扰动组学：基于CRISPR-Cas筛选的功能基因组学方法用于药物靶点发现 - 创新药物

尽管人类基因组计划的第一份草图完成已有二十多年，但仍有相当一部分人类基因在功能上尚未得到充分研究。功能基因组学旨在阐明基因及其遗传元素的作用和相互关系，为它们在各种生物过程中的参与提供见解。在此背景下，“扰动组学”方法——一种通过基因功能调节系统分析表型变化的方法——为未注释基因的功能提供了有价值的见解。随着基于CRISPR-Cas的基因组和表观基因组编辑技术的出现，CRISPR筛选已成为扰动组学研究的首选方法，能够识别那些调节后可能对癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等具有治疗潜力的目标基因。这些发现有助于开发靶向药物疗法，并设计用于再生医学的基因和细胞疗法。本文重点介绍了CRISPR扰动组学的最新技术进展，特别是更符合生理学意义的单细胞水平分析及其在发现新治疗策略中的成功应用。

引言

尽管每年有数百万项研究发表，揭示了基因-疾病关联和因果关系，但许多基因产物的功能仍不明确。生物研究往往聚焦于已充分研究的基因，约20%的蛋白质编码基因吸引了近95%的基因相关科学文献关注，这主要是因为已有遗传工具（如敲除小鼠模型、敲低或过表达构建体）的可用性，以及易于将这些基因功能置于现有信号通路或生物过程中，使这些研究更具影响力。然而，对于较少研究的基因，需要确凿证据证明其在特定疾病或生物过程中的作用。比较基因组学和转录组学可以帮助识别与疾病相关的新基因，但这些方法主要建立关联而非因果关系，且常因乘客突变和有限功能相关性的差异表达而受到干扰。功能基因组学可以通过直接标注基因功能克服这些限制，揭示其在生物过程中的作用和相互关系，建立基因与疾病之间的因果联系。通过采用无偏倚的方法，功能基因组学有望阐明此前未知基因产物的功能，为新型治疗干预奠定基础。

扰动组学是一种基于基因扰动引起的表型变化来注释基因的功能基因组学方法。扰动组学的核心思想是，基因产物的功能可以通过改变其活性并系统测量由此产生的表型变化来推断。扰动组学方法最早在二十多年前被应用于鉴定影响细胞活力和侵袭的基因，使用的是多孔板递送的小干扰RNA（siRNA）阵列，以评估表型变化。然而，早期的扰动组学筛选存在三个主要限制：(1) 由于siRNA降解部分互补性mRNA而导致的脱靶效应；(2) siRNA效率的可变性，导致潜在假阴性因不完全基因敲低；(3) 缺乏能够处理大规模多孔板实验的高通量设施。两项重大技术进步解决了这些问题。首先，大规模平行短读测序的快速发展使得“混合筛选”成为可能，其中基因破坏文库作为混合物递送，表型变化可通过单次测序运行评估，从而消除了对高通量设施的需求。其次，CRISPR-Cas9技术的出现允许通过移码插入或缺失（InDel）突变实现更精确、完整的基因敲除，脱靶效应比siRNA更少。大约十年前首次进行的CRISPR筛选已被用于识别细胞存活所需的核心必需基因，以及赋予BRAF抑制剂抗性的基因，展示了这种方法在功能基因组学中的强大功能，以及其确定引起特定表型变化的兴趣基因的能力。

过去十年中，重要的进展增强了扰动组学方法，提高了其稳健性、准确性和可分析表型的多样性。特别是结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）的CRISPR筛选显示出在基因扰动后全面表征转录组变化的巨大潜力。此外，类器官和干细胞技术的进步使得在更符合生理学意义的器官模拟系统中研究治疗靶标成为可能。CRISPR筛选成功地识别出了一些新的治疗靶基因，其调节有望治疗包括癌症、心血管疾病和神经退行性疾病在内的多种疾病。在这篇综述中，我们总结了CRISPR扰动组学的最新技术进展，并强调了几项成功识别出有前景治疗靶基因的案例研究。

使用CRISPR筛选的扰动组学研究基本设计

CRISPR-Cas9系统包含两个基本组成部分：引发DNA双链断裂的Cas9核酸酶和引导Cas9到达特定基因组位点的向导RNA（gRNA）。CRISPR-Cas9切割DNA后会启动DNA修复机制，主要是非同源末端连接，通常引入导致移码的插入或缺失（InDel）突变，有效地破坏基因功能。这一特性促进了基于CRISPR-Cas9的敲除筛选的广泛应用，以高效识别遗传表型。gRNA文库在线设计，以针对全基因组范围的基因或特定基因集为目标，合成化学修饰的寡核苷酸并克隆到病毒载体中。所得的病毒gRNA文库被转导到大量表达Cas9的细胞群体中，随后接受选择压力。这些压力可能包括药物处理或营养剥夺以进行细胞活力筛选，或者通过荧光激活细胞分选（FACS）分离表达特定表型标记的细胞。选择后，从处理过的细胞群体中提取基因组DNA，并使用下一代测序进行分析。扩增并测序选定群体中存在的gRNA，以识别富集或耗竭模式。然后使用专门的计算工具处理测序数据，将特定基因与观察到的表型相关联。初步筛选的阳性结果通过后续实验进行验证，例如单独的基因敲除或敲低，以确认其对感兴趣表型的功能相关性。通过研究所识别基因在生物通路中的作用、分子相互作用及其潜在的治疗应用，可以进一步获得生物学见解（图1）。

图1：功能基因组筛选工作流程示意图

sgRNA文库用于生成病毒（腺相关病毒或慢病毒），包装并递送到癌细胞中，目标细胞中表达的Cas9实现了靶向基因编辑。病毒介导递送后，细胞受到选择压力（例如药物、其他应激源或基于标记表达的FACS选择）。提取基因组DNA（gDNA），并通过深度测序量化sgRNA丰度。比较选择前后sgRNA的富集或耗竭情况，分析差异计数以确定基因表型。可以进行通路分析以识别受影响的生物通路。

CRISPR筛选的技术进展

超越功能丧失筛选

虽然使用Cas9的敲除筛选非常有价值，但它们并非没有局限性（图2a）。Cas9介导的基因失活引入随机插入/缺失突变，导致移码，因此其应用仅限于具有阅读框的蛋白编码基因。这排除了将敲除筛选应用于长链非编码RNA（lncRNAs）。此外，Cas9诱导的DNA双链断裂本质上是有毒的。因此，在基因失活时细胞的存活能力受靶基因拷贝数的强烈影响，这与gRNA造成的双链断裂数量相关。最后，为了提高筛选命中结果的可靠性，功能丧失筛选可以与功能获得筛选相结合，从而使候选者的进一步验证更好地优先化。

图2：使用工程改造的Cas9进行CRISPR筛选概述

a CRISPR-Cas9敲除筛选涉及Cas9在靶位点介导的DNA双链断裂（DSBs），导致插入/缺失（Indels）破坏基因功能。CRISPRi筛选利用催化失活的Cas9（dCas9）与KRAB抑制域融合，抑制靶基因转录。CRISPRa筛选使用dCas9与诸如VP64的转录激活域融合，上调靶基因表达。b 基因编辑工程改造的Cas9变异筛选：胞嘧啶碱基编辑器结合Cas9 D10A切口酶、胞嘧啶脱氨酶（CDA）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGIs），将胞嘧啶（C）转化为胸腺嘧啶（T），产生C·G至T·A替代。腺嘌呤碱基编辑器利用Cas9 D10A切口酶和腺嘌呤脱氨酶（ADA）将腺嘌呤（A）转化为鸟嘌呤（G），实现A·T至G·C替代。引物编辑器整合Cas9切口酶、逆转录酶和含有靶位点、逆转录酶（RT）模板和编辑序列的引物编辑向导RNA（pegRNA），引入精确的DNA修改。

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Cas9功能、结合和切割目标DNA的模块化性质使其可用于功能丧失和功能获得研究。例如，化脓性链球菌Cas9（SpCas9）有两个核酸酶结构域RuvC和HNH，分别负责切割每条DNA链。通过突变关键催化残基（RuvC中的D10和HNH中的H840），生成保留RNA引导DNA结合能力但无核酸酶活性的Cas9（dCas9）。通过将dCas9与功能域融合，研究人员可以在特定基因组位点调节基因表达。例如，与KRAB转录抑制因子融合的dCas9沉默基因，而诸如VP64、VP64-p65-Rta（VPR）或协同激活介质（SAM）的激活因子则能激活基因。随着RNA引导RNA切割CRISPR-Cas13的出现，涉及特定mRNA降解的敲低筛选也开始兴起。这种方法促进了功能丧失和功能获得筛选的发展。dCas9-KRAB介导的敲低（CRISPR干扰，CRISPRi）筛选可以补充Cas9介导的敲除筛选，通过靶向lncRNAs和转录增强子元件，以及在对DNA双链断裂特别敏感的细胞（如胚胎干细胞（ES）细胞）中进行功能丧失筛选。与此同时，dCas9-激活剂介导的功能获得（CRISPR激活，CRISPRa）筛选补充了功能丧失研究，通过增强识别靶基因的信心。

CRISPR筛选也被改编用于变异研究，使遗传变异的功能分析成为可能（图2b）。碱基编辑器通过将酶域系在核酸酶失活的Cas9上，允许精确的核苷酸修饰。例如，胞嘧啶脱氨酶能够实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换（胞嘧啶碱基编辑），而进化的大肠杆菌TadA则促进腺嘌呤到鸟嘌呤的转换（腺嘌呤碱基编辑）。逆转录酶酶也被用于引物编辑器中，以诱导小规模的插入、删除或替换。当与CRISPR筛选结合时，这些工具能够生成点突变变体文库，用于高通量功能注释。这种方法在识别未知意义单核苷酸变异的功能相关性方面发挥了重要作用。例如，Kim及其同事使用基于引物编辑器的超过2000个单核苷酸变异的平铺阵列，针对表皮生长因子受体（EGFR），对其诱导EGFR抑制剂耐药性的能力进行了功能性评估。尽管其用途广泛，但碱基和引物编辑器筛选仅限于在由前间隔序列相邻基序（PAM）定义的特定编辑窗口内生成单一、小型突变。这限制了突变体的多样性，并阻止了涉及多个突变的连续进化研究。为了解决这些限制，碱基编辑器被系在如T7 RNA聚合酶或DNA解旋酶等进程性酶上，从而在哺乳动物细胞中实现连续进化。像TRACE（T7聚合酶驱动的连续编辑）这样的平台将碱基编辑器与T7 RNA聚合酶系在一起，促进T7启动子下游目标位点的连续编辑。这克服了PAM限制，扩大了碱基编辑的范围。使用这些系统，研究人员分别识别出赋予MEK1抑制剂耐药性的MEK1变体。HACE系统（与DNA解旋酶系的Cas9切口酶）通过允许编辑特定的内源基因，进一步扩展了连续进化的潜力。这种方法揭示了与RNA剪接相关的MEK1抑制剂耐药突变和SF3B1变体。表1中总结的这些进展展示了连续进化平台解决传统CRISPR筛选方法局限性的潜力。

表1 功能基因组筛选的技术进展。

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多样化CRISPR筛选的读出方式

传统的CRISPR筛选主要依赖于PCR扩增子的大规模平行测序，以监测在受到选择压力或基于特定替代标记排序的批量细胞群中单导向RNA（sgRNA）相对丰度的变化。因此，这些筛选的读出方式通常局限于细胞活力或简单蛋白质标记表达等指标，这些指标可以通过荧光激活细胞排序（FACS）进行分析。这种限制阻碍了复杂转录谱和细胞通路内复杂相互作用的高分辨率研究。为了克服这一限制，已经开发了将池式CRISPR筛选与单细胞RNA测序（scRNA-seq）相结合的方法，例如Perturb-seq和CROP-seq。这些方法能够在特定基因敲除的细胞中进行详细的转录谱分析，从而更全面地理解基因功能和调控网络。例如，CRISP-seq已被用于重建骨髓源树突状细胞中转录因子（TFs）的基因调控回路。TFs的扰动揭示了不同的调控模块，包括M1（Stat1和Stat2）、M2（Cebpb、JunB、Rela、Stat3和Hif1）、M3（Rel、Irf2和Atf3）和M4（Spi1、Runx1、Irf4和Nfkb1）。同样，T细胞中的CROP-seq表明，LCK或ZAP70的敲除产生了类似于幼稚T细胞的转录谱，有效抑制了T细胞受体激活。这些先进的筛选技术提高了基于CRISPR的功能研究的分辨率和广度，以前所未有的细节探索复杂的细胞反应和调控网络。

使用扰动组学识别新的癌症治疗策略

扰动组学研究，尤其是利用CRISPR筛选的研究，已成为癌症研究中的有力工具。这些研究通过将细胞活力变化与潜在遗传扰动联系起来，能够识别治疗见解。像DepMap项目这样的标志性项目已经生成了涵盖多种癌细胞系的全基因组CRISPR筛选广泛数据集。除了标准培养条件下的生存筛选外，扰动组学方法越来越多地应用于肿瘤免疫反应和营养限制等情境中。这些努力旨在揭示增强肿瘤免疫力或利用癌症特异性代谢脆弱性的治疗靶点。本节重点介绍CRISPR筛选在癌症研究中揭示的关键发现和潜在治疗靶点。下文讨论的关键实验策略和确定的潜在抗癌治疗靶基因总结在表2中。

表2 扰动组学研究确定的抗癌治疗基因。

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在无法用药的肿瘤中识别可药用脆弱性

靶向治疗彻底改变了癌症治疗，在HER2扩增乳腺癌中抑制HER2和在EGFR突变肺癌中靶向EGFR的治疗取得了成功。然而，许多癌症缺乏明显的可药用靶点。例如，癌症常常表现出难以用药的致癌基因（如KRAS）的突变或抑癌基因（如PTEN）的丢失，这迫切需要新的治疗策略。一个有前途的方法是合成致死性，即两个基因的同时扰动会导致癌症特异性的细胞死亡（图3a）。CRISPR筛选在识别合成致死相互作用方面发挥了重要作用，例如在微卫星不稳定高的结直肠癌中识别WRN解旋酶。类似地，靶向CIP2A-TOPBP1轴显示可损害BRCA突变肿瘤的基因组稳定性。PKMYT1抑制也显示出在CCNE1扩增肿瘤中的合成致死性，药理学抑制与吉西他滨协同作用效果显著。

图3：识别无法用药癌症的可药用靶点的扰动组学方法。

a 合成致死性的概念：在正常细胞（野生型）中，抑制基因B不会影响细胞活力。然而，在带有突变基因A（基因Amut）的癌细胞中，抑制基因B会导致合成致死性，导致癌细胞死亡。b 组合CRISPR筛选识别合成致死性：使用双重（或更高阶）sgRNA文库同时靶向多个基因组合。通过比较观察到的联合效应与单个基因扰动的加成效应来评估合成致死性效应。c 靶向耐药癌症：扰动组学可用于识别二级基因（基因B），其调节可以使耐药癌细胞重新对药物A敏感，导致细胞死亡并提供潜在的治疗策略。

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组合CRISPR筛选进一步扩展了发现合成致死相互作用的能力（图3b）。传统CRISPR筛选的前提是每个转导的细胞只整合一个sgRNA。因此，它们无法分析由多个基因同时扰动引起的表型变化，这使得发现新的基因相互作用或有效靶向具有冗余功能的密切相关旁系同源基因变得困难。为了解决这些限制，许多团队开发了一种组合CRISPR筛选工作流程，涉及包含多个gRNA的gRNA文库的每个质粒。例如，Adams等人确定了FAM50A-FAM50B基因对在黑色素瘤中的合成致死性。此外，针对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中的酪氨酸激酶的组合CRISPR筛选显示，FYN破坏与IGF1R、EGFR和ABL抑制的协同作用，表明使用酪氨酸激酶抑制剂的组合疗法具有潜力。

受体酪氨酸激酶（RTKs）和下游MAPK通路是癌症的常见驱动因素，也是BRAF、MEK1和ERK1抑制剂的主要靶点。然而，由于补偿性激活替代通路（如PI3K信号传导）或代谢适应，常常会出现耐药性。CRISPR筛选在揭示耐药机制方面至关重要（图3c）。例如，我们在vemurafenib耐药黑色素瘤细胞中进行了CRISPR筛选，确定S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（AMD1）通过增强多胺生物合成介导耐药性。发现MAPK和PI3K-AKT信号传导下游的持续c-Myc激活驱动多胺生物合成和随后的耐药性，突出了信号传导与代谢适应在BRAF抑制剂耐药性之间的重要联系。同样，CDK6被确定为黑色素瘤耐药性的驱动因素。MEK抑制剂的耐药性还归因于在突变RAS癌症中的SHOC2和GRB7等蛋白质。此外，CRISPR筛选揭示ILK-GSK3B轴作为FGFR抑制剂在胃癌中的耐药机制。发现lenvatinib和gefitinib的组合协同靶向肝细胞癌中的多个酪氨酸激酶。

DNA损伤化疗仍然是许多癌症的标准治疗方法，尽管常常会出现耐药性。CRISPR筛选已确定了使癌细胞对这些药物敏感的基因。例如，PRMT5的缺失通过损害DNA修复使胰腺癌细胞对吉西他滨敏感。同样，HNRNPU和PLK4的耗尽分别使细胞对顺铂和奥沙利铂敏感。靶向治疗如PARP抑制剂（例如olaparib）利用DNA损伤反应途径中的漏洞，特别是在BRCA1/2缺陷肿瘤中。然而，通过激活替代DNA修复途径也可能出现耐药性。CRISPR筛选已确定了RNASEH2B等基因，其缺失通过损害核苷切除修复增强PARP抑制剂敏感性。此外，MMS22L的缺失通过破坏RAD51介导的同源重组增加前列腺癌中的olaparib敏感性，而CHEK2的缺失通过BRCA2上调导致耐药性。结合ATR和PARP抑制剂也显示出克服这种耐药性的效果。

识别新的癌症免疫治疗靶点

免疫检查点抑制剂（ICIs）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的成功引发了对癌症免疫疗法的巨大兴趣。尽管取得了这些进展，但仍存在重大限制。大多数接受ICIs治疗的患者显示有限或没有受益，而尽管CAR T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤（如B细胞癌症）中显示出持久疗效，但在实体瘤中却大多失败。这些疗法的一个主要障碍是免疫抑制性肿瘤微环境（TME），它抑制了抗肿瘤免疫反应。CRISPR筛选已成为识别驱动免疫逃逸的癌细胞内在因素和发展免疫抑制性TME的强大工具（图4a）。最初的寻找免疫治疗靶点的CRISPR筛选是在肿瘤-T细胞共培养系统中进行的。例如，Restifo及其同事使用NY-ESO-1作为模型抗原，确定了APLNR作为一个基因，其缺失使癌细胞对T细胞介导的杀伤敏感。刘等人在B16F10黑色素瘤模型中筛选了IFN-γ处理下调节PD-L1或MHC-I表达的基因，确定TRAF3是NF-κB信号传导和MHC-I抗原呈递的关键抑制因子。

图4：识别癌症免疫治疗靶点的扰动组学方法。

a 在癌细胞与免疫细胞（例如，原代人T细胞）共培养的CRISPR筛选可以识别其缺失能使癌细胞对T细胞介导杀伤敏感的基因。b 将sgRNA文库递送到癌细胞中可以进行同基因移植实验，以发现体内调节细胞适应性的基因。c 在癌症的基因工程小鼠模型中进行体内CRISPR筛选，以完全模拟TME。d 对原代T细胞或NK细胞进行CRISPR筛选，以发现调节肿瘤中免疫细胞活性的基因。

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为了模拟更复杂的癌症-免疫细胞相互作用，已经开发了体内CRISPR筛选与同基因肿瘤移植（图4b）。使用B16F10黑色素瘤模型，Haining及其同事确定了PTPN2、ADAR1和SETDB1分别是JAK-STAT通路、双链RNA感知和内源性病毒抗原沉默的调节因子。使用MC38结肠癌模型在体外（与T细胞共培养）和体内（MC38-Ova细胞和OT-I T细胞共同移植），Oliaro及其同事发现2-氨基乙硫醇双加氧酶（Ado）的缺失使肿瘤对TNF介导的细胞毒性敏感。用化疗和ICI处理的同基因模型确定了使胰腺导管腺癌对免疫治疗敏感的基因，如KDM3A。研究还揭示了调控肿瘤-巨噬细胞串扰的因子，包括Asf1a、Cop1和Lgals2，这些因子的缺失改善了TNBC和肺癌模型中的免疫反应。尽管同基因移植提供了宝贵的见解，但它们并不能完美再现TME。基因工程小鼠模型已被用作替代方案（图4c）。使用LSL-Kras G12D或LSL-Braf V600E模型与慢病毒sgRNA文库，Serpinb9被确定为肺癌中的关键免疫逃逸因子。

CRISPR筛选还被用于识别免疫细胞（如T细胞和自然杀伤（NK）细胞）内在基因，这些基因增强其在免疫抑制性TME中的活性（图4d）。陈及其同事在来自Cas9转基因小鼠的原代CD8+ T细胞中使用全基因组敲除sgRNA文库，识别了通过NF-κB信号传导调节CD8+ T细胞功能的Dhx37。使用CRISPRa文库，同一团队发现PRODH2通过重新编程脯氨酸代谢来增强T细胞活性。他们还使用腺相关病毒（AAV）包装的sgRNA文库揭示CALHM2作为关键NK细胞活性调节因子。

CRISPR筛选还阐明了调节免疫细胞命运的机制，这对肿瘤免疫具有潜在影响。例如，在淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染模型中，Pofut1被发现通过mTORC1信号传导调节效应T细胞和记忆T细胞的分化。同样，Flcn增强了单核细胞增多性李斯特菌模型中组织驻留记忆T细胞的功能。在另一项研究中，使用体外诱导调节T细胞分化的鼠原代T细胞，SEC31A被确定为抑制T细胞分化为调节T细胞的抑制因子。在人原代T细胞中的CRISPRa和CRISPRi筛选中，BATF3被确定为记忆T细胞形成的表观遗传调节因子，控制如IL7R等基因。Marson及其同事最近进行了平铺CRISPR筛选，以识别调节CD8+ T细胞活性的PIK3CD、VAV1、LCP2、PLCG1和DGKZ等基因中的点突变。接近无PAM的Cas9系统的进展可能使对免疫调节基因关键残基的更全面分析成为可能。

发现癌症中的新代谢脆弱性

与正常细胞相比，癌细胞表现出不同的代谢适应，包括糖酵解、氧化磷酸化（OXPHOS）、氨基酸代谢、多胺代谢和脂质代谢的改变。这些差异为利用癌症特异性代谢脆弱性进行治疗提供了机会。扰动组学是一种将功能基因组学与代谢分析相结合的技术，已成为识别对癌症生存至关重要的代谢途径的有力工具。因此，全基因组CRISPR筛选揭示了各种癌症模型中的代谢脆弱性。例如，在NB4急性髓性白血病细胞中，METTL16被确定为支链氨基酸代谢的调节因子，对白血病起始细胞至关重要。通过将近1000个癌细胞系的代谢组学数据与DepMap数据集相结合，Sellers及其同事确定天冬酰胺合成酶是对富含天冬酰胺的癌细胞系的一个关键脆弱性。

传统组织培养基通常富含营养物质，不能准确模拟生理条件，特别是缺乏营养的肿瘤微环境（TME）。为了解决这个问题，研究人员在模拟生理条件或施加特定营养限制的培养基中进行了CRISPR筛选。例如，Cantor及其同事使用K562慢性髓性白血病细胞系在经典RPMI1640或模拟健康成人平均营养浓度的生理人血浆样培养基中培养，揭示了丙氨酸和丙酮酸对肿瘤进展的依赖性。Chidley等人在氨基酸耗竭培养基中确定了氨基酸转运体作为慢性髓性白血病的治疗靶点。此外，通过用半乳糖代替葡萄糖（选择性杀死OXPHOS缺陷细胞），Mootha及其同事确定了NGRN等基因对OXPHOS至关重要。

耐药癌症常常表现出代谢重编程，使得扰动组学成为识别新脆弱性的宝贵方法。Weyemi及其同事在用ATM抑制剂AZD1390处理的MDA-MB-231 TNBC细胞中进行了CRISPR筛选，发现KEAP1破坏与ATM抑制协同作用。一些肿瘤中观察到OXPHOS上调，可能与治疗耐药性相关。我们最近证明，抑制AMD1（多胺生物合成中的关键酶）通过抑制多胺合成和EIF5A羟脯氨酸化，最终下调OXPHOS，增强了对BRAF抑制剂的敏感性。同样，Lapalombella及其同事确定CDK9、DHODH和PRMT5作为通过阻断OXPHOS克服FLT3抑制剂gilteritinib耐药性的靶点。

铁死亡是一种依赖铁的细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化物的积累，已成为一个有前途的治疗靶点。癌细胞通过涉及半胱氨酸转运、GSH-GPX4通路或CoQ依赖的FSP1系统的抗氧化机制逃避铁死亡。CRISPR筛选已确定了许多铁死亡调节因子。例如，过氧化物酶体基因PEX3和PEX10通过介导多不饱和醚磷脂（PUFA-ePLs）的合成来调节铁死亡，PUFA-ePLs是驱动铁死亡的脂质过氧化来源。在TNBC中，PKCβII通过增强脂质过氧化促进铁死亡。激素信号与乳腺癌和前列腺癌中铁死亡的调节有关，MBOAT1和MBOAT2通过调节磷脂组成抑制铁死亡。在肝细胞癌中，PSTK通过抑制半胱氨酸合成负向调节GSH-GPX4通路。Freitas等人还在使用铁死亡模型细胞系Pfa1的CRISPR筛选中确定了胆固醇生物合成基因DHCR7作为铁死亡调节因子，通过减少保护脂质免受脂质过氧化的7-脱氢胆固醇水平。

破译细胞命运和分化的扰动组学

正如前面提到的使用CRISPR筛选来识别免疫细胞命运的关键调节因子一样，扰动组学提供了一种强大的方法来揭示控制细胞命运决策的机制。利用干细胞、其分化后代、类器官和体内小鼠模型的研究阐明了细胞分化的分子机制，为发育和诸如神经退行性疾病等疾病的发病机制提供了见解。这些发现突显了扰动组学在识别跨器官调控基因方面的潜力，可能推动再生医学中的靶向治疗（图5）。下文讨论的作为细胞命运和分化调节因子确定的关键实验策略和目标基因总结在表3中。

图5：破译细胞命运和分化的扰动组学。

扰动组学方法应用于多种情境，通过将sgRNA文库递送到iPS细胞、ES细胞或类器官中，并在体外分化为特定细胞谱系，以发现调节病理状况（如肝细胞脂肪变性）和细胞分化的基因。

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表3 确定调节细胞命运和分化的基因的扰动组学研究。

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理解神经发育和神经退行性疾病的扰动组学研究

阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病在老龄化人群中发病率上升，但其潜在机制仍然难以捉摸。由于缺乏像癌细胞系这样容易扩展和操作的模型，该领域的扰动组学研究复杂。相反，许多扰动组学研究依赖于分化为疾病相关细胞类型的ES细胞或诱导多能干细胞（iPS细胞）。例如，Kampmann小组开发了稳定表达CRISPRi和CRISPRa系统的iPS细胞系，以生成神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。利用这个平台，他们确定了阿尔茨海默病的治疗靶点，包括PSAP（神经元铁死亡调节因子）和IL-6信号传导及NF-κB作为阿尔茨海默病和缺氧-缺血性脑病的关键机制。同样，使用携带和不携带APP swe/swe突变累积淀粉样β的同基因iPS细胞对进行研究，发现UBA3（E1连接酶的一个亚基）对阿尔茨海默病神经元至关重要。

CRISPR筛选还探索了对脑免疫至关重要的小胶质细胞功能。使用鼠BV-2小胶质细胞系，发现了progranulin（GRN）作为调节小胶质细胞活性和脂滴积累在神经退行性疾病中的因子。在永生化的人小胶质细胞中，SEC24B被发现是小胶质细胞铁死亡的关键调节因子。Kampmann小组使用类似于上述的方法，利用iPS细胞衍生的小胶质细胞，确定CSF1R作为小胶质细胞存活的关键介质，CDK12和MED1用于小胶质细胞活性，INPP5D用于吞噬作用。

心肌细胞分化中的扰动组学研究

扰动组学还推进了我们对心肌细胞分化和成熟的认识。Perinatal期在小鼠体内递送AAV包装的CRISPR文库揭示RNF20和RNF40是心肌细胞成熟的转录调节因子。Ellinor小组在人的心脏成纤维细胞中进行了高内涵成像的阵列CRISPR筛选，确定PRELP和JAZF1是成纤维细胞向肌成纤维细胞转变的调节因子，这一过程与心肌病相关。在ES和iPS细胞分化为心肌细胞的背景下进行的体外CRISPR筛选确定NF2是上皮-间充质转变为中胚层谱系的调节因子，而BRD4是心肌细胞分化基因的表观遗传调节因子。

上皮组织中的扰动组学研究以研究组织再生和分化

肝脏的显著再生能力——能够从高达80%的肝切除术中恢复——使其成为研究组织再生的优秀模型。通过尾静脉AAVS注射或水动力注射高效递送gRNA文库，使得体内CRISPR筛选成为可能。在延胡索乙酰乙酸水解酶（Fah）敲除小鼠模型中，与Fah基因共递送的gRNA文库允许表达Fah（和gRNA）的肝细胞在NTBC（2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮）撤除后主导并再生肝脏，NTBC是一种通过抑制酪氨酸分解代谢防止Fah缺失引起的酪氨酸血症所致肝损伤的药物。该平台为发现影响肝细胞再生能力的基因提供了最佳模型，并成功应用于识别BAZ2、SPP2和MIER1作为肝再生的负调节因子。对于非酒精性脂肪肝病，Clevers及其同事使用肝类器官培养和高内涵成像来评分脂肪变性，确定FADS2是通过脂质生成依赖机制调节脂质积累的关键因子。王及其同事对原代肝内胆管上皮细胞类器官进行了CRISPR筛选，并进行了scRNA-seq分析，确定Fos和Ubr5为肝细胞分化和成熟的介质。

类器官广泛用于研究其他上皮器官的上皮组织分化和命运决定。在源自iPS细胞的肾类器官中，CRISPR筛选确定ROCK1是早期分化的关键调节因子，为肾脏发育和慢性肾病提供了见解。同样，在胎儿肠道类器官中，发现SMARCA4和SMARCC1调节上皮成熟。在胃类器官中，CRISPR筛选揭示Alk、Bclaf3和Prkra是Wnt非依赖性胃上皮分化的调节因子。使用基于iPS细胞的胰腺谱系分化模型，黄甫及其同事证明HHEX是胰腺谱系特化的守门员，强调了其在器官发育中的关键作用。

展望

超越简单的生存筛选：更复杂系统中的扰动组学

迄今为止发表的大多数扰动组学研究依赖于过于简化的实验模型，如二维培养的癌细胞系。这种限制源于更复杂系统的可扩展性挑战，如类器官培养，这阻碍了大规模池式筛选，以及将gRNA文库体内递送到许多组织的技术困难。然而，类器官和组装体培养系统以及体内gRNA递送技术的进步现在使得在更符合生理学的情境中进行扰动组学研究成为可能。这些进展在揭示参与发育缺陷的基因方面尤其具有前景。例如，Pasca及其同事使用由亚脑室和皮质类器官组成的人iPS细胞衍生的前脑组装体，确定SMAD4、CSDE1、TERF2和LNPK为中间神经元发育和迁移的调节因子，对自闭症谱系障碍具有重要意义。

扰动组学研究日益整合谱系追踪技术和单细胞多组学，以在基因扰动后提供细胞表型的全面视图。例如，结合谱系追踪的CRISPR筛选能够详细分析单细胞水平上的谱系扩展。Knoblich及其同事使用具有独特条形码和gRNA文库的人ES细胞生成大脑类器官，分析特定条形码细胞的克隆扩展。他们确定IER3IP1是小头症的关键调节因子。该团队的进一步工作结合了谱系追踪和大脑类器官中的scRNA-seq，确定ARID1B对脑发育和放射状胶质细胞向少突胶质细胞前体细胞过渡至关重要，对自闭症谱系障碍具有重要意义。此外，细胞转录组和表位测序（CITE-seq）已被适应于扰动组学。一种称为Perturb-CITE-seq的技术可以同时检测单细胞中的表位、RNA和gRNA。该方法应用于患者来源的肿瘤-肿瘤浸润淋巴细胞共培养，揭示CD58的缺失促进IFN-γ非依赖性免疫逃逸。