
使用Multidrop Combi试剂分配器（ThermoFisher Scientific, 美国）将10 μL的1.5%低熔点琼脂糖（货号50081, Lonza, 瑞士）溶液在FluoroBrite培养基（货号A1896701, Gibco, 美国）中涂覆384孔板。琼脂糖固化后，接种20 μL细胞悬浮液，使每孔500个细胞。让细胞沉降30分钟，然后转移到37°C、5% CO₂的加湿培养箱中。在第3天（HCT116衍生球体）或第4天（Y79和WERI-Rb1衍生球体），使用BioTek MultiFlo FX Multimode Dispenser（Agilent, 美国）用新鲜培养基清洗球体。培养基补充包括三个循环的添加-吸出30 μL培养基。
4.4 药物库
药物筛选的选择基于更新的临床数据，包括FDA批准的或处于临床试验阶段的药物。药物从EPFL生物分子筛选设施维护的库中精选。所有储备化合物在100% DMSO中浓度为10 mM，并在-20°C下避光储存，使用自动储存系统并用氩气冲洗干燥空气。定期通过HPLC-MS控制其化学完整性。
4.5 CRC和Rb球体筛选
药物使用ECHO声波分配器预先分配在96深孔板（货号249946, ThermoFisher Scientific, 美国）中，稀释在培养基中，然后手动添加到球体中。每个条件在一块板中有N=8个技术重复，以减轻可能的球体损失。在第3天（CRC，HCT116衍生）或第4天（Rb，Y79和WERI-Rb1衍生）用新鲜相应培养基清洗球体，然后进一步暴露于药物3天。在第6或7天，添加5 μL染色溶液，即0.3 μM Calcein AM（货号C3100MP, Invitrogen, 美国）、1.5 μM Ethidium homodimer-1（内部生产）、5 μM Hoechst 33342（货号H3570, Invitrogen, 美国），球体在37°C下孵育1小时，并使用GE INCell分析仪2200进行成像，使用通道DAPI（Ex. 390/18, Em. 432/48）、FITC（Ex. 475/28, Em. 512/23）和Cy3（Ex. 542/27, Em. 597/45）以及物镜4X/0.2、10X/0.45或20X/0.75。进行了两次独立实验。
4.6 使用Y79-GFP细胞的鸡胚尿囊膜Rb模型
本工作中描述的鸡胚胎实验在胚胎发育第14天（EDD14）之前进行，因此根据瑞士动物护理指南（TSchV, Art. 112）不需要伦理批准。使用in ovo CAM测定作为替代临床前模型，连接in vitro和哺乳动物in vivo系统，以评估顶级命中化合物crizotinib和entrectinib的疗效。受精洛曼棕色鸡蛋（Animalco AG）在37.5°C和47%湿度下孵化，每小时四次旋转。在胚胎发育第3天（EDD3），在鸡蛋尖端制作一个小开口，以创建人工气室，并在37.0°C和53%湿度下继续孵化。在EDD7，开口扩大以进入CAM，用无菌Kimwipe轻轻划破CAM。将Y79-GFP细胞与Cultrex Type 2（货号3533-010-02, Bio-Techne）以1:1混合，在培养皿中分配20 μL液滴，每滴含1·10⁶细胞，并在37.0°C下固化30分钟。用无菌Kimwipe轻轻划破CAM表面以促进移植物，将一个细胞-Cultrex混合液滴转移到划破部位。用Parafilm密封鸡蛋窗口，并在37.0°C和53%湿度下进一步孵化。
在EDD10，使用荧光显微镜（Nikon Eclipse E600FN，Apo 4×/0.2物镜；Ex 450-490，DM 505，BA 520滤光片组）可视化GFP阳性移植物，以确认肿瘤形成。称重鸡蛋并随机分配到治疗组：对照、crizotinib（0.5 mg/kg）或entrectinib（0.5 mg/kg）。将储备溶液（10 mM DMSO中）稀释在0.9% NaCl中，将100 μL工作溶液局部应用于移植物部位。对照组接受100 μL的0.9% NaCl + DMSO。
经过三天治疗（EDD13）后，在相同设置下重新对肿瘤进行成像，并使用ImageJ量化荧光强度。进行了两次独立实验，每组至少五个胚胎。在EDD14，将鸡蛋在冰上冷却30分钟，并切除CAM组织，在4% PFA中过夜固定。样品用PBS洗涤三次，包埋在石蜡中，并切片至4 μm。切片用苏木精-伊红染色，并使用抗人Ki-67（SP6，货号MA5-14520, Thermo Fisher）和抗GFP（货号ab6673, Abcam）抗体进行免疫标记。使用Olympus VS120幻灯片扫描仪进行图像采集，并使用QuPath v0.5.1进行Ki-67阳性细胞的量化。
4.7 数据分析和统计
使用EPFL生物分子筛选设施的内部LIMS系统分析2D细胞培养的细胞毒性数据，应用标准命中调用标准，定义为与DMSO对照相比差异大于三个标准差。该方法单独应用于选定的单参数读数。使用CellProfiler软件（v4.2.5）进行球体培养的高内涵成像分析，并使用相同的LIMS系统对选定的单参数读数进行分析。对于图像衍生数据的多参数分析，使用Python和专用库执行药物聚类。首先通过移除具有恒定值、高水平缺失数据（>15%）、非信息性值（例如对象坐标）和高度相关特征（|皮尔逊r| > 0.9）的特征来清理提取的特征，从而获得80个特征用于进一步分析。然后使用z分数标准化对这些特征进行归一化。计算曼哈顿距离，并使用平均连接进行层次聚类。然后应用主成分分析（PCA）进行进一步降维，并使用t分布随机邻居嵌入（t-SNE）与PCA初始化投影到二维空间，以保留全局结构。使用GraphPad Prism（v.10.0.2）和Python进行图形绘制。使用Fiji（Image J）v.1.54p进行图像分析和处理。使用Biorender绘制示意图。使用Adobe Illustrator生成图表。
实验至少进行两次独立实验，每次至少三个技术重复。
CRediT作者贡献声明
Irina L. Sinenko: 写作 – 审阅和编辑，写作 – 原始草稿，可视化，方法学，调查，正式分析，概念化。
Fabien Kuttler: 写作 – 审阅和编辑，写作 – 原始草稿，可视化，方法学，调查，正式分析，数据整理，概念化。
Kseniya Glinkina: 写作 – 审阅和编辑，写作 – 原始草稿，可视化，方法学，调查。
Gerardo Turcatti: 写作 – 审阅和编辑，监督，资金获取。
Adeline Berger: 写作 – 审阅和编辑，监督。
Paul J. Dyson: 写作 – 审阅和编辑，监督，资金获取。
Francis L. Munier: 写作 – 审阅和编辑，监督。
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的可能影响本论文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢EPFL洛桑联邦理工学院生物分子筛选设施（BSF）的Antoine Gibelin、Julien Bortoli、Damiano Banfi、Nathalie Ballanfat和Marc Chambon提供的专家建议。作者还感谢Quentin Gasser的技术帮助。本项目获得了欧盟地平线2020研究与创新计划（Marie Skłodowska-Curie赠款协议No. 754354）和儿童癌症研究基金会（FORCE foundation）赠款协议No. 532756的资助。
数据可用性
数据将根据要求提供。
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