摘要
自噬是一种在进化中保守的分解代谢过程，参与突触功能和神经元存活的基本方面。外泌体是介导细胞间通信的细胞外囊泡，包括新兴作用介导脑部细胞间信号传导、突触功能和神经元存活。事实上，自噬和外泌体释放相互影响，但这种互作在神经突触中，特别是在神经退行性疾病背景下，尚未得到充分描述。本文报道，在突触前区室，自噬蛋白Atg18a/WIPI2在多囊体小体水平上调控外泌体释放。帕金森病突触素蛋白(Synaptojanin)中的R258Q突变抑制了突触自噬，导致运动障碍、癫痫和神经退行性变。我们发现该突变也减少了外泌体释放，而在突触素突变动物中多巴胺能神经元过表达Atg18a可恢复外泌体释放、运动能力和多巴胺能神经元存活，而无需恢复突触自噬。我们的数据报道了Atg18a在调控外泌体释放中的新功能，并揭示了外泌体释放在帕金森病发病机制中的作用。
引言
自噬是一种分解代谢通路，对神经元存活以及蛋白质、脂质和细胞器的降解和再循环至关重要。在突触前区室，突触自噬通过降解成分维持突触稳态，从而调节不仅局部蛋白质稳态，还调控神经递质传递、突触发育和可塑性(Gupta et al., 2016; Hernandez-Diaz et al., 2022; Hernandez et al., 2012; Hoffmann-Conaway et al., 2020; Kiral et al., 2020)。有趣的是，自噬受代谢和神经元刺激等局部神经元刺激调节，这些刺激可调节突触前富含蛋白质(Hardemosi et al., 2023; Soukup et al., 2016; Vanhauwaert, Kuenen, Masius, Bademosi, Manetsberger, Schoovaerts, Bounti, Gontcharenko, Swerts, Vilain, Picillo, Barone, Munshi, Vrij, Kushner, Gounko, Mandemakers, Bonifati, Meunier, Soukup, Verstreken, et al., 2017)。全面了解自噬如何调控与脑部稳态和通信相关的其他过程，对于充分理解自噬在脑部健康和疾病中的功能至关重要。外泌体是源自内体区室的细胞外囊泡，可通过细胞外空间运输RNA物种(如miRNA)、DNA、蛋白质和脂质(Chivet et al., 2013; Miranda et al., 2018; Prada et al., 2018; Ghanam et al., 2022)。外泌体已被描述为细胞间通信的机制(Chivet et al., 2013)。有趣的是，有证据支持外泌体在神经系统疾病中的新兴作用，尽管尚未得到充分理解(Grad et al., 2014; Papadopoulos et al., 2018; Rajendran et al., 2006; Wang et al., 2017)，以及作为突触活动和可塑性、神经发生、神经再生和神经元存活功能的调节剂(Chiang et al., 2021; Ching & Kingham, 2015; Frühbeis et al., 2013; Lachenal et al., 2011; Sharma et al., 2019; Spelat et al., 2022)。此外，外泌体可能还作为中枢神经系统中的废物处理机制(Chen et al., 2001; Lopez-Verrilli et al., 2013; Yuyama et al., 2015)，突显了外泌体作为神经元健康调节剂的作用。内体-溶酶体系统和自噬系统的改变在神经退行性疾病中很常见(Aman et al., 2021; Friedman et al., 2012; Hernandez-Diaz & Soukup, 2020; Komatsu et al., 2006; Liang et al., 2010; Nixon & Rubinsztein, 2024; Sanchez-Mirasierra et al., 2022)，这些扰动可通过重新分配功能失调和潜在毒性蛋白来影响外泌体内容物(Izco et al., 2022; Miranda et al., 2018)。
突触是神经元的通信中心。精确调节蛋白质供应以及消除无功能或有毒蛋白质是维持神经元通信期间突触功能所必需的。有趣的是，在神经退行性疾病中，突触前毒性蛋白积累和突触功能障碍被报道早于神经元损失(Burke & O'Malley, 2013; Cheng et al., 2010; Hornykiewicz, 1998; Kramer & Schulz-Schaeffer, 2007)。这些观察结果支持自噬和外泌体释放可能协同维持脑部稳态和神经元功能及存活的观点。相反，自噬损伤可能破坏外泌体释放(数量和/或内容物)，恶化神经元存活并促进神经退行性疾病进展(Xu et al., 2018)。突触自噬是一个新兴领域，远未完全理解。特别是自噬与突触处外泌体释放的串扰尚未得到充分描述，这种互作在神经退行性疾病的发病和进展中是否起作用在很大程度上是未知的。有趣的是，外泌体的亚细胞起源可能决定外泌体的命运和内容物(Yokoi et al., 2019)，但突触起源的外泌体如何发挥与突触功能或神经元存活相关的功能尚未得到充分表征。实际上，特别在病理条件下连接外泌体释放和突触自噬的分子机制目前仍缺失。
外泌体和自噬体生物发生有共同的细胞成分(Puri et al., 2018; Xu et al., 2018; Zubkova et al., 2024)。例如，内体-溶酶体系统对内泌体生物发生至关重要，但也参与自噬。这通过多囊体小体(MVB)参与得到进一步支持，MVB是内体的一种特化形式，蛋白质分类发生于此。MVB实际上在自噬体成熟过程中参与自噬体(Van et al., 2008)，而包含腔内囊泡的MVB与质膜融合也会导致腔内囊泡作为外泌体释放到细胞外空间。在非神经元细胞中，使用氨基酸剥夺诱导自噬似乎抑制外泌体释放，而抑制自噬则有利于该过程(Fader, Sanchez, et al., 2008; Villarroya-Beltri et al., 2016)。然而，科学文献也报道了抑制肝细胞自噬实际上阻断外泌体释放的情景(Shrivastava et al., 2016)。因此，自噬对外泌体释放的影响仍不清楚，似乎是非常特定于环境的。
突触前终端依赖于高效的蛋白质分类和再循环以实现其正确功能。此外，有证据表明突触功能障碍早于神经退行性疾病中的神经元损失。不幸的是，自噬和外泌体释放之间在神经退行性疾病中的突触处互作仍然在很大程度上是神秘的。此外，我们对突触自噬失调如何影响外泌体释放以及外泌体-自噬互作功能障碍是否是神经退行性疾病的根源知之甚少，因为关于神经元和突触前区室中这种互作调节的详细研究仍然缺失。
本文中，我们表明在健康条件下，自噬和外泌体释放在突触前终端相互关联，并鉴定出自噬核心蛋白Atg18a(无脊椎动物WIPI2同源物)在多囊体小体和外泌体生物发生中的新功能。此外，在病理条件下，我们表明增加Atg18a蛋白水平可挽救携带突触蛋白突触素(Synj^R258Q)帕金森病突变动物中外泌体释放的改变、运动障碍、癫痫样行为和多巴胺能神经元退化。本工作首次连接了自噬改变如何影响突触处外泌体释放，并在帕金森病背景下探索了这种互作的后果。
结果
自噬调控突触前终端的外泌体释放
外泌体相对较小的尺寸和神经系统的复杂解剖结构使得外泌体释放分析特别具有挑战性。然而，果蝇幼虫的神经肌肉接头(NMJ)的突触前区室与肌肉突触后区室非常明确区分，这使得NMJ成为研究和量化来自神经元突触前区室外泌体释放的极佳模型系统(Sanchez-Mirasierra et al., 2021)。为了监测外泌体释放，我们在运动神经元中特异性表达外泌体标记物Evenness Interrupted fused with GFP (Evi^GFP)，并用抗体(抗HRP)标记突触前区域(图1A,A')，该抗体识别果蝇中的神经元膜(Jan & Jan, 1982)。使用UAS-Gal4表达系统和运动神经元特异性驱动器(D42-Gal4)可实现在突触前侧运动神经元中的特异性表达，而在突触后侧肌肉中无表达。在突触内检测到的Evi^GFP信号对应于多囊体小体(MVB)内含有外泌体前体的腔内囊泡。因此，我们还可以清楚地检测到位于突触膜外标记突触前区室外空间的外泌体释放的Evi^GFP信号(图1A", 黄线标记HRP信号的极限)。为了分析外泌体释放，我们量化了NMJ处突触前区室外泌体标记的细胞外空间中的Evi^GFP荧光。
我们首先询问自噬诱导是否改变外泌体释放。先前研究表明，自噬体形成可在不同信号如氨基酸剥夺和神经元活动下在突触前终端诱导。我们发现氨基酸剥夺4小时后，自噬诱导减少了与喂食对照动物相比的外泌体释放(图1A-C)。接下来，我们测试了神经元活动是否也类似氨基酸剥夺，通过神经元活动诱导自噬影响外泌体释放。因此，我们使用基因编码的果蝇温度敏感型TRPA1 (dTrpA1)阳离子通道来诱导神经元刺激和活动。dTrpA1在运动神经元中特异性表达和激活可在果蝇转移到30°C时迅速诱导自噬。我们在运动神经元中共表达外泌体标记物EVI^GFP和dTrpA1。与之前结果类似，神经元激活诱导的自噬也减少了突触前区室外泌体释放(图1D-F)。我们通过使用能通过打开L型钙通道激活突触自噬的药物Nefiracetam和钙来进一步确认这些结果(Bademosi et al., 2023; Nishizaki et al., 1998; Yoshii et al., 2000; Yoshii & Watabe, 1994)。与结果一致，我们观察到通过Nefiracetam诱导的自噬也会导致NMJ突触处的外泌体释放减少(图1G-I)。综上所述，我们的结果表明自噬和外泌体释放在线粒体接头处相互关联，自噬的激活通过不同刺激(如代谢和神经元活动)导致NMJ突触处外泌体释放水平降低。
为了进一步验证我们的发现，我们利用创新的纳米颗粒荧光流式细胞术(NanoFCM)方法分析了果蝇成年脑神经元释放的荧光标记外泌体。使用我们的设置，NanoFCM流式细胞仪允许检测30至200nm范围的颗粒和荧光信号的同时检测。为了特异性分析神经元外泌体并将其与胶质细胞外泌体区分开，我们在发育良好的果蝇泛神经元驱动器(C155)下表达EVI^GFP。通过组合超速离心和蔗糖梯度从果蝇成年脑中分离外泌体。野生型果蝇和在神经元中表达EVI-GFP外泌体标记物的果蝇提取的外泌体分析表明，NanoFCM可以特异性检测神经元外泌体(14.1%总信号)，而野生型仅检测到GFP背景信号(图1J,J')。我们详细分析了不同外泌体组分，发现第五和第六组分含有最高量的GFP阳性外泌体(图1J", J"')。使用抗外泌体标记物CD63和CD9抗体标记第五和第六组分外泌体后，通过NanoFCM分析显示，提取的外泌体对这两种标记物均为阳性(图1K,K')，确认了这些细胞外囊泡的身份为外泌体。通过电子显微镜观察该组分，我们观察到外泌体的典型形状，尺寸小于200nm(图1L,L')，符合报道的外泌体尺寸。
为了解自噬如何与外泌体释放相关联，我们进行了候选基因筛选方法，敲低各种自噬核心蛋白，这些蛋白在自噬途径的不同步骤中发挥作用，采用逐步靶向方法从自噬泡形成的初始成核步骤开始，并量化突触处外泌体释放的变化。我们观察到Atg17/FIP200的敲低，一种在初始成核步骤中起作用的ULK复合体的成分，导致外泌体释放显著减少(图2A-B)。同样，需要用于生长自噬泡扩展的自噬蛋白Atg18，也导致外泌体释放显著减少(图2C-D)。自噬泡生长的闭合依赖于介导自噬体膜结合Atg8的自噬蛋白Atg3。我们观察到Atg3的敲低也导致外泌体释放显著减少(图2E-F)。Atg16作为自噬泡扩展中的复合体的一部分，我们观察到Atg16的敲低导致外泌体释放显著减少(图2G-H)。一旦自噬体形成，自噬体与溶酶体融合降解自噬底物。我们想知道是否阻断自噬体与溶酶体的融合也影响外泌体释放。氯喹处理已被证明通过阻断果蝇NMJ处自噬体与溶酶体的融合，抑制自噬通量。有趣的是，氯喹处理未影响NMJ突触处的外泌体释放(图2I-J)，表明自噬体与溶酶体的融合不影响外泌体释放。相反，我们的结果可能表明，自噬泡形成过程中发挥作用的蛋白也可能在囊泡生物发生过程中起作用。自噬体成熟需要与晚期内体融合(Jäger et al., 2004; Takáts et al., 2013)，这在突触处也是真实的，自噬体与晚期内体融合。有趣的是，多囊体小体(MVB)，一种特化的晚期内体类型，产生外泌体。因此，自噬和外泌体释放机制都依赖于晚期内体/MVB的可用性。我们推理与MVB和自噬体生物发生相关的蛋白可能是自噬和外泌体释放之间的分子联系，作用于该水平的分子可能控制自噬体成熟和囊泡形成之间的平衡。我们使用Pearson相关性分析不同自噬核心蛋白与Evi^GFP或Evi^mCherry阳性点(对应产生外泌体的MVB)的共定位。我们未检测到Atg8^mCherry、Atg3^HA、Atg16^HA和Atg17^GFP与Evi标记物的显著重叠(图2K,L,M,N-和P)。然而，我们发现Atg18^GFP和Evi^mCherry阳性点(MVBs)存在显著共定位(图2O和P)，表明Atg18a可能在MVB水平上具有外泌体释放的新功能。
Atg18a蛋白水平对囊泡释放至关重要
自噬核心蛋白Atg18a(人类WIPI2的同源物)已被证明对自噬体形成至关重要(Proikas-Cezanne et al., 2015)，在突触前终端，Atg18a功能对自噬体成熟是必需的(Vanhauwaert, Kuenen, Masius, Bademosi, Manetsberger, Schoovaerts, Bounti, Gontcharenko, Swerts, Vilain, Picillo, Barone, Munshi, Vrij, Kushner, Gounko, Mandemakers, Bonifati, Meunier, Soukup, Verstreken, et al., 2017)。为进一步确认Atg18a在突触处的外泌体释放中具有附加功能，我们分析了Atg18a基因敲除果蝇，与Atg18a敲低类似，Atg18a缺失(w;; atg18a^-/-)导致突触神经元的外泌体释放显著减少(图3A-C)。因此，在运动神经元中过表达Atg18a (w;;Atg18a^HA)导致突触处外泌体释放增加(图3D-F)。我们的数据表明Atg18a是外泌体释放的正向调节因子，Atg18a蛋白水平对囊泡生物发生至关重要。
Atg18a在多囊体小体生物发生中的功能
MVB的生物发生对外泌体释放至关重要，MVB与质膜融合的数量决定了细胞外空间中外泌体的数量(Lauwers et al., 2018)。因此，我们想知道Atg18a是否在MVB的生物发生中起作用或促进MVB与质膜的融合。
使用共聚焦显微镜，我们观察到Atg18a过表达导致Evi^mCherry阳性MVB数量增加(图3G,H和K)。果蝇Atg18a和哺乳动物同源物WIPI2折叠成七叶β-丙螺旋桨结构，使Atg18能够通过特异性结合磷脂酰肌醇PI3P和PI(3,5)P2来与前自噬体膜或其他细胞器的膜脂结合(Proikas-Cezanne et al., 2015)。有趣的是，Atg18与PI3P的结合促进自噬，有证据表明属于WIPI蛋白家族的蛋白也可以通过与PI(3,5)P2的相互作用来结合内体膜(De Leo et al., 2021)。为深入了解Atg18a在外泌体释放中的分子功能，我们想知道Atg18a在外泌体释放中的功能是否取决于对MVB膜上PI3P和PI(3,5)P2的识别。为此，我们通过给动物喂食药物Wortmanin或Vacuolin-1分别抑制PI3P产生酶Vps34和PI(3,5)P2产生酶Pikfyve来降低这些磷脂酰肌醇的水平(Scott et al., 2004; Vanhauwaert, Kuenen, Masius, Bademosi, Manetsberger, Schoovaerts, Bounti, Gontcharenko, Swerts, Vilain, Picillo, Barone, Munshi, Vrij, Kushner, Gounko, Mandemakers, Bonifati, Meunier, Soukup, Verstreken, et al., 2017)。我们观察到Wortmanin处理Atg18a过表达果蝇导致Evi^mCherry阳性点数量减少至野生型动物水平(图3I, K)。相反，用Vacuolin-1处理那些果蝇并未显著降低Evi^mCherry阳性点(图3J, K)。综上所述，这些结果表明Atg18a通过PI3P结合对Evi阳性MVB生物发生至关重要。
外泌体释放受帕金森病突触素突变影响
先前研究表明，Atg18a/WIPI2与突触前蛋白突触素(Synj)相关联(Vanhauwaert, Kuenen, Masius, Bademosi, Manetsberger, Schoovaerts, Bounti, Gontcharenko, Swerts, Vilain, Picillo, Barone, Munshi, Vrij, Kushner, Gounko, Mandemakers, Bonifati, Meunier, Soukup, Verstreken, et al., 2017)。人类同源物SYNJ1中的突变导致帕金森病(Krebs et al., 2013)。在NMJ突触处，Synj/SYNJ1通过Atg18a/WIPI2对自噬体形成至关重要，表达帕金森病致病突变R258Q的突触素(Synj^R258Q)导致自噬体成熟阻滞，产生Atg18a阳性未成熟自噬体累积(Vanhauwaert, Kuenen, Masius, Bademosi, Manetsberger, Schoovaerts, Bounti, Gontcharenko, Swerts, Vilain, Picillo, Barone, Munshi, Vrij, Kushner, Gounko, Mandemakers, Bonifati, Meunier, Soukup, Verstreken, et al., 2017)。因此，我们想知道帕金森病突触素突变是否也影响外泌体释放。我们使用NanoFCM方法通过量化果蝇成年脑神经元的EVIS^GFP荧光标记外泌体，分析病理状态Synj^RQ对神经元外泌体释放的影响。我们观察到从Synj^RQ (C155>Evi-GFP, Synj^RQ)和对照(C155>Evi-GFP)脑中分离的外泌体具有相似的形态和尺寸分布(图4A, A')和NanoFCM流式细胞仪(图4C, C')。有趣的是，NanoFCM测量显示与对照果蝇相比，Synj^RQ果蝇中Evi^GFP阳性外泌体显著减少(图4B, D)。这种减少并非由Synj^RQ对照脑中Evi^GFP阳性外泌体的尺寸变化引起(图4E)。分析不同外泌体组分表明，从Synj^RQ对照脑中分离的Evi^GFP阳性外泌体分离相似，主要集中在第六组分(图4F)，且不同组分中外泌体尺寸无显著差异(图4G)。综上，我们的结果表明Synj^RQ突变脑中的外泌体释放减少，并非由外泌体形态或尺寸的任何变化引起。
为确认Synj^RQ是否影响突触前终端的外泌体释放，我们通过共聚焦显微镜分析NMJ突触处的外泌体释放。我们观察到与NanoFCM分析类似，携带Synj^RQ突变的突触前终端释放显著更少的外泌体(图4, H-I, K)。因此，过表达Atg18a (Synj^RQ; Atg18a^HA)可恢复突触素突变动物中的外泌体释放至野生型果蝇水平(图4, J-K)。
过表达Atg18a挽救Synj^RQ相关的运动功能障碍
帕金森病通常在运动症状出现时诊断，此时中脑黑质致密部(SNc)中约30%-70%的多巴胺能(DA)神经元已经退化(Fearnley and Lees, 1991; Cheng et al., 2010; Giguère et al., 2018)。为深入理解外泌体释放改变如何导致神经元功能障碍和神经退行性变发病，我们决定研究Atg18a过表达如何影响运动功能障碍，这是与帕金森病相关的主要功能障碍。为分析运动功能，我们执行负向趋地性试验，该试验在具有运动功能障碍的果蝇疾病模型中先前已得到验证(Feany & Bender, 2000)。如预期，Synj^RQ突变动物与对照动物相比运动显著减少(图5, A)。有趣的是，Synj^RQ中的运动功能障碍可通过多巴胺能神经元中Atg18a的过表达(Synj^RQ; Atg18a^HA< TH-Gal4)得到挽救。帕金森突变R258Q在SYNJ1患者中除了运动症状外，还表现出癫痫发作(Hardies et al., 2016; Krebs et al., 2013; Quadri et al., 2013)。在果蝇中，研究报道了对机械刺激或"bang试验"的应激敏感癫痫发作样行为和瘫痪突变(Fergestad et al., 2006)。因此，我们使用bang敏感性试验分析Synj^RQ突变动物中是否也观察到机械诱导的癫痫发作样行为。有趣的是，表达Synj^RQ PD突变的动物在癫痫发作样行为后恢复时间显著长于对照动物(图5, B)。此外，多巴胺能神经元中Atg18a的过表达能够挽救Synj^RQ突变动物中观察到的癫痫样行为，因为这些果蝇的恢复在统计上与对照果蝇无显著差异(图5B)。我们进一步执行了混合癫痫-运动试验，将bang试验和负向趋地性试验结合，以量化癫痫敏感性和运动表现。结果表明，与对照果蝇相比，Synj^RQ果蝇在癫痫发作后启动运动大大延迟，而Synj^RQ突变果蝇多巴胺能神经元中Atg18a的过表达也改善了癫痫发作后运动(图5B')。综上所述，我们的结果表明，Synj^RQ突变动物表现出运动缺陷和癫痫样行为，这些缺陷可通过多巴胺能神经元中Atg18a的过表达恢复，将Atg18a改变与帕金森病的核心症状联系起来。帕金森病的一个标志是多巴胺能神经元的丧失。果蝇是研究多巴胺能神经元丧失的极佳模型，因为成年脑中多巴胺能神经元组织在解剖簇中。此外，我们先前已证明Synj^RQ突变果蝇中多巴胺能神经元簇PPM3和PPM1的神经元变性。本文表明，10天龄Synj^RQ的PPM3和PPL1神经元簇中多巴胺能神经元丧失可通过多巴胺能神经元中过表达Atg18挽救(图5C',C")。然后，我们测试了Atg18a是否通过外泌体释放或自噬恢复Synj^RQ功能障碍。先前研究表明，在Synj^RQ突变动物中突触自噬诱导受阻。为监测自噬，我们在运动神经元中表达自噬标记物Atg8^mCherry。在基础条件下，仅观察到少量自噬体(Atg8^mCherry阳性点，箭头)，但Atg18a的过表达导致自噬水平显著增加(图5, D, D"', E)。然而，我们未观察到Atg18a过表达在Synj^RQ突变动物中增加自噬(图5, D, D', D", D"', E)。这些结果表明，尽管Atg18a过表达在野生型果蝇中诱导自噬并增加外泌体释放，但在Synj1^RQ PD突变果蝇中并非如此，其中Atg18a过表达仅恢复外泌体释放。因此，我们的结果表明通过过表达Atg18a增加外泌体释放足以恢复Synj^RQ突变动物中帕金森病相关功能障碍。
讨论
外泌体参与神经系统中的细胞间通信，支持神经元功能、发育甚至病原蛋白处置，自噬也是如此。有趣的是，自噬的某些刺激，如营养缺乏、钙浓度甚至神经元活动似乎也调节外泌体释放。突触前终端是高度动态的区室，依赖于突触组分的持续周转以维持神经递质传递。因此，有效蛋白质分类和再循环对于维持突触蛋白质稳态至关重要，突触蛋白质稳态缺陷可能导致突触功能障碍。结合突触功能障碍在许多神经退行性疾病中早于神经元丧失的观察，调节突触蛋白质稳态的过程功能障碍可能是神经退行性变的根源。自噬以及突触前终端的外泌体释放与突触组分的分类和降解密切相关(Blanchette et al., 2022)(Kiral et al., 2020)。因此，阐明突触前终端自噬和外泌体释放的功能和调节对于理解这些过程如何参与突触功能、神经退行和脑部病理至关重要。不幸的是，科学文献中报道了自噬诱导对外泌体释放过程的相反影响，表明这些途径之间的串扰是一个复杂且依赖环境的过程。本文中，我们阐明了自噬如何在体内调节突触前区室处的外泌体释放。我们的工作表明，在突触处，自噬的激活导致外泌体释放减少。这对于通过氨基酸饥饿和神经元活动诱导自噬都是正确的，表明这些途径之间的互作可由作用于自噬的核机制介导，而非特定调节器。为更深入了解这种互作，我们还测试了阻断自噬的不同步骤如何影响外泌体释放。证据表明，抑制溶酶体酸化，自噬中调节自噬体与溶酶体融合的关键步骤，可增加通过外泌体的APP分泌(Miranda et al., 2018)。因此，我们想知道阻断自噬的最终步骤是否导致突触处释放更多外泌体。然而，当我们使用氯喹阻断溶酶体酸化和自噬溶酶体形成时，未检测到从突触区室分泌的外泌体数量的显著变化。这表明，至少在突触前终端的生理条件下，阻断自噬体与溶酶体的融合不影响外泌体释放。接下来，我们研究了自噬途径初始步骤，即自噬泡生物发生，的中断如何影响外泌体释放。自噬核心蛋白Atg17、Atg18、Atg3和Atg16参与自噬泡生物发生的不同步骤，这些蛋白的减少也导致突触前区室外泌体释放减少。这表明自噬在突触前终端的早期步骤如自噬泡的起始和成核对于外泌体生物发生或释放至关重要。这些结果进一步表明突触前终端自噬的中断可能与外泌体释放缺陷相关或促成其缺陷。
自噬和外泌体释放共享MVB作为共同细胞器，MVB不仅存在于神经元胞体中，也存在于突触中。有趣的是，我们测试的参与外泌体释放的自噬核心蛋白中，只有自噬蛋白ATG18a/WIPI2与Evi^GFP阳性MVB共定位，表明该蛋白可能直接在两条途径中发挥作用。相应地，Atg18a过表达增加从突触释放的外泌体数量，也导致突触MVB数量增加，进一步表明Atg18a在该水平上调节外泌体释放。Atg18a是一种PROPPIN(β-丙螺旋桨蛋白，可结合磷脂酰肌醇)家族蛋白，具有PI(3)P或PI(3,5)P2磷脂酰肌醇的特定结合位点。抑制PI3K，一种调节膜运输并催化PI(3)P产生的激酶，减少了Atg18a过表达引起的MVB数量增加，而抑制产生PI(3,5)P2的PIKfyve激酶对MVB形成无影响。这些结果表明，Atg18a主要与PI(3)P而非PI(3,5)P的结合对于Atg18a在外泌体生物发生中的功能是必需的。PI(3)P水平已被证明对招募ESCRT复合物成员到MVB和腔内囊泡形成至关重要(Wenzel et al., 2018)。这特别有趣，因为腔内囊泡生成是外泌体生物发生的必要步骤。本工作还提供了自噬-外泌体互作在疾病条件下的进一步见解。我们报道了携带帕金森蛋白Synj突变的突触显示外泌体释放减少。先前研究表明，突触素PD突变突触中自噬受损，因为此突变抑制了Synj SAC1结构域的磷酸酶活性。由于突触素^RQ对磷脂酰肌醇PI3P和PI(3,5)P2的缺陷磷酸酶活性，Atg18a不能从新生自噬体中释放，自噬体生物发生过程受阻。我们的结果表明，在突触素PD突变突触中，Atg18a是外泌体生物发生的限制因素，这些未成熟自噬体可能作为细胞器陷阱，阻止该蛋白在囊泡释放中发挥作用。相应地，我们表明在突触素PD突变突触中过表达Atg18a可恢复外泌体释放，而无需挽救自噬诱导。具有Synj^RQ突变的患者经历早期发作性帕金森病(EOP)伴癫痫发作(Hardies et al., 2016; Krebs et al., 2013; Quadri et al., 2013)。与这些患者相关的运动功能障碍和癫痫发作已在携带人类突触素1(SYNJ1^R258Q)突变的小鼠模型中得到进一步证实，并且我们在果蝇模型中进一步验证了该突变也引起运动缺陷和对癫痫样行为的更高敏感性和更长的恢复时间。
出乎意料的是，挽救Atg18a在多巴胺能神经元中外泌体释放的作用似乎足以挽救Synj突变帕金森病果蝇动物中表现的运动功能障碍，表明外泌体释放对神经元多巴胺能功能起着关键作用，提示自噬缺陷也可能通过调控外泌体释放恶化疾病进展。此外，这些结果表明多巴胺能神经元的外泌体释放对于维持正常运动是必需的，受损的外泌体释放导致功能障碍的运动和癫痫样行为，这些行为也见于具有Synj PD突变的患者。有趣的是，Synj PD突变果蝇中观察到的多巴胺能神经元退化也可通过Atg18a过表达挽救，表明在多巴胺能神经元中重建外泌体释放足以防止这些神经元的神经变性，可能是作为补偿机制。有趣的是，在生理条件下，神经元的外泌体释放已被证明支持神经回路的形成和活动(Lee et al., 2018)(Sharma et al., 2019)。目前，帕金森相关症状通常用L-DOPA治疗。然而，这种治疗仅能缓解症状，并且随着疾病进展而变得效果更差。此外，并非所有PD患者都对这种治疗有积极反应，例如具有SYNJ1^RQ突变的患者对L-DOPA反应不佳。因此，能够缓解症状并可能支持神经元活力或调节多巴胺能神经回路活动的替代治疗将是疾病有效治疗的重要一步。然而，在开发针对WIPI2功能的新药物之前，需要进一步研究以确定Atg18a/WIPI2在多巴胺能神经回路中的功能，并了解Atg18a/WIPI2的精确分子功能。
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