在繁殖过程中，包括昆虫和所有哺乳动物在内的多个物种都会经历广泛的生理和形态适应，以确保母亲和后代的健康和生存。本报告指出，哺乳动物在妊娠和哺乳期间，肠道上皮会发生扩张。这种肠道表面积的增大导致了新型扩展绒毛的几何结构。通过体内实验和小鼠及人类肠道类器官的研究，鉴定出受体激活剂核因子-κB（RANK，由_TNFRSF11A_编码）及其配体RANKL是这一小肠绒毛扩展的分子途径。从机制上讲，RANKaRANKL保护肠上皮细胞免于细胞死亡，并通过BMP受体信号控制肠干细胞生态位，从而导致绒毛伸长和肠道表面积显著增加。作为跨代后果，缺乏肠道上皮中_Rank_的雌性小鼠所生的婴儿体重减轻，并在代谢应激后发展出葡萄糖不耐症。虽然妊娠/哺乳期间的肠上皮重塑是可逆的，但构成性表达活性形式的RANK足以驱动肠道扩张，随后绒毛和干细胞丢失，并防止_Apc_min_驱动的小肠干细胞肿瘤的形成。这些数据确定了RANKaRANKL是驱动妊娠/哺乳期间肠道上皮扩张的途径，这是哺乳动物生命史和进化中最隐秘和最根本的组织重塑事件之一。
RANKaRANKL 控制肠道类器官的扩张
我们评估了肠道中的RANK表达。RANK存在于几乎所有的肠道上皮细胞表面，包括分化的肠细胞和干细胞，但位于绒毛顶端的上皮细胞除外（图1a和扩展数据图1a）。为了直接测试RANK在肠道上皮中的功能作用，我们将小鼠肠道类器官暴露于RANKL。用RANKL刺激空肠类器官可增强其生长；然而，在大约第3天，类器官芽的数量减少，我们观察到异常的芽伸长（图1b和扩展数据图1b,c）。类器官可以无限期传代，因为它们含有与芽数量相关的功能性干细胞。RANKL刺激导致类器官的传代能力显著下降，完全无法维持超过3次传代，这取决于RANKL的剂量（扩展数据图1d,e）。我们证明RANKL处理导致CD44+细胞初始扩张，随后_Lgr5_-eGFP+CD44+和OLFM4+干细胞显著减少（图1c,d和扩展数据图1fah），这为传代能力受损提供了细胞学相关性。RANKL驱动的变化可以在雄性和雌性小鼠的肠道类器官中观察到。RANK激活小鼠肠道类器官导致早期生长刺激，随后干细胞耗尽和/或终末分化增强。
基因表达谱分析
我们使用批量RNA测序（RNA-seq）进行了基因表达谱分析。RANK刺激小肠类器官导致NF-κB通路激活和多个抗凋亡基因的诱导（扩展数据图2aac）。它还导致BMP和MAPK/ERK通路上调（扩展数据图2d,e）。使用定量PCR（qPCR）证实了RANK依赖性诱导BMP通路，特别是_Bmp2_及其下游基因_Id2_和_Id3_，以及抗凋亡基因如_Birc2_、Birc3、Tnfaip3_和_Bcl2l1（扩展数据图2f,g）。相比之下，RANKL处理抑制了干细胞特征基因_Lgr5_、Smoc2、Ephb2_或_Axin2_的表达。值得注意的是，一些祖细胞标志物如_Scn2b、_Ascl2_或_Cd44_的表达被RANK刺激诱导（扩展数据图2f,g）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析表明，对照组和RANK刺激的小鼠类器官分为九个不同的上皮群体22。RANK刺激后，我们观察到一个额外的群体构成M细胞（扩展数据图3a,b），正如之前报道的那样22,23。在对照类器官中，Rank mRNA主要在祖细胞群体中表达（扩展数据图3c），结合我们的蛋白质表达数据，这表明RANK在肠道祖细胞中转录，并在分化的肠道上皮中维持RANK蛋白。在干细胞、过渡扩增（TA）细胞和吸收性肠细胞系中检测到抗凋亡基因的诱导（图1e和扩展数据图3d）。RANKL处理的类器官在辐射损伤后的存活率增强（图1f）。BMP2的显著上调主要在未成熟的和成熟的肠细胞祖细胞中观察到，但在循环干细胞中也发现低水平表达；BMP2调控的靶基因_Id2_和_Id3_在干细胞、TA细胞和吸收性肠细胞中显著诱导（图1g和扩展数据图3e）。此外，类似于批量RNA-seq，我们在这些肠道细胞群体中观察到NF-κB激活和MAPK/ERK通路激活增加，但肠内分泌细胞、潘氏细胞和毛细胞除外（扩展数据图3f,g）。
持续激活RANK的体内效应
为了研究持续RANK激活是否会导致体内肠道干细胞耗尽，我们生成了一种转基因小鼠系，该小鼠系在肠道上皮中条件性表达一种组成性激活的RANK突变体（Rosa26-LSL-caRANK），使用_Villin1_启动子驱动的Cre（Villin1-cre）（以下简称_caRANK_vil-Tg小鼠）（扩展数据图5a,b）。这种人类RANK细胞质区域（氨基酸240）的激活突变最近在一名恶性淋巴瘤患者中被发现29。_caRANK_vil-Tg小鼠出生时外观正常，直到断奶年龄前生长正常。3周龄时，_caRANK_vil-Tg小鼠表现出小肠绒毛显著扩张；3D重建显示绒毛长度增加，绒毛体积和表面积扩大（图2a和扩展数据图5c）。免疫染色显示3周龄_caRANK_vil-Tg小鼠绒毛中的细胞凋亡减少（扩展数据图5d,e）。3周龄时，体内磷酸化组蛋白H3标记的隐窝细胞的增殖似乎正常（扩展数据图5f,g）。从断奶年龄开始，_caRANK_vil-Tg小鼠逐渐失去体重，由于体重过度减轻而需要安乐死（扩展数据图5h）。在较老的_caRANK_vil-Tg小鼠中，我们观察到OLFM4+肠干细胞数量减少（图2b和扩展数据图5i）。因此，较老的_caRANK_vil-Tg小鼠表现出隐窝细胞显著增殖能力下降（扩展数据图5f,g），并且如预期的那样，绒毛缩短，这些小鼠的隐窝和绒毛数量减少（图2c和扩展数据图5jal）。我们的体外持续RANKaRANKL激活观察结果的表型复制表明，肠道上皮中表达组成性激活形式的RANK首先导致绒毛扩张，随后导致干细胞丢失、绒毛结构改变和小鼠过早死亡。
RANK 在生殖中的作用
为了评估RANK驱动绒毛扩张的生理作用，我们生成了肠道上皮特异性_Rank_敲除小鼠（_Rank_Î_vil_小鼠）33。_Rank_Î_vil_小鼠中肠道RANK表达被消除（图1a和扩展数据图1a和7a,b）。值得注意的是，我们在乳腺组织中未观察到Cre表达；此外，_Rank_Î_vil_小鼠在妊娠和哺乳期间表现出正常的乳腺组织扩张（扩展数据图7c,d）。_Rank_敲除的初产小鼠（nulliparous _Rank_Î_vil_小鼠）的绒毛形态未受影响（图3a和扩展数据图7e）。分化的绒毛上皮细胞凋亡数量、OLFM4+肠干细胞数量和干细胞分裂也未发生变化（图3b和扩展数据图7faj）。体外肠道类器官形成在_Rank_Î_vil_小鼠和_Rank_野生型小鼠（_Rank_WT_小鼠）之间相似，且来自_Rank_Î_vil_小鼠的类器官可以在RANKL存在下传代（扩展数据图7k,l）。因此，肠道上皮细胞中RANK的失活不会破坏肠道干细胞稳态。
RANKaRANKL 控制妊娠和哺乳期间的肠道绒毛扩张
我们接下来研究了RANKaRANKL系统在肠道中的生理功能。据报道，在妊娠和哺乳期间，肠道会适应增加的营养需求，以支持多种物种的生存34,35。尽管这是所有哺乳动物和许多非哺乳动物物种中最基本的适应之一4,5，但从未鉴定出驱动这一扩张的分子信号。此外，关于哺乳动物妊娠期间肠道增大的研究非常少，有时甚至出现相反的结果36,37,38。因此，我们在野生型和_Rank_Î_vil_小鼠中重复了数十年前的实验。我们观察到，晚期妊娠和哺乳期的野生型小鼠肠道明显更大（图3a和扩展数据图7e,m,n）。食物摄入量在妊娠期间增加，在哺乳开始时急剧上升（扩展数据图8a,b）。我们还在哺乳期间观察到隐窝扩张和绒毛高度与隐窝深度比值的增加（扩展数据图8c,d）。我们在两个不同的实验地点进行了无菌小鼠的妊娠实验，发现在缺乏肠道微生物群的情况下，肠道上皮扩张仍然发生（图3c和扩展数据图8e,f）。此外，这种变化独立于胎儿的抗原特性，因为我们观察到了同基因和半异基因繁殖的相同变化（扩展数据图8f）。此外，移除后代以停止哺乳导致母亲的绒毛变小（图3d和扩展数据图8g），这表明泌乳素反馈回路控制着这一扩张和退化。用临床使用的药物卡麦角林（cabergoline）治疗哺乳小鼠，减少了RANKL水平39，导致肠道绒毛减少，作为对照，乳腺组织也受到影响（图3e和扩展数据图8h,i）。妊娠/哺乳期间肠道形态的变化是一个内在过程，主要由参与RANKaRANKL通路的妊娠/哺乳激素驱动。
RANK 在哺乳期间的作用
使用三维（3D）重建，这种扩张导致绒毛显著延长和表面积增加；在晚期妊娠（妊娠第18.5天，P18.5）和哺乳期小鼠中，3D绒毛体积增加（图3a和扩展数据图7e）。这种扩张还导致扩展绒毛的几何形状更加扁平，其中扁平的绒毛表面主要垂直于肠道内容物流动方向（图3a，扩展数据图7e和8j，补充视频1和2）。因此，绒毛扩张不仅增加了关键肠道区域的上皮表面积，而且这种形态对齐可能通过生物力学减缓食物运动进一步促进营养吸收。我们的发现确定了一个通过减少细胞死亡和维持干细胞来驱动肠道上皮适应妊娠和哺乳期间增加的营养需求的途径，这对进化和人类健康具有重要意义。
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