血肿白细胞介素-1受体拮抗剂浓度预测急性人类脑内出血长期预后 - 心脑血管

摘要

目标

白细胞介素(IL)-1、IL-6和C反应蛋白(CRP)通路是脑内出血(ICH)后免疫反应的核心。我们在MISTIE III(脑内出血微创手术联合重组组织型纤溶酶原激活剂第三阶段试验)参与者中测试了血肿和血浆细胞因子浓度与患者预后之间的关联。

方法

INFLAME-ICH是MISTIE III中的子研究。对接受手术的患者收集每日血肿液，对所有患者收集外周血。多元回归模型将血肿细胞因子浓度与1年时的改良Rankin量表(mRS)评分进行比较。测试了血肿和血浆细胞因子浓度之间的相关性。比较了随机分配到手术组(对比医疗组)患者的血浆细胞因子。在部分参与者中比较了单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞的基因表达。

结果

共招募89名患者(47名手术，42名医疗)。平均血肿IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)(比值比[OR]: 5.92; 95%置信区间[CI]: 1.08–32.54; n = 38)和平均血肿IL-6 (OR: 3.23; 95% CI: 1.33–7.81; n = 45)与1年时的良好预后(mRS 0–3)独立相关。较高的血肿IL-1β与较高的血浆CRP相关(β系数: 21.0; 95% CI: 4.4–37.5; n = 117对样本)。按治疗组别，血浆IL-6、CRP和IL-1Ra无显著差异。IL1B、IL6和IL1RN在单核细胞/巨噬细胞中的转录物与血肿液中相应蛋白浓度相关。

解释

脑出血后一周内血肿中的IL-1Ra与1年后良好预后独立相关，这支持了对IL-1Ra在脑内出血中进一步研究。IL-6与1年后良好预后独立相关，这可能表明其在促进修复和恢复方面的作用。ANN NEUROL 2026

引言

脑内出血(ICH)的1个月病死率为30%至40%，只有五分之一的患者能恢复独立生活能力。全球范围内，出血性卒中占730万年卒中死亡的45.6%和卒中导致的伤残调整生命年的50%。支持性护理、抗凝逆转和强化血压降低是推荐措施，而微创手术显示出希望。减少血肿周围继发性脑损伤可能使大多数ICH患者受益，作为较小血肿的单一治疗，以及作为大型出血手术的辅助治疗。

临床前研究表明，局部炎症是对各种急性脑损伤的反应，既加剧早期损伤，又在后期修复和恢复中发挥重要作用。促炎细胞因子白细胞介素(IL)-1起关键有害作用，抑制IL-1可减少各种实验性急性脑损伤中的损伤。IL-1在动物模型和人类ICH的血肿周围脑组织中迅速上调。IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)是一种天然存在的IL-1阻断剂，内源性IL-1Ra上调可减少ICH动物模型中的水肿和中性粒细胞浸润。然而，缺血性卒中的研究表明，临床前研究的发现可能不会直接转化为患者。因此，有必要使用临床ICH中的新研究来弥合这一转化差距。

既往ICH临床研究测量了入院时的外周炎症标志物，并显示与更差的短期预后相关，也与1至3个月的不良功能预后和生存率相关。尸检研究表明脑出血周围有炎症细胞浸润，但我们对临床ICH中炎症反应的性质和时间分布及其与全身炎症的关系知之甚少。MISTIE III试验测试了微创导管引流联合溶栓与标准护理的对比。该试验提供了直接在人类脑内调查关键炎症反应的独特机会。我们测量了IL-1家族的主要细胞因子(IL-1α、IL-1β和IL-1Ra)和IL-6，这是IL-1的关键下游介质。我们首先试图测试这些细胞因子是否可在随机分配到MISTIE III手术的患者的血肿液中检测到，如果可以，则描述其时间分布。由于已知血肿周围水肿(PHE)和血脑屏障破坏因出血位置而异，所以我们测试了细胞因子浓度是否与出血位置(深部vs脑叶)相关。然后，我们测试了血肿中的细胞因子浓度是否与亚急性PHE和1年预后相关。接下来，我们调查了在部分手术患者的血肿液和外周血中分离的关键髓系细胞群中编码这些细胞因子的基因表达。然后，我们试图确定血肿细胞因子浓度(IL-1、IL-6和IL-1Ra)是否与血浆中IL-6、C反应蛋白(CRP)和IL-1Ra的浓度相关。最后，我们测试了与随机分配到标准护理的患者相比，MISTIE手术是否会导致循环IL-6、CRP和IL-1Ra显著增加。

材料和方法

INFLAME-ICH是嵌套在MISTIE III (NCT01827046)临床试验中的前瞻性观察性子研究。INFLAME-ICH在27个MISTIE III中心进行(美国[US] = 15，英国[UK] = 4，西班牙 = 5，匈牙利 = 3)。每个站点的伦理批准是通过对主要MISTIE III伦理批准的修正获得的，该批准已获得每个中心的机构审查委员会批准。INFLAME-ICH被作为可选子研究提出，愿意参加INFLAME-ICH的参与者在签署主要MISTIE III试验的同意书之外，还签署了额外的同意书。

MISTIE III程序

MISTIE III试验在其他地方有详细描述。包括自发性幕上ICH且血肿体积≥30mL的患者。症状发作到诊断性计算机断层扫描(CT)的时间少于24小时，随机化必须在诊断CT后12至72小时内进行。随机分配到MISTIE干预的患者在血肿内放置刚性套管针，通过钻孔或扭钻开口。用手持注射器抽吸血肿直到第一次阻力。将软导管放置到残留血肿中，并连接到三通旋塞和封闭引流系统。套管放置6小时或更长时间后，通过导管每8小时给予阿替普酶(1mg在1mL中)，最多9剂。当达到手术目标(残留血肿≤15mL)、给予9剂阿替普酶或发生临床有症状的再出血事件时，停止阿替普酶。所有剂量后都用3mL不含防腐剂的生理盐水冲洗，并关闭系统1小时以允许药物-血块相互作用，然后重新开放以允许重力引流。使用症状发作时的诊断CT扫描和症状发作后最接近120小时(5天)的CT扫描进行PHE分析。第5天CT扫描是在症状发作后中位数117.3小时(四分位距[IQR]: 112.0–123.6小时，范围: 65.7–142.5小时)。CT扫描由巴尔的摩约翰霍普金斯大学的影像中心分析。将医学数字成像和通信(DICOM)图像加载到OsiriX MD (版本9.0.1)中，以确定血肿和PHE体积以及血肿位置(脑叶vs深部)。

INFLAME-ICH样本收集和处理

随机分配到INFLAME-ICH手术的患者在手术放置引流管时收集血肿抽吸物。这是血肿(如果有的话)的液体成分，外科医生在放置引流管前能够抽吸的。在引入阿替普酶之前收集此样本。此后，只要引流管仍在体内，每天都会收集一次血肿液样本。阿替普酶通过引流管直接注入血块，每8小时1.0mg在1mL中，随后3mL冲洗，最多9剂。引流管保留的时间由主要试验协议确定。一旦达到手术目标，就会移除引流管。如果残留血肿≤15mL、给予9剂阿替普酶或发生临床有症状的再出血事件，则达到目标。

在收集血肿抽吸物或血肿液的同时，每天收集外周血。随机分配到标准医疗护理的患者从随机化当天开始每天收集外周血，在09:00 ± 2小时内再收集4天。

血肿抽吸物立即转移到无添加剂塑料收集管中。对于引流管插入后的血肿液收集，清空系统中的滴液室，然后在阿替普酶剂量前5小时间隔内收集血肿液，该剂量在08:00和16:00之间给药。此样本在上次阿替普酶剂量后8小时间隔的最后5小时内收集。仅在最后一次收集日，且引流管移除后，收集引流管和滴液室之间管路的内容物。所有外周血使用6mL EDTA管收集。样本在收集后<1小时内以2,000g室温离心10分钟。将上清液转移到冷冻管中并在-70°C或更低温度下冷冻。所有样本在干冰上运送到英国索尔福德索尔福德皇家医院的生物医学设施中央实验室。

美国的INFLAME-ICH患者被邀请为ICH-Seq研究贡献样本，如先前报道。样本在与INFLAME-ICH相同的时间点收集，并转移到中央实验室进行处理。从血肿液和外周血中分离白细胞，并使用荧光激活细胞分选分离髓系群体。对CD14+单核细胞/巨噬细胞和CD66a/c/e+中性粒细胞进行转录组分析，并分析IL-1A、IL-1B、IL-6和IL-1RN基因的表达数据。

样本测定

使用Luminex技术(Luminex, Austin, TX)分析IL-6(血肿和血浆)、IL-1β(血肿)、IL-1α(血肿)和CRP(血浆)。Bio-Plex磁性COOH珠子(Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK)与特异性单克隆抗体偶联(PeliKine抗IL-6, cat. M191602; PeliKine抗IL-1β, cat. M193402; IL-1α R&D DuoSet, cat. 840201; Biodesign抗CRP, cat. M86842M; 克隆C2, Amsbio, Abingdon, UK)。分析物使用生物素偶联的特异性抗体(PeliKine抗IL-6, cat. M191604; PeliKine抗IL-1β, cat. M193404; IL-1α R&D DuoSet, cat. 840202)进行二次结合，而CRP则使用单重竞争测定法测量，其中使用的竞争物是SCIPAC CRP cat. P100-0 (SCIPAC, Sittingbourne, UK)，用Pierce EZ-Link Sulfo-NHS-LC–LC-Biotin (Pierce, Rockford, IL)生物素化。添加Jackson Laboratories R-Phycoerythrin Streptavidin (cat. 016-110-084; Stratech, Newmarket, UK)后，使用Bio-Plex 200系统读取信号。IL-1Ra和IL-6使用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析。特异性单克隆抗体捕获在Costar 96孔微孔板(cat. 3,590; Appletonwoods, Kings Norton, UK)，Peprotech抗IL-1Ra (cat. 900-K474; Peprotech EC)，PeliKine抗IL-6 (cat. M191602)，并使用Invitrogen生物素化小鼠单克隆抗IL-1Ra (cat. AHC0219)克隆A71B 6D11 (Life Technologies, Paisley, UK)和PeliKine抗IL-6 (cat. M191604)进行二次结合。添加Jackson Laboratories streptavidin-HRP (cat. 016-030-084; Stratech, Newmarket, UK)后，使用Wallac Victor 1,420多标记计数器读取信号。所有细胞因子测量均相对于国家生物标准与控制研究所(NIBSC, South Mimms, UK)进行标准化。所有生物标志物测量均在不知晓临床和神经影像学结果的情况下进行。

尸检脑分析

为了了解血肿周围组织中IL-1Ra的表达是否可能对血肿液中检测到的IL-1Ra有贡献，我们检查了9例尸检脑。方法和结果在补充材料中提供。

统计分析

对所有图表和分析，细胞因子浓度进行对数转换。绘制随时间变化时，使用自然三次样条推导出最佳拟合线和95%置信区间(CI)。良好预后定义为1年时改良Rankin量表(mRS)评分为0至3(对比不良预后4–6)。选择此定义是因为它是主要MISTIE III试验的主要结果，mRS 0至3代表纳入MISTIE III的严重ICH患者的良好预后，并且因为我们主要关注炎症反应对长期预后的影响。对于每位参与者，计算细胞因子浓度的平均值，并用于测试与mRS的关联。我们调整了年龄、症状发作到手术的时间和严重程度指数，如前所述。先前的ICH-Seq分析表明，血肿髓系细胞中有2个不同的基因表达阶段。第一阶段跨越ICH后前4天，髓系转录谱迅速变化，随后是ICH后4至7天的亚急性阶段，此时转录谱更稳定。因此，我们调查了确定平均细胞因子浓度是在固定时间点前还是后是否改进了模型拟合，与所有时间点的平均值相比。我们将细胞因子数据分为ICH后72小时前和72小时后收集的，并计算每个时间段的平均细胞因子浓度。还进行了使用ICH后72小时后每12小时切点的附加分析，直到120小时。我们确定了基于固定时间点划分细胞因子数据的回归模型的赤池信息准则(AIC)和贝叶斯信息准则(BIC)，并将这些与所有时间点平均的模型的AIC和BIC进行比较。我们使用多元线性回归模型比较血肿细胞因子浓度与位置，将细胞因子浓度作为结果，位置作为解释因素，并调整ICH体积、严重程度指数、年龄和发作到手术时间。严重程度指数是为MISTIE III试验开发的评分，结合多个预后因素，在补充材料方法中描述。

我们使用第5天的PHE体积作为PHE的测量值。使用多元线性回归测试血肿和血浆细胞因子浓度与第5天PHE体积之间的关联，并调整严重程度指数、年龄和基线PHE体积。

对于ICH-Seq参与者，我们使用线性回归测试基因表达(IL-1A、IL-1B、IL-6和IL-1RN)在单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞与同一组织隔室在同一时间点的蛋白浓度(IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-1Ra)之间的关联，调整症状发作到样本收集的时间。

我们使用在同一天收集的对，其中血浆样本在血肿样本收集时或之后收集，测试血肿细胞因子浓度与血浆细胞因子浓度之间的关联。我们使用多元线性回归，并包括症状发作到血肿液收集的小时数、血肿液和血浆样本收集之间的小时数、严重程度指数和年龄。

最后，我们比较了随机分配到MISTIE III手术的参与者与医疗护理的血浆IL-6、CRP和IL-1Ra浓度，调整严重程度指数和年龄，在多因素线性回归模型中引入治疗组和症状发作时间的交互项。

结果

基线特征和样本收集

我们招募了89名患者，47名手术，42名医疗。基线特征见表1，组间无显著差异。INFLAME-ICH患者纳入的MISTIE III患者与未纳入INFLAME-ICH的患者以及整个MISTIE III队列的基线特征比较见补充表S1。INFLAME-ICH参与者总体上代表了MISTIE III参与者的全部队列。手术患者在第5天的ICH体积和水肿较低。20名(42.6%)手术患者还被纳入ICH-Seq研究。从手术患者收集血肿液样本的平均天数为3.7(标准差[SD]: 1.2)，中位数为4(IQR: 3–5；范围: 1–5)天。从手术患者收集血浆样本的平均天数为4.3(SD: 1.1)，中位数为5(IQR: 4–5；范围1–5)天。从医疗患者收集血浆的平均天数为4.6(SD: 0.9)，中位数为5(IQR: 4.25–5；范围: 1–6)天。第一次血肿样本的中位时间至症状为59.7小时，首次血浆样本的时间在组间无显著差异(医疗50.0小时vs手术55.5小时)。两名手术患者在1个时间点收集了血肿液样本，但样本量不足以进行INFLAME-ICH测定，因此从我们的分析中排除。另外7名患者在单个时间点的血肿液样本不足以进行IL-1Ra测定，也在所有IL-1Ra分析中被排除。

细胞因子的时间分布与位置关联

IL-1β在血肿液中以高于IL-1α的浓度被检测到，并保持可检测到采样期结束(图1A, B)。IL-1Ra在血肿液中的浓度约为IL-1β的40倍(图1C)。IL-1Ra在血浆中以约比血肿液低10倍的浓度可检测到。IL-6浓度在血肿液中较高。血浆IL-6约为血肿液的1,000倍低(图1D)。IL-1Ra在脑叶ICH中(对比深部)显示较低浓度(β系数: -0.81; 95% CI: -1.45至-0.16)，调整基线ICH体积、年龄、严重程度指数和症状到手术时间后。IL-1α、IL-1β或IL-6按位置无显著差异。

细胞因子浓度与预后的关联

我们测试了血肿细胞因子浓度与1年时良好预后的关联，发现通过应用时间切点没有改进模型拟合的证据(补充表S2)。因此，我们计算了每位参与者的平均细胞因子浓度，并将此平均值作为协变量用于回归模型中。在调整严重程度指数、年龄和症状发作到手术时间后，我们发现血肿中的IL-1Ra (OR: 5.92; 95% CI: 1.08−32.54)和IL-6 (OR: 3.23; 95% CI: 1.33–7.81)与更好预后显著相关，而血肿中IL-1α (OR: 1.04, 95% CI: 0.70–1.54)和IL-1β (OR: 1.41; 95% CI: 0.77–2.59)的平均浓度不相关。按良好和不良预后分组的细胞因子浓度见图2。

细胞因子浓度与PHE的关联

平均血肿和血浆细胞因子浓度与第5天PHE体积之间的关系见图3。多因素线性回归模型显示，在调整严重程度指数、年龄和基线PHE体积后，血肿IL-1α (β系数: 1.48; 95% CI: -1.24至4.19)、血肿IL-1β (β系数: 1.18; 95% CI: -2.64至5.00)、血肿IL-1Ra (β系数: 7.88; 95% CI: -2.01至17.78)、血肿IL-6 (β系数: 2.36; 95% CI: -2.12至6.85)、血浆IL-1Ra (β系数: -0.01; 95% CI: -6.04至6.02)、血浆IL-6 (β系数: -1.18; 95% CI: -5.85至3.50)或血浆CRP (β系数: -1.02; 95% CI: -5.74至3.71)均无显著关联。

血肿样本中细胞因子的来源

ICH-Seq的数据对20名手术组参与者可用，单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞中IL-1A、IL-1B、IL-6和IL-1RN基因的表达见图4。在血肿液中，IL1A在两种细胞类型中表达相等，而单核细胞/巨噬细胞显示IL1B和IL1RN的更高表达。相比之下，在外周血中，中性粒细胞显示比单核细胞/巨噬细胞更高的IL1RN表达。IL-6表达在血肿液和外周血的单核细胞/巨噬细胞中检测到，但不在中性粒细胞中。基因表达随时间的变化遵循每个隔室中相关蛋白的相同模式，除了IL1RN，它在血肿中增加而IL-1Ra蛋白减少。

IL-1B、IL-6和IL-1RN在血肿液中单核细胞/巨噬细胞中的表达与同一时间点相应蛋白浓度显著相关(表2)。外周血单核细胞/巨噬细胞中IL-1RN的表达与血浆IL-1Ra相关。中性粒细胞中的基因表达与细胞因子浓度之间没有关联。

尸检脑上的IL-1Ra免疫组织化学反应显示，一名第3天死亡的ICH供体的血肿周围组织中少数神经元有表达。在血肿周围巨噬细胞中看到模糊染色，在血块内的中性粒细胞和巨噬细胞中没有染色(补充图S1)。第58天ICH后发现血肿周围神经元IL-1Ra表达。对照组或其他ICH病例中神经元中不存在IL-1Ra。所有ICH病例和3名对照组显示偶尔的小胶质细胞和血管周围巨噬细胞中IL-1Ra表达。结直肠癌对照组织显示中性粒细胞和巨噬细胞中一致表达，以及少数肿瘤细胞的染色。

血肿和血浆中细胞因子浓度的关联

将血肿IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-1Ra浓度与当天或当天晚些时候采集的血浆IL-6、CRP和IL-1Ra浓度进行比较(表3)。只有血肿IL-1β与CRP显著相关(β系数: 20.9; 95% CI: 4.4–37.5)。

外科与内科MISTIE III试验参与者中的血浆细胞因子浓度

比较了血浆IL-6、CRP和IL-1Ra与治疗组(外科vs内科)(图5)。在调整严重程度指数、年龄、发作后小时数以及治疗组和发作后小时数的交互项后，IL-6(外科vs内科；β系数: -0.26; 95% CI: -0.78至0.26)、CRP(外科vs内科；β系数: -0.21; 95% CI: -0.71至0.28)或IL-1Ra(外科vs内科；β系数: -0.11; 95% CI: -0.46至0.23)均无显著差异。IL-6和CRP在治疗组和发作后小时数之间存在显著交互作用，p值分别为0.02和0.03。IL-1Ra无显著交互作用(交互作用的p值=0.44)。IL-6和CRP似乎随时间在医疗参与者中比外科参与者下降更多(见图5)。

讨论

利用MISTIE III试验提供的独特机会，我们证明了IL-1、IL-6和IL-1Ra在脑内出血患者发病后第一周内可在血肿液中检测到。血肿液中的单核细胞/巨噬细胞似乎是IL-1β、IL-6和IL-1Ra的关键来源。血肿中IL-6和IL-1Ra的浓度较高与1年时的良好预后相关，IL-1Ra在脑叶ICH中(对比深部ICH)较低。血肿或血浆中没有任何细胞因子与PHE体积相关。最后，较高的血肿IL-1β与较高的血浆CRP相关，与随机分配到MISTIE III外科干预相比，内科护理的患者中血浆细胞因子浓度无显著差异。

基于临床前研究的荟萃分析，IL-1是卒中中有希望的治疗靶点。已在缺血性卒中、蛛网膜下腔出血和脑内出血中进行了II期试验。唯一完成的脑内出血IL-1Ra试验将第3天水肿扩展距离作为主要结果，但由于2019冠状病毒病大流行对招募的影响，因样本量不足。尽管如此，事后分析注意到第2天血浆IL-6显著降低。IL-1Ra的进一步II期试验正在进行中，将提供更多信息。

我们的结果推进了对IL-1Ra治疗潜力的理解。首先，我们证明了脑内出血后第一周内内源性血肿IL-1Ra浓度与1年后良好预后独立相关。其次，我们证明IL-1在脑内出血后第一周内存在于血肿中但正在减少，因此IL-1Ra的治疗窗口可能比先前和正在进行的试验中测试的72小时更长。两项脑内出血IL-1Ra试验方案都包括水肿作为主要结果，但我们发现IL-1Ra与水肿无关联。我们研究中的水肿可能受到手术干预、组织中阿替普酶存在和内源性炎症反应之间复杂相互作用的影响。阿替普酶是MISTIE III手术干预的一部分，已知对神经元和胶质细胞有有害作用。最后，我们证明IL-1Ra在脑叶血肿中显著较低。最近的一项正电子发射断层扫描(PET)磁共振(MR)研究表明，与深部相比，脑叶ICH的血脑屏障破坏更多(在第1至3天使用动态对比增强MR成像)和更多神经炎症(从第2至7天使用PK-11195 PET成像)。另一项最近使用CT监测ICH患者水肿演变至第14天的研究发现，PHE仅在脑叶ICH中从第3天增加到第14天。这些发现可能表明脑叶ICH中炎症反应更强，由IL-1Ra浓度低促进，这可能增加IL-1Ra在脑叶ICH中治疗的潜在益处。

我们发现较高的血肿IL-6浓度与一年后良好预后的较高几率相关，这是出乎意料的。IL-6历史上被认为是一种促炎细胞因子。例如，最近一项关于ICH入院时脑脊液(CSF)细胞因子的研究显示CSF IL-6与更差预后相关。此外，血浆中的IL-6显示与更差的90天mRS和更大的ICH和PHE体积相关。在ICH病理生理学早期，浸润的CCR2+单核细胞释放IL-6，它们的耗竭与啮齿动物功能评分改善相关。然而，其他研究表明IL-6在后期的重要性。一项使用啮齿动物脑血管损伤模型和人类发病约6天后脑周围组织的研究表明，浸润的CCR2+单核细胞是IL-6的主要来源，驱动小胶质细胞形成具有增殖和促血管生成特性的表型，称为修复相关小胶质细胞，促进损伤后功能修复。还了解到IL-6受体α以可溶性和跨膜形式存在。当膜结合时，通过IL-6受体α的信号传导引起抗炎经典信号传导，而可溶性IL-6受体α引起促炎转信号传导，这可能代表IL-6驱动这两个过程的关键机制。此外，IL-6可能需要促进早期免疫细胞向ICH部位的募集，这对于后期强大的抗炎反应可能是必要的。在我们的研究中，IL-6从第1天到第2天测量到第7天，但我们没有发现血肿IL-6浓度和mRS在1年时关联的异质性。IL-6的作用是否可能随着炎症反应的演变而不同，最初促进有害的炎症过程，但后来对ICH后的修复和恢复必不可少，这需要在进一步研究中进行调查。

来自约一半INFLAME-ICH手术患者的髓系群体的基因表达数据显示，单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞都对血肿液中的IL-1蛋白浓度有贡献。单核细胞/巨噬细胞表达比中性粒细胞更多的IL1B，而IL1A在两种细胞类型中的转录表达相似。简单目视检查表明，血肿液中两种细胞类型IL1RN的表达似乎随时间增加，与血肿中IL-1Ra蛋白减少相反。虽然这可能是偶然发现，因为基因表达数据仅适用于50%的患者，但也可能是由于另一种IL1RN表达细胞的释放减少。尽管我们的尸检脑分析非常有限且具有探索性，但我们确实在一名第3天死亡的急性ICH患者血肿界面的少数神经元中识别出IL-1Ra表达，表明神经元也可能贡献IL-1Ra。一名第58天死亡的ICH患者的血肿周围神经元IL-1Ra染色也被检测到，表明神经元IL-1Ra产生可能延长。

在血肿液和血浆中，我们观察到IL6在单核细胞/巨噬细胞中的表达，但在任一隔室的中性粒细胞中未检测到IL6表达。通过测试基因表达和蛋白浓度之间的相关性，我们证明了血肿液中单核细胞/巨噬细胞中IL-1B、IL-6和IL-1RN的基因表达显著贡献了同一时间点的细胞因子浓度，而中性粒细胞则没有。在外周血中，只有单核细胞/巨噬细胞中IL-1RN的表达显著贡献了血浆IL-1Ra水平。

以前没有研究在ICH患者中第一周内获得连续的血肿和血浆样本。我们的研究使我们能够显示血肿中IL-1β的浓度与当天收集的血浆样本中的CRP相关。重要的是，这支持了在ICH患者第一周内将血浆CRP用作血肿中IL-1β介导炎症的替代测量。值得注意的是，我们没有发现IL-1β和IL-6之间的关联，因为IL-6是CRP从肝脏释放的公认介质。这可能是因为与CRP(0.81)相比，我们样本中血浆IL-6的变异性更高(变异系数为1.62)，使我们的相关性分析能力不足。

神经外科干预可能促进神经炎症。因此，我们测试了随机分配到手术是否与随机分配到医疗护理相比导致血浆炎症标志物增加。尽管我们发现随机分配到手术后IL-6、CRP或IL-1Ra无显著增加，但IL-6和CRP的治疗组和症状发作时间之间存在显著交互作用，表明两种细胞因子在随机分配到医疗治疗的患者中随时间下降更快。MISTIE III干预是微创的，可能引起比传统手术少得多的组织破坏和炎症。然而，这一发现表明引流管在血肿中持续存在直接或间接地维持了IL-6和CRP在更长时间内的较高浓度。这是否对预后有任何影响尚不确定，需要进一步调查。

我们研究的关键优势是MISTIE III提供的独特机会，可以跟踪ICH患者发病后第一周内脑内和血浆中的炎症细胞因子。我们也受益于MISTIE III试验的稳健执行。然而，仍存在一些局限性。首先，我们收集了血肿引流液，其成分可能随着引流管在体内的时间而变化。手术时收集的初始样本可能主要由血块凝固的动脉血和未凝固血液产生的血清组成。随着MISTIE III干预使血块缩小，血肿周围组织的贡献可能会增加，样本收集的持续时间由主要试验协议决定的引流管保留时间决定。其次，INFLAME-ICH患者植入的一些引流管可能与脑室空间相通，因此脑脊液也可能存在于引流液中，对细胞因子浓度产生稀释效应，并可能引入来自脑脊液隔室的相同细胞因子。第三，由于资金限制和收集INFLAME-ICH样本所需的额外资源，我们只包括了87名(17%)MISTIE III试验参与者中的506名，来自21个(27%)研究站点中的78个，降低了我们的能力和可能的研究结果的普遍性。我们的小样本量也限制了我们在回归模型中调整所有潜在混杂因素的能力，但MISTIE III严重程度指数在我们的回归模型中的使用使我们能够调整大多数关键混杂因素。同样重要的是要注意，我们在没有预先指定的分析计划的情况下进行了多次分析，一些观察到的结果可能是偶然出现的。因此，我们的结果必须谨慎解释，并视为探索性。第四，为了允许血肿引流液在引流管中积累足够样本进行收集，我们允许液体在滴液室中积累5小时。在此期间，细胞因子浓度可能发生变化。主要研究开始前的试点工作使用MISTIE III参与者的体外血肿液样本表明，这种变化很小，不会受到将温度降低到4°C的影响。第五，从血肿收集的许多样本是在给予阿替普酶后进行的，因为这是MISTIE III程序的组成部分。因此，我们无法区分阿替普酶对炎症反应自然史的任何影响。然而，在38名(81%)手术患者中，第一个样本是在引流管插入时收集的，在阿替普酶给药之前，当我们比较这些样本中测量的血肿细胞因子浓度与9名手术患者在阿替普酶给药后首次收集的样本时，我们注意到无显著差异(补充表S3)，这在一定程度上保证了阿替普酶对我们的结果没有重大影响。阿替普酶对卒中免疫反应的影响先前已在文献中描述。在缺血性卒中的动物模型中，阿替普酶已被证明具有非溶栓作用，包括血小板衍生生长因子的裂解和受体的激活，包括Annexin A2、低密度脂蛋白受体相关蛋白1和N-甲基-D-天冬氨酸受体。这导致小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，增加了促炎细胞因子和其他介质的释放。内皮细胞的激活促进了基质金属蛋白酶9的释放，增加了血脑屏障通透性和脑水肿。关于ICH中阿替普酶的了解较少。在Clot Lysis: Evaluation of Accelerated Resolution in Intraventricular Hemorrhage phase III (CLEAR III)试验中，将患者随机分配到通过外部脑室引流给予阿替普酶或生理盐水，阿替普酶被证明与较高的脑脊液白细胞计数相关(对比生理盐水)，即使在调整脑室内出血(IVH)体积和清除率后也是如此。然而，一项对88名IVH患者的非随机研究，其中47名接受了脑室内阿替普酶，显示阿替普酶治疗患者的脑脊液IL-1β呈下降趋势，在第7天达到统计学显著性。因此，阿替普酶在我们的发现中的作用仍不确定，可以通过研究接受不同类型不需要使用阿替普酶的微创手术的患者的样本来解决。最后，尽管77名(87%)参与者在120小时±12小时的24小时内测量了水肿，但少数患者在该时间之外测量了水肿，可能引入了额外的不需要的变化。

总之，在我们小规模的探索性分析中，我们证明了脑内出血患者第一周内血肿中的IL-1Ra与1年后良好预后独立相关，为IL-1Ra和其他IL-1抑制剂在脑内出血中的进一步测试提供了一些支持。血肿IL-1存在至第7天以及良好预后患者中IL-1Ra浓度上升表明IL-1Ra的治疗窗口可能比已完成和正在进行的II期试验中测试的时间更长。最后，我们证明较高的血肿IL-6与1年后良好预后独立相关，表明其在疾病过程中可能通过增强修复和恢复发挥作用。

致谢

本研究由国家卫生与护理研究研究所临床科学家奖(参考编号: CS-2014-14-005)资助，资助对象为A.P.J。MISTIE III由NIH/NINDS (资助编号, 1U01NS080824和5U01NS062851)资助。ICH-Seq由NIH/NINDS (资助编号R01NS097728)资助。我们感谢M. Hoadley和S. Scarth在英国索尔福德索尔福德皇家医院的生物医学设施中进行细胞因子测定的专业知识。我们感谢现场调查员对INFLAME-ICH的支持和研究样本的收集。我们感谢约翰霍普金斯大学的BIOS团队和纽卡斯尔大学的Barbara Gregson，他们在参与中心建立INFLAME-ICH方面的专业知识和支持。我们感谢爱丁堡脑库及其捐赠者提供尸检脑组织，以及中风患者亲属提供同意将标本用于本研究。

作者贡献

A.P.J.、L.S.、W.Z.、M.A.和D.H.对研究的设计和构思做出了贡献；A.P.J.、B.N.、M.G.、M.A.、M.N.、Y.D.、P.K.、S.C.、S.A.和F.R.对数据的获取和分析做出了贡献；A.P.J.、B.N.、M.N.、Y.D.、P.K.、S.C.、S.A.和F.R.对文本撰写或图表准备做出了贡献。