滞育是一种持久的韧性状态，使生物体能够度过逆境。秀丽隐杆线虫在饥饿诱导的成年生殖滞育（ARD）中可以存活数月，并在重新进食后再生和繁殖。我们发现ARD主调控因子hlh-30/TFEB突变体在ARD和重新进食过程中陷入一种类衰老状态，其特征为生殖干细胞的DNA损伤、核仁扩张、细胞周期停滞和线粒体功能障碍，同时伴随着免疫和生长代谢特征的失调，以及升高的衰老相关β-半乳糖苷酶和个体水平上的过早老化。通过正向遗传筛选，揭示了一个TFEB-TGFβ信号轴，该轴系统性地控制滞育、干细胞寿命和衰老，将营养供给与适当的代谢和生长信号对齐。值得注意的是，TFEB的关键作用在小鼠胚胎和人类癌症滞育模型中得以保存。因此，ARD提供了一个强大的体内模型，用于研究干细胞寿命和衰老，直接适用于哺乳动物。
为了更好地了解HLH-30在ARD和退出期间的作用，我们对hlh-30突变体进行了深入的表型分析，重点关注成年GSCs。GSCs是成年蠕虫中唯一已知的干细胞区室，其活性和分化由远端尖端细胞（DTC）生态位调控。在我们的研究中，观察到hlh-30突变体在ARD和恢复期间会进入一种类衰老状态。这一状态在秀丽隐杆线虫中以前未曾见过，具有多种哺乳动物细胞衰老的特征。
哺乳动物细胞衰老由DNA损伤、致癌基因激活、线粒体功能障碍和其他类型的细胞损伤触发。尽管衰老细胞具有异质性，但其典型特征包括细胞形态增大、核仁扩张、细胞周期停滞、增加的线粒体活性氧（ROS）、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性以及衰老相关的分泌表型，以及其他特征。
为了检查GSCs在hlh-30和N2野生型（WT）动物中的情况，我们将秀丽隐杆线虫诱导至ARD仅2-4天，以避免死亡的发生，通过显微镜检查性腺。此外，我们在ARD中保留了hlh-30突变体2天，然后进行1-2天的重新喂养来研究其反应。在WT中，ARD期间GSCs紧凑，而hlh-30 GSCs肿胀并含有扩大的核仁。在重新喂养时，WT GSCs迅速进入细胞周期，而hlh-30 GSCs未能做到这一点。重要的是，在长期（40天）处于ARD的WT动物中也观察到不可逆的细胞周期停滞和核仁扩张，这表明WT GSCs随着年龄增长也会经历类似的类衰老表型。
细胞周期停滞的一个常见原因是DNA损伤和双链断裂。为了评估GSCs中的DNA损伤，我们用抗RAD-51抗体染色了自由性腺，并使用SYGL-1共染色来可视化靠近DTC生态位的焦点。在充分喂养条件下维持并在辐射暴露下的对照WT动物中，GSCs中很容易看到DNA损伤焦点。相比之下，在没有辐射暴露的情况下经历ARD恢复的WT中未观察到此类焦点。有趣的是，在hlh-30突变体中，我们观察到在ARD恢复期间出现RAD-51焦点的动物比例升高，这表明hlh-30突变体可能经历更多的DNA损伤或具有较低效的DNA修复能力。
在生理条件下，线粒体根据细胞代谢需求在融合和分裂之间动态切换。在线粒体衰老或老化过程中，线粒体可能失去其动态灵活性，通常表现为融合，导致ROS种类增加。因此，我们在ARD和重新喂养期间检查了GSCs中的线粒体形态以及ARD期间的ROS产生。在WT中，线粒体从ARD期间的碎片化（较高球形度）转变为重新喂养后的融合（较低球形度）。相比之下，hlh-30突变体在ARD期间表现出更多融合的线粒体，重新喂养时融合程度较小。与此一致，我们观察到hlh-30突变体的氧化应激水平升高，这类似于培养中的衰老细胞。
在个体水平上，我们发现在ARD中的hlh-30突变体增加了SA-β-gal活性，这是反映溶酶体功能障碍的细胞衰老标志。重要的是，我们在充分喂养条件下未观察到SA-β-gal表达的变化。与此同时，我们观察到许多与个体老化及功能衰退一致的表型，包括咽泵活动和肌肉运动能力下降，以及通过BiT年龄算法测量的转录组年龄加速。
TFEB被认为是自噬的主要调控因子，自噬过程的失调会加速细胞衰老。为了了解自噬在ARD期间的潜在作用，我们检查了自噬循环和溶酶体ATPase功能的14个代表性突变体。这些突变体在ARD中保持10天，再喂养后测量恢复的繁殖动物比例和后代数量。总体而言，我们发现大多数突变（12/14）对繁殖动物的比例相比WT没有显著影响，除了epg-8/ATG-14L和atg-2/ATG-2A突变，它们降低了这一值。此外，与随意喂养对照相比，后代数量变化百分比很小，除了epg-8/ATG-14L突变显著减少了后代数量。推测这种异常行为是因为EPG-8/ATG-14L的非经典角色。我们得出结论，在HLH-30所需的时间框架内，经典自噬对于恢复并非必需。因此，其他HLH-30/TFEB目标过程必须有助于ARD干细胞长寿和恢复。
选择针对ARD类衰老状态揭示长寿和干细胞韧性途径
为了识别hlh-30下游的上位机制，我们对hlh-30(tm1978)突变体进行了乙基甲磺酸酯（EMS）诱变，并筛选出F2抑制子，至少存活20天，并在重新喂养后恢复和繁殖。全基因组测序显示，八个突变体在转化生长因子β（TGFβ）信号通路（daf-1/TGFβR，daf-3/SMAD4）、胰岛素-胰岛素样生长因子（IGF）信号通路（pdk-1/PDPK1，akt-1/AKT激酶，daf-2/胰岛素/IGF受体）和cGMP信号通路（tax-4/CNGA1/CNGA2）中存在病变，后者调节纤毛神经元中的TGFβ和胰岛素样肽的生产。这些基因的突变会影响第三幼虫阶段的滞育形成，表明ARD机制与滞育有重叠。其余七个突变体未被识别，因为它们未清晰映射到一个独特的基因座。
鉴定的候选基因通过使用独立参考等位基因验证了hlh-30 ARD救援效果。我们还测试了daf-7(e1372)/TGFβ突变体，看到了类似的救援效果。值得注意的是，hlh-30 daf-1双突变体相对于hlh-30的平均寿命相对倍增率通常较大（>3.2-4.1倍），而daf-1单突变体相对于WT的倍增率较小（1.1-1.2倍），表明TGFβ信号在ARD中与hlh-30有更具体的相互作用。这些突变还挽救了其他hlh-30相关的特性，即ARD体型和生殖ARD恢复。鉴于生殖能力的有效恢复作为GSC健康的间接读数，我们主要专注于进一步研究TGFβ信号。
为了揭示TGFβ信号如何影响hlh-30 ARD崩溃，我们首先检查了遗传上位相互作用。在随意喂养条件下，DAF-7/TGFβ配体主要从ASI感觉神经元分泌，并通过TGFβ I型和II型受体DAF-1和DAF-4在全身发挥作用。这反过来激活了阳性臂DAF-8和DAF-14/r-SMADs，抑制了阴性臂DAF-3/SMAD4-DAF-5/SNO-SKI复合物在DTC和其他目标组织中的抑制活性，以促进生长状态。在禁食条件下，TGFβ信号较低，DAF-3/DAF-5解除抑制以促进静止状态。我们观察到daf-1引起的hlh-30寿命延长依赖于下游转录因子daf-3/SMAD4、daf-5/SNO-SKI和daf-16/FOXO，这是另一个减少TGFβ信号的中介。与daf-3(e1376)无效突变不同，该突变废除了daf-1依赖的生存能力并且形成滞育缺陷（Daf-d），从我们的遗传筛选中获得的daf-3(syb2718)等位基因表现相反；它恢复了hlh-30生存能力和繁殖能力，并且单独形成滞育常现（Daf-c）表型，表现为半显性功能获得突变。有趣的是，改变的氨基酸（p.Glu853Lys）位于MH2域内，预计会破坏与r-SMADs的抑制性相互作用，解耦DAF-3/SMAD4活性与上游输入。最后，我们测试了daf-12/VDR，它是胆汁酸样类固醇信号转导的重要下游转录调节因子，但对于滞育形成至关重要，但我们发现它不是必需的，这与幼虫滞育和ARD韧性调控中既有共同点又有不同之处。
HLH-30响应营养信号调节TGFβ信号
上述遗传上位实验表明，HLH-30(+)可能会在ARD期间下调TGFβ信号。为了直接验证这一想法，我们在ARD和重新喂养期间测量了ASI神经元中HLH-30的核定位和DAF-7/TGFβ配体的表达。这些神经元分泌TGFβ，作为内分泌来源，调节全身目标组织中的TGFβ受体信号。我们观察到HLH-30::mNeonGreen在ARD诱导后2小时内迅速进入ASI神经元的细胞核，在早期ARD期间持续存在，并在重新喂养后迅速退出。与营养依赖性调节一致，DAF-7p::GFP在WT ARD期间下调，但在重新喂养时上调。在hlh-30突变体中，DAF-7p::GFP的动态调节则相反：在ARD期间上调，对重新喂养无反应。有趣的是，我们在ARD期间在外唇OLQ神经元中也观察到了低水平的DAF-7p::GFP表达，而在随意喂养条件下未见此现象，且其调节也受到hlh-30的影响，表明这些神经元内的ARD特异性调节。总之，我们的结果表明，HLH-30(+)部分地下调了ASI神经元中daf-7的表达，以响应营养信号。
为了测试HLH-30是否直接转录调控TGFβ信号成分，我们在ARD期间进行了染色质免疫沉淀结合定量PCR（ChIP-qPCR），下拉HLH-30::FLAG并测试了预测HLH-30结合位点上的候选启动子富集。我们发现daf-14和daf-5启动子处显著富集了HLH-30占据。相应地，我们看到hlh-30突变在ARD期间显著上调了daf-14并下调了daf-5 mRNAs，证实HLH-30通过抑制正面路径和促进负面路径直接抑制ARD期间的TGFβ信号。我们的发现也得到了现有酵母单杂交数据和hlh-30 ChIP-seq在daf-2(e1370)背景下的支持。我们未观察到daf-7或daf-1启动子处的富集。这一观察可能是由于调控主要发生在单个细胞中，占有率可能低于检测限，或者结合发生在测试区域之外，或者调控是间接的。daf-7/TGFβ或daf-1/TGFβRI突变显著挽救hlh-30 ARD寿命崩溃和其他特征的事实，加上失控的转基因表达，表明HLH-30在多个层次上调控TGFβ途径，从ASI神经元开始，通过系统机制在整个身体中发出信号。
生长信号的调控保护免受类衰老状态
秀丽隐杆线虫的GSCs主要由Notch信号调控，该信号从DTC生态位传递到干细胞池。DTC本身形成一个帽状结构围绕GSCs，并延伸长的突起以扩展活化区域。在随意喂养条件下，DTC生态位中表达的Delta/Serrate/LAG-2 (DSL)配体结合到相邻GSCs中的GLP-1/Notch受体，以促进包括sygl-1在内的靶基因表达，从而引发干细胞活化和有丝分裂，并防止过早的减数分裂。
考虑到TFEB-TGFβ对后代生成的影响，我们想知道它是否相应地影响Notch信号和性腺结构，从而影响ARD和恢复期间的GSC功能。特别是，我们假设在hlh-30突变体中，从神经元到DTC增加的TGFβ信号可能导致Notch信号在ARD期间解除抑制，并驱动GSCs进入一种类衰老状态。如果真是这样，那么daf-1/TGFβ突变应该会产生显著的救援效果。我们测量了三个参数：DTC（生态位）中的lag-2p::mKate2::PH表达水平、DTC长突起扩展（生态位矩阵重塑）和sygl-1::3xFlag丰度（GSCs）作为Notch活性的代理指标。在WT中，我们观察到所有三个参数在ARD期间都降低，而在恢复期间增加，分别符合静止期间Notch信号的下调和激活期间的上调。相比之下，hlh-30突变体在ARD期间表现出比WT更高的lag-2p::mKate2::PH和sygl-1::3xFlag表达水平，但在恢复期间未能扩展DTC突起，并限制sygl-1::3xFlag表达，表明hlh-30失活在静止和激活期间都会使生态位和干细胞中的Notch信号失调。值得注意的是，daf-1突变逆转了hlh-30诱导的Notch失调特征，暗示HLH-30通过TGFβ调控Notch信号，以促进GSC的韧性。
值得注意的是，增强的Notch和TGFβ信号都被认为是衰老细胞的标志，表明它们在hlh-30突变体中的失调可能会导致一种类衰老状态。特别是，我们想知道daf-1突变是否能够保护免受其他如图1中描述的hlh-30诱导的类衰老表型。确实，daf-1缺失足以恢复hlh-30突变体的GSC核仁面积、有丝分裂、DNA损伤状态、转录组年龄、SA-β-gal表达、泵动活性、肌肉健康和线粒体ROS。
除了生理变化外，我们还在ARD和重新喂养期间观察到hlh-30突变体与WT或hlh-30 daf-1相比的大量转录组变化。我们认为hlh-30/WT下调的基因在hlh-30 daf-1/hlh-30中可能上调，反之亦然，我们发现ARD和重新喂养（REF）期间有大量的差异表达基因（DEGs）呈负相关。我们主要发现hlh-30中代谢和生长过程的失调，并在hlh-30 daf-1突变体中得到逆转，突显了TFEB-TGFβ轴在ARD期间代谢重塑中的重要性。值得注意的是，ARD DEGs在hlh-30/WT中显著上调，并被daf-1挽救，包括先天免疫反应，这与衰老中增加的炎症信号类似。与从hlh-30突变体的GSCs中观察到的增加的RAD-51焦点一致，我们可以在转录组数据集中检测到DNA损伤反应的特征。有趣的是，我们发现hlh-30上调的重新喂养DEGs与SenMayo基因集显著重叠，这些基因是与衰老相关的核心基因。
总之，我们的结果与以下观点一致：ARD在hlh-30突变体中诱导了一种类似于细胞衰老的异常细胞和机体静止状态，取决于TGFβ信号。基于之前的工作，我们将HLH-30和生长调控途径纳入一个工作模型：响应ARD进入，HLH-30(+)通常在ASI感觉神经元和DTC生态位中下调TGFβ，导致较低的TGFβ信号和激活DAF-5-DAF-3抑制复合物。HLH-30还直接下调daf-14/SMAD3并上调daf-5/Sno-Ski，加强了对该通路的抑制。因此，生态位中下调的lag-2/DSL降低了Notch信号，导致生殖静止。恰当调控这一信号级联确保了休眠期间的干细胞韧性和重新喂养后的干细胞池恢复。在hlh-30突变体中，营养信号、代谢和生长信号调控之间的不协调，使得TGFβ和Notch在滞育期间不适当地升高，触发了一种类似于哺乳动物衰老的状态。
TFEB控制哺乳动物滞育模型中的韧性
接着我们想知道TFEB在哺乳动物滞育模型中的作用是否保守，包括小鼠胚胎滞育和人类癌细胞休眠。这些滞育状态可以通过INK128（一种mTOR-PI3K双重抑制剂）在体外模拟。
从小鼠胚胎干细胞（mES）的全基因组CRISPR-Cas9筛选中，我们确定TFEB是滞育存活的主要决定因素。特别是，我们使用了一个四环素诱导的Cas9系统，在增殖对照mES细胞或INK128诱导的滞育mES细胞中激活，两组均携带全基因组短引导RNA（sgRNA）文库。sgRNA的相对丰度计算为Cas9诱导前后的比率，并在sgRNA编辑后3天对滞育mES细胞和增殖mES细胞进行分析。TFEB在Cas9激活后明确耗尽于滞育群体中，表明其在滞育存活和韧性中可能存在作用。为了在非筛查条件下确认这些发现，我们通过短干扰RNA（siRNA）介导的敲低针对性地处理了TFEB。一致地，TFEB siRNA显著降低了mES细胞的存活率39.4%。这些数据表明TFEB对于滞育mES细胞的存活至关重要，但对增殖mES细胞并不必要。同样，在秀丽隐杆线虫中，hlh-30突变对随意喂养条件下的WT存活几乎没有影响，但对ARD至关重要。
在秀丽隐杆线虫中观察到的系统性调控可能在概念上类似于小鼠的异时性共生实验，其中循环因子（例如，TGFβ亲属如GDF15和肌抑素）在不同生理状态下调节干细胞功能。虽然异时性共生通常以“年轻”和“老化”分子环境为框架，但许多这些系统因子通过不同的表达水平而不是内在的老化特征发挥功能。同样，老年运动小鼠的血浆已被证明可以将年轻化效应转移到久坐的老年小鼠，增强神经发生和认知功能，通过肝脏衍生的循环因子如Gpld1。这些发现表明，无论由年龄、运动还是像禁食-重新喂养这样的代谢状态驱动，信号的系统性变化都可以跨物种调节韧性和再生。
总结起来，我们的研究表明TFEB-TGFβ轴是一个原始电路，系统性地调节韧性、干细胞动力学和衰老。进一步研究ARD可能提供关于衰老及其逆转动态的独特分子见解。
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