亮点
• 糖皮质激素干预导致健康男性肠道菌群失调和代谢紊乱
• 肠道菌群失调表现出给药途径特异性和共性特征
• 某些肠道细菌物种的丰度与宿主代谢标志物相关
摘要
糖皮质激素会诱导胰岛素抵抗并抑制免疫，但其对可能调节代谢和免疫的肠道微生物群的影响尚未得到充分探索。在为期7天的试验中，我们评估了56名健康男性中糖皮质激素诱导的肠道微生物群和代谢标志物的变化，这些男性被随机分配到三个干预组：口服泼尼松龙（PO组）、肌肉注射醋酸甲泼尼龙（IM组）或生理盐水（对照组）。鸟枪法宏基因组学分析显示，口服糖皮质激素导致细菌丰度变化，增加Blautia和Collinsella，同时减少与胰岛素抵抗和免疫抑制标志物相关的Dysosmobacter welbionis和Anaerotignum faecicola。此外，口服治疗改变了与糖酵解和脂质代谢相关的微生物途径和酶，预测的代谢物如次黄嘌呤和苯乙酸盐也发生变化。肌肉注射治疗对微生物群的影响最小。这些发现强调了糖皮质激素对肠道微生物群的作用具有给药途径依赖性，以及其对宿主代谢和免疫的潜在影响。该试验已获得丹麦药品管理局批准（EudraCT协议编号：2016-001850-16）。
关键词
- 糖皮质激素
- 肠道微生物群
- 干预试验
- 代谢标志物
- 口服
- 肌肉注射
- 微生物代谢物
- 随机对照试验
引言
糖皮质激素在调节代谢、免疫功能、液体平衡、应激反应和神经系统功能方面发挥着关键作用。库欣综合征是一种由于内源性过度产生或长期外源性使用糖皮质激素导致的高糖皮质激素状态，通常与胰岛素抵抗、免疫抑制和显著的肠道菌群失调相关。除了其内源性作用外，糖皮质激素在临床实践中被广泛用作一线免疫抑制剂，这得益于其强大的抗炎和免疫调节作用。然而，尽管糖皮质激素具有治疗益处，但其治疗也存在多种不良反应，包括感染风险增加、骨质疏松、代谢紊乱以及胃肠道并发症。鉴于肠道微生物群在调节宿主代谢和免疫方面的明确作用，这些观察结果可能表明糖皮质激素诱导的宿主变化与肠道微生物群组成和功能变化之间存在潜在联系，突显了进一步研究这种复杂相互作用的必要性。
已进行了一些人类和动物研究，显示糖皮质激素后宿主生物学和肠道微生物群发生平行但多样的变化。例如，一项针对28名急性横贯性脊髓炎（ATM）和糖皮质激素诱导肥胖（口服给药）患者以及27名年龄和性别匹配的健康对照者的病例对照研究报道，基于16S rRNA测序数据，糖皮质激素治疗降低了肠道微生物多样性，增加了厚壁菌门的丰度，同时减少了拟杆菌门。然而，这项研究存在局限性。观察到的肠道微生物群差异可能不仅归因于糖皮质激素，因为治疗组是久坐、超重的ATM患者，而对照组是健康的，引入了潜在的混杂因素。此外，没有重复采样的横断面设计无法捕捉肠道微生物群的自然波动。
研究口服药物对肠道微生物群的影响存在挑战，因为尚不清楚观察到的变化是源于药物与肠道及其微生物生态系统内的直接相互作用，还是源于宿主体内的系统效应。在这里，我们设计了一项随机临床对照7天干预试验，包括56名健康男性，分为三组：口服泼尼松龙（PO组）、初始单次肌肉注射醋酸甲泼尼龙（Depo-Medrol）（IM组）和肌肉注射生理盐水的安慰剂对照组（对照组）。通过比较口服和肌肉注射给药的效果，我们旨在阐明假设的肠道微生物群变化是源于胃肠道内糖皮质激素的直接暴露，还是源于宿主介导的系统效应。安慰剂组被纳入作为对照，以考虑肠道微生物群组成和宿主生物学标志物的自然波动（图1A）。
本试验的预定主要目标是研究在发展出糖皮质激素诱导的胰岛素敏感性和系统免疫标志物损害的健康年轻男性中肠道微生物群的改变。我们旨在将肠道微生物群组成和功能的时间变化与宿主代谢和免疫标志物的时间变化相关联。
结果
干预前人口统计学和临床特征
研究参与者的基线人口统计学和临床特征详见表S1。
入组前，参与者保持健康的体重指数（BMI）范围为20.1至26.9 kg/m²，HbA1c水平为25至38 mmol/mol的最优葡萄糖代谢，空腹血浆葡萄糖水平为3.4至6.1 mmol/L。肝肾功能的生化指标也在正常范围内，血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平为12至53 U/L，血浆肌酐水平为61至107 μmol/L。单因素方差分析结果显示，这三个试验组在这些生物标志物方面没有显著差异，证实了适当的随机化。
糖皮质激素干预后的宿主表型变化
根据自我报告和预包装泼尼松龙的药片计数，PO组的药物依从性是完整的。两种糖皮质激素干预均耐受良好。与对照组个体相比，糖皮质激素治疗的研究参与者在其视觉模拟量表（VAS）评分中报告的胃肠道或药物相关不良反应并未增加（数据未显示）。
第1天和第8天的葡萄糖代谢、胰岛素敏感性和免疫调节标志物如图2和表S2所示。关于葡萄糖代谢，无论是干预组，从研究基线到研究终点，空腹血浆葡萄糖水平或口服葡萄糖耐量试验（OGTT）期间的血浆葡萄糖反应均未显示显著变化（图2A、2C和2I）。然而，在PO组中，OGTT期间0、30和120分钟的血浆胰岛素水平在研究终点显著增加（图2B和2J，校正p = 0.01、0.02和0.02），OGTT期间血浆胰岛素的曲线下面积（AUC）也相应增加（图2D，校正p = 0.01）。IM组的空腹血浆胰岛素水平也有所增加（图2B，校正p = 0.08）。此外，PO组的胰岛素抵抗标志物显著改变，Matsuda胰岛素敏感性指数从5.9降至4.1（图2E，校正p = 0.01），胰岛素抵抗稳态模型评估（HOMA-IR）指数水平从1.8升至2.6（图2F，校正p = 0.02），证实了糖皮质激素诱导的整体胰岛素敏感性损害。在IM组中观察到Matsuda胰岛素敏感性指数的适度下降（图2E，校正p = 0.13），表明糖皮质激素对胰岛素敏感性指标的影响不太明显。
血浆C反应蛋白（CRP）水平在PO组中下降，表明糖皮质激素的免疫抑制作用，水平从342降至214 ng/mL（图2G，校正p = 0.03）。此外，在两个干预组中，血液总白细胞计数显著增加（图2H），PO组的值从5.3升至8.5 ×10⁹/L（校正p = 0.003），IM组从5.4升至6.3 ×10⁹/L（校正p = 0.05）。对照组未观察到显著的生物标志物变化。最后，PO或IM给药的糖皮质激素也引起了其他循环细胞因子或血液白细胞的轻微变化，如表S3和S5所示。
糖皮质激素干预对肠道微生物群丰富度、群落结构和特定细菌物种流行率的影响
为了研究糖皮质激素干预对肠道微生物群的潜在影响，我们检查了肠道微生物群α多样性、个体内部Bray-Curtis距离以及不同时间点和干预组中特定微生物分类群的流行率。数据如图S2所示。
我们的分析显示，从干预第1天到第8天，基因家族、细菌物种、病毒物种或真菌物种的α多样性没有显著变化（图S2A-S2G）。这些发现表明，短期糖皮质激素干预并未显著改变整体微生物多样性。计算了基于肠道细菌或病毒微生物群相对丰度的个体内部Bray-Curtis距离，以评估每个参与者在两个时间点之间的组成差异。如图S2H所示，在PO组中，第1天和第8天之间的个体内距离略高于对照组（p = 0.04，校正p = 0.12）。在对照组中（图S2H），从第1天到第2、4、6天的初始轻微且不显著增加（校正p = 0.18），但在第8天下降，可能反映了肠道细菌微生物群组成的自然短期变异性，这可能由于饮食、生活方式的微小、短暂波动或技术变异性引起。否则，分析显示PO组或IM组内干预前和干预后任何时间点之间的细菌或病毒物种组成没有显著差异（图S2H和S2I）。我们的发现表明，糖皮质激素干预并未导致整体微生物群落结构在广泛组成水平上的实质性变化。
然而，如图S3所示，观察到糖皮质激素给药后特定肠道细菌物种流行率的变化。在PO组中，我们发现Turicibacter bilis的流行率增加（第1天vs第6天和第8天：效应大小均为0.4，校正p = 0.01，图S3A和S3C）。同样，在IM组中，糖皮质激素干预与几种物种的流行率增加相关（图S3B），包括Veillonella parvula（第1天vs第2天和第4天：效应大小=0.3至0.4，校正p = 0.05）、Streptococcus thermophilus（第1天vs第2天：效应大小=0.5，校正p = 0.02）和Clostridium sp. Marseille P3244（第1天vs第2天和第8天：效应大小=0.30至0.35，校正p = 0.08）。相比之下，Bittarella massiliensis的流行率在IM干预后下降（第1天vs第6天和第8天：效应大小= -0.3，校正p = 0.08）。在对照组中，肠道微生物分类群的流行率未观察到显著的时间变化（数据未显示），进一步突显了糖皮质激素干预对细菌物种流行率的特定影响。
糖皮质激素干预引起的肠道细菌物种丰度变化
为了评估糖皮质激素干预对肠道细菌物种相对丰度的影响，我们对糖皮质激素干预后的细菌微生物群进行了线性混合效应分析。如图3A所示，在PO糖皮质激素干预组中观察到细菌物种丰度的显著变化，特别是在研究终点（第8天）与研究基线（第1天）相比。
在PO干预组中，观察到厚壁菌门（Firmicutes）的显著富集，特别是Blautia属中的两个物种，表明对口服糖皮质激素干预的一致反应。此外，Collinsella属中物种的丰度增加显而易见，Collinsella_SGB14861的效应大小最大（效应大小=0.37，校正p = 0.007）。相反，几种物种在口服糖皮质激素干预后表现出丰度的显著降低。Sutterella wadsworthensis显示出最大的减少（效应大小= -1.21，校正p = 5.6e-05），其次是Dysosmobacter welbionis（效应大小= -0.78，校正p = 6.9e-04）和Anaerotignum faecicola（效应大小= -0.72，校正p = 6.9e-04）。还观察到Clostridium sp. AM33-3、Clostridium sp. AM22-11AC（效应大小= -0.60和-0.69，校正p = 5.8e-03至3.2e-03）、Lachnospira pectinoschiza和Lachnospira eligens（效应大小= -0.63和-0.52，校正p = 4.9e-03和0.03）的显著下降。这些发现突显了口服糖皮质激素给药后细菌丰度的重大变化（图3A）。
在IM组中，观察到的差异细菌物种的丰度变化比PO组少。值得注意的是，五种物种在糖皮质激素干预后表现出相对丰度的显著降低（图3B）。有趣的是，这些物种中有三种在PO组和IM组之间重叠，包括两种Lachnospira物种（L. eligens和L. pectinoschiza）和Sutterella wadsworthensis（图3C）。这种重叠可能表明糖皮质激素干预对特定肠道细菌具有一致且相对显著的影响，无论干预是口服还是肠外给药。
糖皮质激素干预引起的群落级微生物功能途径和酶的变化
为了更好地理解肠道微生物群组成变化的生理意义，我们研究了预测的群落级微生物功能途径和酶活性。该分析包括207个MetaCyc途径和767种酶，它们至少在20%的样本中存在，且最低稀释读数为50。
与葡萄糖代谢相关的途径在PO组中上调，包括糖酵解I、三羧酸循环和乳糖及半乳糖降解途径（效应大小=0.08至0.24，校正p = 0.08）（图4A）。此外，参与葡萄糖和脂质代谢的预测酶在PO组中上调，包括磷酸丙糖异构酶（EC 6.3.2.17，效应大小=0.04，校正p = 0.08），参与糖酵解和糖异生（图5A）。与脂质分解代谢相关的三酰甘油脂肪酶同样升高（EC 3.1.1.3，效应大小=0.14，校正p = 0.08）（图5A）。这些变化表明，对糖皮质激素干预的反应中，微生物葡萄糖和脂质代谢途径均发生失调。
IM组（图4B和5B）在代谢途径和酶方面表现出比PO组更少且不太明显的丰度时间变化。然而，仍在细菌糖酵解途径中观察到变化，特别是糖酵解I和糖酵解II（效应大小均为0.14，校正p = 0.002）。此外，参与维生素B1合成的途径在IM组中特异性改变，PWY-6892（硫胺素二磷酸生物合成I的硫唑组分，效应大小=0.09，校正p = 0.04）。
PO组和IM组的比较显示糖酵解I途径（图4C）和三酰甘油脂肪酶（图5C）的重叠富集。这些发现表明，糖皮质激素干预可能普遍调节微生物对葡萄糖或脂质的利用，可能影响人类宿主的更广泛代谢功能。
总体而言，结果表明糖皮质激素干预诱导微生物功能途径的特定变化，特别是在葡萄糖和脂质代谢以及氨基酸合成方面，表明肠道微生物群中可能发生的多种代谢变化，也可能影响宿主。
与口服糖皮质激素干预特异性相关的微生物代谢物的预测变化
为了进一步探索糖皮质激素干预后观察到的微生物功能变化，并深入了解可能影响宿主代谢的潜在生物活性微生物代谢物，我们采用了一种计算方法，MelonnPan，从宏基因组数据预测代谢物。
简而言之，我们首先在一个包含来自独立队列的配对宏基因组和代谢物丰度的数据集上训练了一个交叉验证的弹性网正则化回归模型。然后将该模型应用于本试验的个体宏基因组，以推断预测的代谢组并识别与糖皮质激素干预相关的假设代谢物。在这些分析中，我们使用了与宏基因组学相同的线性回归方法，对细菌细胞负荷进行了调整。
如图6和表S4所示，我们的分析显示，PO组预测的次黄嘌呤水平升高，这是一种与抑制炎症反应相关的代谢物。此外，一种肠道细菌代谢物苯乙酸盐也被预测在口服糖皮质激素干预后升高。
有趣的是，在IM组中，无法从肠道宏基因组分析中预测与宿主代谢相关的已知微生物代谢物，这表明口服给药途径后存在不同的代谢反应。
与糖皮质激素干预后宿主表型反应相关的细菌物种
为了探索肠道微生物群变化与糖皮质激素干预后宿主表型反应之间的关系，我们分析了肠道细菌物种相对丰度与人类宿主表型之间的关联。该分析基于线性混合效应模型，并在图7中可视化。关联分析揭示了特定细菌物种相对丰度与宿主表型标志物之间的几种关系。
因此，总血白细胞浓度与Collinsella SGB14861、Dorea longicatena和Blautia SGB4815的相对丰度呈正相关（效应大小范围为0.17至0.20，校正p = 0.06）。相反，与Clostridium sp. AM33-3、Lachnospira pectinoschiza和GGB9699 SGB15216的丰度呈负相关（效应大小范围为-0.32至-0.18，校正p = 0.06），进一步证明了肠道微生物群在塑造免疫反应中的影响。空腹血浆胰岛素与Clostridium sp. AM33-3和Lachnospira pectinoschiza的相对丰度呈负相关（效应大小= -0.38和-0.43，校正p = 0.06）。OGTT下的血浆胰岛素AUC与Clostridium sp. AM33-3的丰度呈负相关（效应大小= -0.45，校正p = 0.09）。这些发现可能表明，所提及的细菌物种可能在口服糖皮质激素干预条件下导致胰岛素释放改变。此外，Matsuda胰岛素敏感性指数水平与Staphylococcus SGB6340、Lachnospira pectinoschiza和Clostridium sp. AM33-3的相对丰度呈正相关（效应大小=0.42至0.56，校正p = 0.06），表明微生物对胰岛素敏感性调节的影响。
总体而言，这些发现强调了PO组中肠道细菌微生物群与宿主代谢和免疫标志物之间的独特关联。在IM组或对照组中未发现此类关联（数据未显示），突显了口服糖皮质激素干预对肠道微生物群-宿主相互作用的特定影响。
讨论
在本项为期7天的随机对照试验中，我们研究了在发展出糖皮质激素诱导的胰岛素敏感性和免疫功能标志物损害的健康年轻男性中肠道微生物群的改变。通过将口服和肌肉注射糖皮质激素干预与考虑自然波动的对照组进行比较，我们识别出两种糖皮质激素给药方式下肠道微生物群的独特和共同反应。
试验结果表明，短期糖皮质激素给药并未导致肠道细菌、病毒或真菌微生物群整体群落结构的显著变化，这表明糖皮质激素对肠道微生物群的广泛多样性影响很小。然而，在Turicibacter bilis的丰度上观察到了更有针对性的影响，这与酰基肉碱血清水平升高有关，是糖尿病心肌病的标志物。这些发现表明，尽管糖皮质激素对整体微生物多样性影响有限，但可能对特定肠道细菌类群施加选择性压力，可能影响适应性代谢和免疫途径。
在细菌丰度方面，PO组表现出几种变化，包括Blautia和Collinsella物种相对丰度的增加，以及促炎的Sutterella wadsworthensis和潜在抗肥胖相关的Dysosmobacter welbionis的减少。这些丰度变化出现在PO组中，糖皮质激素诱导的损害更为明显，这由Matsuda胰岛素敏感性指数降低和HOMA-IR值升高证明。伴随代谢变化，PO组还显示血浆CRP水平降低，支持糖皮质激素对代谢和免疫功能的广泛系统影响。虽然IM组与PO组相比表现出较少的细菌变化，但它仍与PO组共享几种细菌物种丰度的变化。因此，这些共享的差异肠道细菌可能与糖皮质激素干预广泛相关，可能由免疫调节和代谢的系统效应驱动，无论给药途径如何。
糖皮质激素干预对微生物代谢的功能影响在我们对微生物途径和酶的分析中显而易见。在PO组中，我们观察到糖酵解相关微生物途径的过度表达，包括与葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸相关的途径。在酶水平上，我们发现糖异生酶（如磷酸丙糖异构酶）的丰度增加，这些发现与该组中糖皮质激素诱导的葡萄糖调节异常一致。与功能途径相比，微生物酶显示出较弱的显著性，可能部分是由于与聚集的途径特征相比，其注释更稀疏和流行率较低，这总体上可能降低统计能力。
揭示特定肠道细菌菌株与宿主表型变化之间的假设关联是本试验的主要目标之一。在PO组中，Lachnospira pectinoschiza的相对丰度与空腹血浆胰岛素和总血白细胞呈负相关，而与胰岛素敏感性呈正相关。有趣的是，这种肠道细菌已被报道与缺血性心脏病呈负相关，并与代谢健康的肠道微生物群相关。同样，Clostridium sp. AM33-3的相对丰度已被证明与血浆胰岛素和总血白细胞呈负相关，但与Matsuda胰岛素敏感性指数呈正相关。虽然一些细菌物种，如Lachnospira eligens、Anaerotignurn faecicola、Dysosmobacter welbionis和Sutterella wadsworthensis，在糖皮质激素干预过程中显示出相对丰度的显著变化，但与PO组中观察到的宿主表型变化无关，这可能表明糖皮质激素对肠道微生物群产生直接影响，独立于对宿主生物标志物的影响。这种区分对于理解长期治疗后果至关重要，因为直接针对微生物的影响可能独立于宿主途径导致治疗并发症。
此外，当使用计算方法检查预测的微生物代谢物时，我们发现PO组中发生了显著变化，包括预测的苯乙酸盐和次黄嘌呤丰度增加。苯乙酸盐是细菌苯丙氨酸代谢的微生物副产品，在糖皮质激素干预后显示出增加的预测相对丰度。据报道，这种代谢物通过增强脂质积累或线粒体H2O2产生与2型糖尿病、心血管疾病、脂肪性肝炎和内皮细胞衰老相关。次黄嘌呤是另一种感兴趣的代谢物，最近被报道通过调节MAPK和NLRP3相关途径抑制炎症反应。预测的苯乙酸盐和次黄嘌呤相对丰度的增加可能表明这两种代谢物可能作为糖皮质激素诱导的宿主胰岛素抵抗或免疫抑制的促成因素或下游效应。IM组在预测的代谢物丰度方面没有显著变化，暗示了对微生物代谢的给药途径依赖性效应。
研究局限性
尽管我们的临床试验提供了糖皮质激素对肠道微生物群影响的宝贵见解，但该研究存在几个局限性。我们探索性试验的主要终点评估"肠道微生物群的结构变化"是有意设计和监管批准的，旨在捕捉可能与糖皮质激素对肠道微生物组和宿主生物学的影响相关的相关性。虽然这种方法不允许基于单一效应估计进行传统的样本量计算，但它允许对宿主和微生物反应进行无偏见的发现驱动评估。正如STAR方法中所讨论的，无法估计可能触发类似体内效应的两种糖皮质激素化合物的剂量。未通过血清或粪便药物水平监测评估糖皮质激素不同给药途径的药代动力学行为，排除了直接微生物-药物相互作用的量化或比较。因此，两组间宿主表型的观察差异可能反映了药代动力学（峰值浓度或持续时间）和途径特异性组织暴露的综合效应。
此外，我们的研究未控制配方辅料。它们的微量是药理学上惰性的，但我们不能排除微量淀粉和乳糖对肠道微生物组读数的影响。此外，虽然与体重无关的药物剂量可能会引入BMI依赖的暴露变异性或可能调节效应大小，但这种剂量方案反映了现实世界的临床实践，并加强了我们研究设计的转化相关性。
缺乏干预前的导入期可能会导致基线微生物群差异，尽管随机化减轻了组水平偏差。同样，虽然研究参与者被指示保持其习惯性饮食和身体活动，但缺乏对饮食变化和运动习惯的正式监测，无法验证依从性或按依从状态进行分层。我们的研究仅包括年轻健康的白人男性，因此我们的结果不能推广到其他人群。
本研究中使用的DNA提取和测序工作流程针对肠道细菌进行了优化，限制了肠道病毒或真菌DNA的回收。因此，结果可能低估了真实的病毒或真菌多样性。最后，虽然计算预测确定了潜在的代谢物变化，但缺乏粪便代谢组学数据排除了对这些微生物群衍生的代谢变化的验证。此外，虽然MelonnPan的IBD包容性训练集能够进行广泛的代谢物预测，但将其应用于健康队列可能会引入偏差，在解释结果时需要谨慎。未来的工作需要整合多组学验证，特别是靶向代谢组学，以定量支持我们的预测分析所建议的微生物群-代谢物-宿主相互作用。
总体而言，本临床对照试验的结果强调了糖皮质激素治疗、肠道微生物群和宿主代谢及系统免疫反应之间的细微关系。虽然口服糖皮质激素干预比肌肉注射引起更明显的肠道微生物群变化和代谢变化，但两种干预途径都导致了与宿主代谢和免疫标志物变化相关的特定细菌物种和功能途径/酶的显著变化。
STAR方法
实验模型和研究参与者详情
该研究被设计为一项开放、随机、三臂、单中心研究。在试验开始前三个月内的预试验资格评估访问中，61名男性接受了筛选。研究候选者根据预定的纳入标准进行评估：居住在丹麦首都地区的丹麦白人男性，年龄18-35岁，体重指数（BMI）为18.5-27.0 kg/m²，过去两个月体重稳定，葡萄糖代谢正常（HbA1c < 39 mmol/mol），以及标准的肾肝功能，分别由血浆肌酐和ALT水平指示。还需要正常的血压（收缩压<140 mmHg，舒张压<90 mmHg）。排除标准包括已知对糖皮质激素过敏、任何疾病、药物摄入、益生菌、抗生素或试验前四个月内显著的饮食变化。此外，吸烟者被排除在外。
本研究中包括的所有参与者均为男性，年龄在18至33岁之间。在试验开始前，一名个体因不符合HbA1c标准而被排除，四名个体因不符合BMI标准而被排除。共有56名男性符合所述试验标准，所有这些人都完成了试验（图S1）。最终参与者人数（n = 56）因此与注册的试验方案不同，该方案预计总共有60名参与者。56名研究参与者使用R（版本4.3.2）中的sample()函数根据研究ID进行随机化，确保每个研究组分配的概率相等。
方法详情
干预
该试验根据国际协调会议的优良临床实践指南包括赫尔辛基宣言II进行。试验方案获得丹麦首都地区伦理委员会（H-16021787）、丹麦药品管理局（EudraCT协议编号：2016-001850-16）和数据保护局（SUND-2016-42）的批准。Bispebjerg-Frederiksberg医院的优良临床实践（GCP）单位监测了该试验。所有参与者在参与研究前均提供了书面知情同意。试验开始后未对方法进行更改。
在第一次试验访问时，要求参与者在干预期间不要改变其习惯性饮食和身体活动。在两次研究访问中，研究参与者被要求在VAS评分中报告胃肠道症状。此外，在试验结束时，他们被要求向临床调查员报告在干预期间经历的任何不良事件或不良反应。试验在位于哥本哈根Bispebjerg和Frederiksberg医院的诺和诺德基金会基础代谢研究中心的临床研究单位进行。
基于关于糖皮质激素诱导胰岛素抵抗的已发表数据，估计每天口服30毫克泼尼松龙七天足以诱导短暂且可逆的胰岛素抵抗。
很少有研究探索肌肉注射醋酸甲泼尼龙后对胰岛素敏感性和葡萄糖耐量的影响。然而，据报道，肌肉注射80毫克醋酸甲泼尼龙后，对内源性皮质醇释放的抑制至少持续14天，最大抑制出现在注射后三天。
基于文献发现，丹麦药品管理局建议并认可两种不同的糖皮质激素干预措施：1）每天口服一次30毫克泼尼松龙，持续七天，或2）仅在干预第一天肌肉注射80毫克醋酸甲泼尼龙，明知两种不同糖皮质激素化合物对胰岛素敏感性和葡萄糖代谢的药理学效应可能不完全一致。
在干预试验期间（2017年4月至2018年3月），参与者在相隔七天的两次访问中接受检查（图1B）。口服组（PO组）的参与者从第1天到第7天每天早晨早餐时口服30毫克泼尼松龙（5毫克+ 25毫克片剂，Prednisolone "DAK"，Orifarm Healthcare）。我们研究中使用的泼尼松龙片剂含有药理学上惰性的辅料，马铃薯淀粉、明胶、乳糖、硬脂酸镁和滑石粉，确保片剂的完整性和溶解。肌肉注射组（IM组）在臀大肌接受单次2毫升40毫克/毫升醋酸甲泼尼龙（Depo-Medrol，辉瑞）的肌肉注射，而对照组（对照组）在试验第一天在臀大肌接受2毫升生理盐水的肌肉注射作为安慰剂。Depo-Medrol的药理学惰性成分包括微量的聚乙二醇、吐温、磷酸盐缓冲液、苯甲醇、氯化钠和氢氧化钠。在本临床试验中，数据收集和分析未对实验条件进行盲法处理，但接受肌肉注射的两组（IM组和对照组）对参与者进行了盲法处理。在第一天，在糖皮质激素给药前进行血液和粪便采样以及宿主表型测定，作为干预前评估的基线测量值。
为确保PO组对口服泼尼松龙的依从性，指示参与者下载并使用智能手机应用程序："drug-reminder"。此外，每天向所有参与者发送短信，提醒他们即将进行的粪便样本收集。
生物临床评估
在预试验资格评估筛选和干预试验的第1天和第8天，研究参与者在临床单位的早晨空腹10小时后进行表型测定。生物临床评估的详细信息先前已有报道。人体测量包括体重和身高，体重指数（BMI）通过将体重（kg）除以身高的平方（m²）计算。在参与者以躺姿休息15分钟后，使用自动血压计测量收缩压和舒张压。测量重复三次，数值取平均值。
生物化学评估在Glostrup大学医院进行，包括使用酶促滑片测试分析的ALT，以及使用液相色谱测量的HbA1c。血浆肌酐和葡萄糖水平使用比色滑片测试确定，而胰岛素则通过免疫测定进行定量。血液白细胞群体计数使用流式细胞术进行，而超敏CRP水平则使用Image自动免疫测定系统（Beckman Coulter）测量。HOMA-IR指数根据Matthews等人的方法从空腹血浆葡萄糖和胰岛素浓度计算。Matsuda胰岛素敏感性指数根据OGTT期间获得的血浆葡萄糖和胰岛素浓度计算。在试验的第1天和第8天空腹状态下进行OGTT。参与者在五分钟内饮用250毫升冷水中含有75克葡萄糖的溶液。在OGTT期间，于0、30、60和120分钟抽取静脉血样，并分析血浆葡萄糖和血浆胰岛素浓度。血浆中各种细胞因子的水平在丹麦技术大学使用先前报道的方法进行测量。
粪便样本收集、肠道细菌细胞计数和粪便DNA提取
在干预的第1、2、4、6和8天收集粪便样本。采样按照国际人类微生物组标准指南（SOP 03 V1）进行。粪便在家中使用提供的工具包收集，并立即冷冻并储存在-20°C。在4-24小时内，样品被运送到哥本哈根大学的中央生物库，在-80°C储存。
使用染色和流式细胞术对粪便样本中的总细菌细胞计数进行测定。为确保细菌物种丰度的准确评估，使用细菌细胞计数数据进行定量微生物分析。使用NucleoSpin Soil DNA提取试剂盒（Machery-Nagel）按照制造商的协议从粪便样本的等分试样中提取DNA。
宏基因组测序
使用荧光计（Qubit荧光计，Invitrogen）测量DNA浓度。通过琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖凝胶浓度：1%；电压：150V，电泳时间：40分钟）检查样品的完整性。
量化和统计分析
数据以平均值±标准差（SD）表示。p值根据数据类型通过双尾Student's t检验或Wilcoxon检验计算。统计方法在图例中描述。所有统计分析和可视化均使用R（版本4.3.2）进行。鉴于我们队列组（每组n = 18-19）的统计功效有限，我们为探索性分析应用了FDR调整阈值，调整后的p值<0.1，优先考虑敏感性。
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