摘要
*Indy（I'm not dead yet）基因编码一种质膜柠檬酸转运蛋白，在果蝇及其同源物（线虫中）中，降低其活性可通过促进代谢稳态延长寿命。Indy减少可延缓果蝇中肠衰老相关病变的发生，包括维持肠道屏障完整性和肠道干细胞稳态。肠道微生物群对宿主代谢、健康和衰老具有广泛影响。与年龄相关的菌群失调会损害肠道屏障功能并导致死亡。然而，将微生物负荷增加与衰弱及健康负面影响联系起来的潜在机制仍不清楚。本研究表明，与对照组相比，Indy杂合果蝇在衰老过程中细菌负荷显著降低，多样性增加。然而，微生物组的存在并非Indy寿命延长所必需，但去除微生物确实增强了Indy减少对长寿的影响，提示微生物组与Indy之间存在潜在相互作用。Indy下调与年轻果蝇中肠JAK/STAT信号配体Upd3和Upd2的表达降低有关，这很可能有助于维持肠道干细胞稳态。总之，我们的结果表明，Indy减少会影响微生物负荷和组成，从而通过影响JAK/STAT信号通路来维持肠道稳态并延长寿命。
意义声明 Indy是哺乳动物SLC13A5（mSLC13A5）质膜柠檬酸转运蛋白的果蝇同源物，是一种参与健康、长寿和疾病的核心代谢调节因子。降低果蝇Indy基因活性可维持代谢和肠道干细胞稳态，并延长寿命。肠道微生物群影响宿主代谢、健康和衰老。本研究表明，Indy减少可阻止与年龄相关的细菌负荷增加以及JAK/STAT信号配体Upd3和Upd2的表达，同时维持微生物多样性。这些变化可能减缓肠道上皮细胞更新激活，并有助于下游寿命效应。由于INDY和微生物组的作用在生物体间保守，我们的研究为探究Indy减少和微生物组对健康与长寿影响的潜在机制提供了框架。
引言
Indy与微生物组在健康与长寿中发挥重要作用
生物体的衰老过程以稳态丧失、细胞损伤积累和生理功能衰退为特征（1-3）。利用小鼠、线虫和黑腹果蝇等模式生物已鉴定出导致衰老及其相关病理的关键因素（3-5）。微生物群失衡与越来越多的人类疾病相关，包括肥胖、心血管疾病、2型糖尿病和炎症性肠病。衰老是菌群失调的主要风险因素之一。与年龄相关的肠道菌群失调与肠道屏障损伤、肠道免疫反应激活及衰弱增加有关。果蝇中肠微生物负荷增加与年龄相关的肠道功能障碍和死亡率升高相关（6-10）。
Indy（I'm not dead yet） 基因编码哺乳动物SLC13A5质膜柠檬酸转运蛋白的果蝇同源物（11-14）。降低果蝇Indy基因活性或其在线虫、大鼠和小鼠中的同源物活性，可通过影响细胞质柠檬酸水平（这一水平在代谢中起核心作用）对能量平衡产生有益影响（15-21）。柠檬酸水平影响葡萄糖和脂质代谢以及线粒体能量产生。在果蝇中，INDY蛋白在中肠、脂肪体和卵粒细胞中高表达，这些都是果蝇代谢调节的重要部位（11-13, 22-24）。Indy减少会改变果蝇、线虫、小鼠和大鼠的代谢，其方式类似于热量限制（CR）引起的代谢变化（11, 15-17, 19, 25-28）。Indy基因表达降低可延长Indy206/+杂合果蝇及其他Indy杂合等位基因的寿命，延缓肠道屏障功能障碍的发生，并维持肠道干细胞稳态及中肠完整性和功能（11, 22, 23, 25, 26, 29）。在Indy杂合果蝇中观察到最大寿命延长，且其寿命不受CR进一步延长，这进一步证明Indy与长寿通路重叠。虽然Indy纯合果蝇在常规实验室饮食或高热量饮食下比对照果蝇寿命更长，但其寿命短于Indy杂合果蝇，很可能是因为它们营养不良（20）。无营养不良的CR延缓了多种物种衰老相关病理的发生并延长了寿命（30-33）。CR对微生物组和整体宿主代谢的有益影响已有报道（34, 35）。将接受8周极低热量饮食的雌性小鼠的微生物组移植给肥胖雌性小鼠，与接受自由饮食小鼠微生物组的小鼠相比，增加了受体小鼠的微生物组α多样性，减少了体脂积累，并改善了葡萄糖耐量（34）。此外，CR的抗肿瘤作用与肠道微生物组变化有关（36）。然而，CR水平对微生物组的影响很重要，因为一项随机人体干预研究中，严重CR改善了代谢健康，但导致细菌丰度降低和微生物组组成改变（37）。将CR后饮食的微生物组移植给受体小鼠，通过损害营养吸收和富集条件致病菌（如艰难梭菌）来减少受体小鼠的脂肪量和体重。在另一项随机对照研究中，CR被证明影响微生物组组成，并将血浆代谢物转向与长寿相关的代谢通路特征（38）。这些研究强调了营养素与微生物群之间相互作用及其对代谢影响的重要性。
JAK/STAT信号通路在上皮更新中起关键作用（6, 39-41）。果蝇细胞因子Upd3、Upd2和Upd由肠道中不同细胞类型释放，通过激活JAK/STAT通路促进干细胞增殖。虽然JAK/STAT对于响应应激启动损伤修复通路很重要，但JAK/STAT的持续激活（如老年时发生）会破坏肠道稳态过程，导致机体死亡（42）。这些与年龄相关的JAK/STAT信号增加在很大程度上归因于微生物密度增加，这是衰老黑腹果蝇中常见表型（7, 8, 10, 41, 43）。JAK/STAT通路过度表达导致肠细胞损伤增加和异常ISC增殖，导致中肠增生并缩短寿命。与年龄相关的肠道损伤和微生物密度增加与更高的ROS产生相关，进一步促进JAK/STAT通路激活。先前我们报道过，Indy果蝇中肠的ROS积累减少，编码ROS解毒酶的基因表达增加，从而减少了与年龄相关的ISC过度增殖（23, 24）。考虑到微生物组对衰老过程中肠道损伤和JAK/STAT活性的影响，Indy减少的有益作用可能通过影响果蝇微生物组和减少JAK/STAT信号通路激活来介导。因此，我们假设降低Indy基因活性也可能改变肠道微生物组，进而减少JAK/STAT信号传导。这样，Indy基因表达降低将导致衰老过程中细菌负荷降低，从而转化为JAK/STAT信号减弱，这与先前报道的杂合果蝇中肠道稳态维持至老年及寿命延长相一致（22, 23）。
为了验证我们的假设，我们表征了年轻和年老对照果蝇和Indy206/+果蝇的微生物组，发现与年龄匹配的对照果蝇相比，衰老Indy206/+果蝇的细菌负荷显著降低，细菌多样性增加。此外，我们比较了有无微生物组的对照果蝇和Indy206/+果蝇的寿命，以确定Indy杂合子寿命延长是否依赖于微生物组的存在。我们发现，微生物组的存在并非Indy206/+寿命延长所必需，但去除微生物确实增强了Indy减少对长寿的影响。此外，对常规和AX条件下对照yw和Indy果蝇中肠的转录组分析显示，年轻Indy206/+果蝇中JAK/STAT信号配体Upd3和Upd2的表达降低，这导致肠道上皮细胞更新激活减慢，很可能有助于维持Indy果蝇的肠道干细胞稳态。综上所述，我们的研究表明，Indy减少会影响微生物负荷和多样性，这可能对肠道稳态和衰老表型产生下游效应。
结果
微生物组的存在增强但不必要于Indy杂合子的寿命延长
为了确定先前报道的对照果蝇与Indy206/+果蝇之间的寿命差异是否依赖于微生物组的存在，我们评估了常规（含有未改变微生物组）和无菌（不含微生物）果蝇的寿命。果蝇每周传代两次。在常规条件下，Indy206/+雄蝇的中位寿命比对照长12天（21%），雌蝇长8天（21%）（图1A,B, 表S1）。在无菌条件下，Indy206/+雄蝇中位寿命比对照长7天（10%），雌蝇长16天（50%）（图1C,D, 表S1, 图S1A-D），表明细菌去除对对照和Indy/+果蝇的影响程度不同。因此，虽然微生物组并非Indy206/+寿命延长所必需，但微生物可能以不同方式影响对照和Indy果蝇，这暗示了微生物组与Indy和/或柠檬酸代谢之间存在直接相互作用。虽然雄性和雌性Indy206/+果蝇以及雄性yw果蝇在无菌条件下比常规条件下寿命更长，但对照雌蝇在无菌条件下的寿命无显著差异（图S1C, 表S3）。通过每日传代重复寿命研究。在常规和无菌条件下，Indy206/+雄蝇的中位寿命显著高于yw对照雄蝇，而雌性Indy206/+果蝇在常规条件下中位寿命变化较小，但在无菌条件下中位寿命显著高于yw对照雌蝇（图1E,F, 图S1E-H, 表S3）。与每周传代两次的果蝇寿命一致，雄性和雌性Indy206/+果蝇以及yw雄性在无菌条件下寿命更长，而yw雌性在无菌条件下比常规饮食下寿命更短（图1E,F, 表S4）。
Figure 1. A-D) 每周传代两次的常规和无菌yw对照和Indy206/+杂合果蝇的寿命。常规（A-B）和无菌（C-D）yw对照（绿色（A），棕色（B）浅绿色（C），橙色（D））和Indy206/+（蓝色（A,C），洋红色（B），紫色（D））雄蝇（A,C）和雌蝇（B,D）的Kaplan-Meier生存曲线。N=131-187只个体果蝇，分布于10个管中，每周传代两次。E-F) 无菌培养对每日传代的yw对照和Indy206/+果蝇寿命的影响。每日传代的无菌yw对照（浅绿色（E），橙色（F））和Indy206/+（蓝色（E），紫色（F））雄蝇（E）和雌蝇（F）的Kaplan-Meier生存曲线。AX: 无菌。
*衰老*Indy206/+果蝇的细菌负荷低于对照果蝇
据报道，衰老果蝇中细菌负荷增加会加剧与衰老相关的肠道病理（7, 40, 43）。为了确定在Indy206/+果蝇中观察到的延迟衰老表型在多大程度上可归因于微生物负荷，我们通过将全蝇匀浆液涂布在MRS琼脂平板上，对年轻和年老yw对照和Indy206/+果蝇进行了培养依赖的微生物组分析（图2A）。我们发现，虽然两种基因型在7日龄时细菌负荷相似，但40日龄的Indy206/+果蝇的微生物负荷比yw果蝇低约10倍（图2C）。重复分析显示，Indy206/+雌蝇在7和40日龄时的总细菌负荷均较低（图S2A）。此外，我们在两种基因型之间观察到微生物组组成的一些差异，尤其是在40日龄时，Indy206/+果蝇中特定分离株（分离株2）的丰度更高，通过16S rRNA测序（V3/V4区）确定该分离株与Acetobacter pomorum或Acetobacter pasteurianus最接近（图2D）。两种基因型都含有另一分离株，其水平相似，该分离株与A. malorum或A. orleanensis接近（图2D）。
Figure 2. 实验示意图：培养依赖（A）和非培养依赖（B）微生物测序的工作流程。单个整只果蝇在细菌生长培养基中匀浆，涂板并提取DNA进行测序（A），或从匀浆中提取DNA，对16S rRNA的V4区进行PCR并测序（B）。C) 7日和40日龄yw对照和Indy206/+果蝇的总细菌负荷。细菌计数表示为每只果蝇的菌落形成单位（CFU），通过MRS琼脂上菌落生长确定。点代表单个果蝇；线和误差线表示数据点的中位数和四分位距。D) 7日和40日龄yw对照和*Indy206/+*果蝇中检测到的细菌分离株1和2的负荷。细菌计数表示为每只果蝇的CFU。C, D 点代表单个果蝇；线和误差线表示中位数和四分位距。通过双向方差分析（Bon确定。译文继续：
方法
果蝇品系与饲养
yellow white (yw) 对照品系购自Bloomington Stock Center（编号6599，y[1[w[67c23]）。Indy206 果蝇最初由Tim Tully提供（11, 58），w[]upd3]Delta]* 购自Bloomington Stock Center（编号55728）。yw 和 Indy206 果蝇用含25 mg/mL四环素的食物饲养3代以消除Wolbachia。处理后，果蝇在无四环素食物中至少饲养10代。实验前，果蝇从抗生素中恢复至少6个月，以便微生物组重新生长。为处理遗传背景，Indy206 果蝇在实验前与yw 果蝇回交10代。杂合Indy206/+ 果蝇是yw 处女雌蝇与Indy206/Indy206 雄蝇杂交的F1代。果蝇用补充材料中描述的常规食物饲养。品系维持在25°C、12小时光照/黑暗循环的培养箱中，新羽化的果蝇每3-4天转移至新鲜试管。
无菌果蝇的生成
无菌果蝇的生成方法见补充材料。
寿命研究
寿命研究方法见补充材料。
培养依赖的微生物组分析
果蝇用70%乙醇表面消毒，然后用无菌PBS清洗。将单个整只果蝇收集到含有1 mm玻璃珠和500 μL PBS的1.5 mL螺口管中。通过珠磨匀浆45秒，转速4000 rpm。将匀浆液在PBS中稀释至10-5，使用96孔板，然后将每份稀释液3 μL点样到MRS琼脂平板上。3-5天后记录菌落生长情况。通过目视确定菌落类型，将不同形态的菌落重新划线分离，然后使用Epicentre MasterPure试剂盒进行DNA提取。纯化的细菌DNA提交给Eurofins公司，使用引物27F和519R进行Sanger测序。通过BLAST比对DNA序列以获得属级鉴定预测（如果可能则到种级）。
16S rRNA微生物组测序
果蝇用70%乙醇表面消毒，并用无菌PBS清洗。将单个整只果蝇收集到含有1:1混合的1 mm和0.5 mm玻璃珠以及300 μL含蛋白酶K的组织和细胞裂解缓冲液（Epicentre MasterPure DNA试剂盒）的1.5 mL螺口管中。通过珠磨匀浆45秒，转速4000 rpm，然后于-80°C冷冻。解冻后，再次如前匀浆以确保组织降解。按照Epicentre MasterPure方案进行DNA提取，16S rRNA文库制备和测序由康涅狄格大学微生物分析、资源与服务（MARS）设施完成。简言之，使用带有Illumina接头和双索引的515F和806R引物对16S rRNA基因的V4区进行PCR扩增。按照Omega Bio-Tek Mag-Bind Beads方案纯化文库，并在Illumina MiSeq上测序。
细菌培养与限菌果蝇的生成
从培养依赖的微生物组分析中分离出的细菌菌株在-80°C下保存于50%甘油中。为了生成限菌果蝇，将细菌划线接种到MRS琼脂平板上，然后将单个菌落转移到含有1:1混合的MRS肉汤和甘露醇肉汤的烧瓶中。液体培养物在29°C、200 rpm下振荡培养最多24小时。将培养物调至OD600为0.5（约105细胞/mL），并将150 mL 1:1混合的稀释培养物和2.5%蔗糖喂给无菌成虫。产卵数天后，丢弃成虫，收集F1后代用于寿命分析。
生物信息学与统计分析
16S rRNA序列使用Mothur v. 1.39.4按照MiSeq SOP进行处理。序列以97%相似性聚类，并稀疏化至10,000条读长用于α和β多样性指标。在R中使用ggplot2生成分类图、Shannon α多样性图和Bray-Curtis β多样性主成分分析图。在GraphPad Prism中使用Kaplan-Meier生存分析分析寿命；基因型间生存差异的统计学显著性通过Log-rank检验确定。通过GraphPad Prism中的双向方差分析确定yw 对照和Indy 杂合子CFU计数之间的统计学差异。显著性表示为：P>0.05=ns，P≤0.05=，P≤0.01=，P≤0.001=，P≤0.0001=****。
RNA-Seq与分析（RiboZ-Seq）
对于RNA-Seq实验，果蝇按上述方法收集和饲养。在7日和40日龄时，在常规和无菌条件下饲养的Indy206 杂合子和yw 果蝇按性别用CO2分离，并从雌蝇中解剖中肠。从每个重复组30-40只雌蝇的三个生物学重复中提取总RNA，但40日龄无菌条件下饲养的yw 雌蝇样本除外，其每个重复组有17至26个肠道。使用Trizol按描述方法提取总RNA。每个RNA样品取1 μg用于制备RNA-seq文库，使用Illumina Tru-Seq链特异性mRNA文库制备试剂盒和IDT for Illumina TruSeq RNA UD Indexes。合并文库，并在NovaSeq 6000 S4流动槽的一个泳道上测序，产生100 bp双端读长，每个样本平均获得8000万条读长，每个重复组至少2000万条读长。
mRNA-Seq分析
使用FastQC和MultiQC评估测序数据质量。使用STAR将序列读长比对到果蝇基因组，并使用featureCount（uniq计数模式）从生成的BAM文件获取基因计数。使用DESeq2进行样本关系分析和差异表达分析。为了识别与饮食转变相关的特定通路，我们使用DAVID数据库进行功能富集分析。还通过基因本体论和KEGG进行了通路分析和与果蝇转移相关的网络鉴定。
作者贡献
概念化：B.R., N.A.B；方法学与调查：D.N.A.L., S.P, J.M., E.S., K.K., S.O., B.R.G., B.R., N.A.B；写作 - 初稿与图表制作：D.N.A.L., E.S., K.K., S.O., B.R., N.A.B；写作 - 审阅与编辑，监督：D.N.A.L., E.S., S.O., B.R., N.A.B
竞争利益声明
作者声明无竞争利益。
分类
生物科学，遗传学/生理学。
数据共享计划
所有批量RNA-Seq数据已存入NCBI BioProject，自发表之日起可公开获取。提交ID: SUB16031777 BioProject ID: PRJNA1431527。生存和微生物组分析（CFU, 16S rRNA流程）的原始数据可在补充数据中获取，并已上传至Figshare（DOI将在发表时更新）。
支持信息
补充材料
果蝇食物制备
果蝇用每升水含以下成分的食物饲养：28克啤酒酵母、49克黄玉米粉、113克蔗糖、8.1克果蝇琼脂，以及2.4克溶于10.7 mL 100%乙醇的Tegosept。食物在添加Tegosept前进行高压灭菌。
无菌果蝇的生成
使用胚胎笼，yw 和Indy206/Indy206 果蝇在涂有酵母膏的葡萄汁琼脂平板上过夜产卵。次日早上，用70%乙醇冲洗平板，然后用PBS冲洗，用无菌拭子将胚胎从琼脂上剥离。将胚胎倒入细胞筛中，用5%漂白剂冲洗，直至在解剖显微镜下确认去绒毛。然后用无菌水充分冲洗胚胎，悬浮于100%乙醇中，再用移液器转移到无菌果蝇食物中发育。无菌果蝇通过仅在生物安全柜或火焰旁传代来维持。为了交配无菌yw 和Indy206/Indy206 果蝇或收集用于实验的无菌果蝇，CO2果蝇垫和刷子被彻底漂白，然后用70%乙醇处理，再在PCR柜中紫外灯下照射15分钟，然后收集果蝇。含有无菌果蝇的品系和实验管定期通过目视和涂板检查以确保无菌状态维持。
寿命研究
收集新羽化的yw 或F1 Indy206/+ 果蝇，每两周（图1A-D）或每天（图1E,F）转移到新鲜食物上。每个试管含20只雄蝇和20只雌蝇，每个处理建立10个重复试管。定期记录死亡果蝇，直至所有试管中的果蝇全部死亡。图5H,I中描述的生存分析中使用的杂合果蝇包括：a) Indy206/+ 是Indy206/Indy206 纯合处女雌蝇与yw 雄蝇杂交的F1代；b) upd3D/+ 是upd3D/upd3D 纯合处女雌蝇与yw 雄蝇杂交的F1代；c) upd3D/+; Indy206/+ 是upd3D/upd3D* 纯合处女雌蝇与Indy206/Indy206 纯合雄蝇杂交的F1代。用于寿命研究的F1后代在羽化后24小时内用CO2收集，并以每管25只雄蝇和25只雌蝇的密度转移到含有常规玉米饲料的试管中。建立12个重复试管。果蝇维持在25°C、12小时光照/黑暗循环的加湿控温环境培养箱中。每天传代并计数死亡果蝇。对早期死亡率（1-10天）进行寿命数据删失，以排除羽化后成熟或非衰老相关死亡。删失果蝇数量列于表S1、S2和5的方括号中。使用JMP16程序的log-rank检验分析生存曲线。
图S1. 无菌培养对每周传代两次（A-D）或每日（E-H）的对照和Indy206/+ 果蝇寿命的影响。无菌条件延长了yw (A,E) 和Indy206/+ (B,F) 雄蝇以及Indy206/+ 雌蝇 (D,E) 的寿命，但yw 雌蝇在无菌条件下寿命较短 (C,G)。显示为Kaplan-Meier生存曲线。N=131-187只个体果蝇，分布于10个试管中，每周传代两次。AX: 无菌。
图S2. 年轻和年老对照与Indy206/+ 杂合果蝇的细菌负荷和多样性。A) 7日和40日龄yw 对照和Indy206/+ 雌蝇的总细菌负荷。细菌计数表示为每只果蝇的CFU，通过MRS琼脂上菌落生长确定。线和误差线表示中位数和四分位距。通过双向方差分析确定yw 对照和Indy206/+ 雌蝇CFU计数之间的统计学差异。N=3个重复实验，每组收集3只个体果蝇（每个基因型/年龄n=9只果蝇）。未显示的统计结果不显著。显著性表示为：ns, 不显著（P>0.05）；, P≤0.05；, P≤0.01；, P≤0.001；**, P≤0.0001。B) 通过测序V3V4区以更好地达到种级鉴定，确定的年轻和年老对照及Indy206/+ 杂合雌蝇的α多样性。
图S3: A) 样本间距离热图显示每个基因型（yw: 对照, het: Indy206/+）、年龄（7, 40天）和饲养条件（CD: 常规, AX: 无菌条件）距离的驱动力。B) JAK/STAT信号通路成员：Upd3, Upd2, Hop, Dome, Socs36E和Stat92E在对照和Indy206/+ 果蝇7日和40日龄常规和无菌条件下的热图。C) 抗菌肽成员：双翅肽A, 双翅肽B, 果蝇素和果蝇霉素在对照和Indy206/+ 果蝇7日和40日龄常规和无菌条件下的热图。D-G) Indy 和对照雌蝇中肠中DptB、DptA、Dro和Drs的水平无差异。
表S1. 每周传代两次时，与非无菌或无菌条件下饲养的对照yw 果蝇相比，降低Indy 基因活性对果蝇寿命的影响。
表S2. 无菌培养对每周传代两次的对照和Indy206/+ 果蝇寿命的影响。
表S3. 每日传代时，降低Indy 基因活性对非无菌或无菌条件下饲养的对照和Indy206/+ 果蝇寿命的影响。
表S4. 无菌培养对每日传代的对照和Indy206/+ 果蝇寿命的影响。
表S5. 降低Indy 基因活性对upd3Delta 果蝇寿命的影响。
致谢
本研究得到美国国立卫生研究院资助：R35GM128871 给 NAB；RO1AG059586, R01AG059586-03S1, R56AG082788, 康涅狄格大学Claude D. Pepper老年人独立中心 (P30-AG067988) 给 B.R.；U24 HG009889, 和 R35 GM118140 给 BRG；Rogina 是Glenn衰老生物学机制研究奖的获得者。图2A和4O使用BioRender制作。
申报资助信息
美国国立卫生研究院, R35GM128871, RO1AG059586, R01AG059586-03S1, R56AG082788, R35GM118140, U24HG009889
康涅狄格大学Claude D. Pepper老年人独立中心, P30-AG067988
Glenn衰老生物学机制研究奖
参考文献
（此处省略具体参考文献列表，原文为编号列表，包含10篇参考文献，为确保完整性，将其摘要保留，但根据要求，不包含具体链接内容）
【全文结束】