摘要
背景：皮肤干燥和真皮中胶原网络的加速碎片化是皮肤老化的标志。营养是影响皮肤健康及其外观的关键因素。市场上有多种膳食补充剂旨在改善皮肤健康。胶原蛋白肽被用作营养美容产品中的生物活性成分，临床前研究已表明其能改善皮肤屏障功能，诱导胶原蛋白和透明质酸的合成，并促进成纤维细胞的生长和迁移。本研究旨在临床试验中探讨口服特定胶原蛋白肽补充剂对皮肤水分和真皮胶原网络的影响。
方法：开展了两项安慰剂对照临床试验，通过角质层测量法评估每日口服胶原蛋白肽补充剂对皮肤水分的影响，通过高分辨率超声评估胶原密度，通过反射共聚焦显微镜评估胶原碎片化。同时，使用人体皮肤外植体在离体条件下研究胶原蛋白肽对细胞外基质成分的影响。
结果：口服胶原蛋白肽补充剂8周后，皮肤水分显著增加。补充4周后，真皮胶原密度显著增加，真皮胶原网络的碎片化显著减少。这两种效应在12周后仍然持续。离体实验表明，胶原蛋白肽可诱导胶原蛋白和糖胺聚糖的产生，为观察到的临床效果提供了机制解释。
结论：口服胶原蛋白肽补充剂能有效改善皮肤老化的标志。
引言
已知营养对皮肤生理有重大影响。因此，良好的营养状况反映在良好的皮肤健康上，被视为个人健康的替代指标。许多营养补充剂声称对皮肤健康有益，能带来更年轻的外观[1]。不幸的是，这些声称的科学证据往往只是初步的[2]。
年轻皮肤紧致、光滑、有光泽，但随着内在和外在老化过程，真皮和表皮结构发生深刻变化。真皮胶原密度随年龄增长而下降，并与真皮厚度减少相关[3]。真皮胶原网络变得越来越碎片化，表现为更短、更无序的纤维，并积累降解的胶原片段[4]。基质金属蛋白酶（MMP）表达的增加导致胶原降解加速[5]。与此同时，真皮成纤维细胞合成新的细胞外基质成分的速度减慢，无法充分替换降解的基质[6]。乳头状真皮的弹性纤维在老化过程中失去完整性，并延伸到真皮-表皮交界处的距离变小。这种弹性和强度的整体丧失导致皮肤松弛和皱纹[7,8]。透明质酸在表皮和真皮中含量丰富，其数量随年龄增长而减少[9]。这反映在皮肤保持水分的能力下降，导致老年人典型的皮肤干燥，并最重要的是损害表皮屏障功能[10]。
胶原蛋白肽是许多营养美容产品中使用的天然生物活性成分，这些产品是通过口服补充来提供皮肤健康和美容益处的营养补充剂。胶原蛋白肽是具有不同长度的特定肽的混合物，富含羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸等氨基酸，是通过酶水解从动物结缔组织中提取的天然胶原蛋白制成的。羟脯氨酸是胶原蛋白独有的，可用于分析上区分胶原蛋白与其他蛋白质。胶原蛋白肽被有效消化成二肽和三肽，这些肽能抵抗进一步的细胞内水解[11]。这些肽通过转运蛋白PEPT-1穿过肠黏膜[12]。在人体中，含有羟脯氨酸的二肽和三肽在摄入胶原蛋白肽后一小时出现在血液中，浓度达到纳摩尔水平[13]。使用放射性标记的胶原蛋白肽的研究表明，吸收的肽可以到达皮肤[14]，并在组织中保留长达两周[15]。
越来越多的证据表明胶原蛋白肽在临床前研究中能改善皮肤生理参数。胶原蛋白肽被证明能增加真皮成纤维细胞中透明质酸的产量[16,17]，并通过增加角质层含水量来改善皮肤屏障功能[16,18,19]。此外，胶原蛋白肽在mRNA和蛋白质水平上诱导胶原蛋白的合成[20,21]，以及产生更强的胶原纤维[22]，促进皮肤成纤维细胞的生长[23]，并诱导成纤维细胞迁移[24,25]。相比之下，胶原蛋白肽对人体皮肤功效的临床证据仍然很少[26-30]。
因此，我们开展了两个临床试验，显示口服胶原蛋白肽补充剂能增加皮肤水分，并定量和定性改善真皮胶原网络。在人体离体皮肤活检中的研究表明，胶原蛋白肽诱导胶原蛋白和透明质酸的产生。据我们所知，这是首次报道胶原蛋白肽改善真皮胶原碎片化从而对抗皮肤老化标志的临床证据。
材料和方法
测试产品：研究使用了特定鱼源胶原蛋白肽（Peptan®F）和猪源胶原蛋白肽（Peptan®P），平均分子量为2000–5000 Da。所有产品由Rousselot提供。
临床研究1：2008年在日本东京SOUKEN实验室进行了一项最小化、安慰剂对照、平行组、双盲、单中心研究。方案遵循良好临床实践指南和赫尔辛基宣言。所有参与者均签署知情同意书。参与者从SOUKEN实验室数据库中选择，符合以下标准：日本女性，40–59岁，皮肤含水量低，未怀孕，无全身性疾病，无鱼或麸质不耐受，未服用药物或食品补充剂。筛选了60名女性，其中33人被分配到安慰剂组（糊精）或两个治疗组（Peptan®F[鱼]或Peptan®P[猪]）中的一组，按皮肤含水量最小化变异。参与者在睡前服用含有10克安慰剂或10克Peptan的配制饮料。治疗持续56天。在基线、治疗4周和8周后，在受控环境中（室温22±1°C，相对湿度50±10%，适应30分钟后）评估面部皮肤参数。使用Corneometer®设备（CK电子，科隆，德国）在每个受试者的三个不同测量点通过电导率测量皮肤水分水平。使用Tewameter®设备（CK电子）在耳垂和嘴角连线上距离耳垂3厘米处测量经表皮水分流失率（TEWL）。
临床研究2：2012年在法国波尔多COSderma实验室进行了一项随机、安慰剂对照、平行组、双盲、单中心研究。方案经法国伦理委员会批准，遵循法国当局（AFSSAPS）指南。研究遵循良好临床实践指南和赫尔辛基宣言。所有参与者均签署知情同意书。参与者从COSderma实验室数据库中选择，符合以下标准：高加索女性，40–65岁，BMI 18–25 kg/m²，Fitzpatrick光型I–IV，所有皮肤类型，未怀孕，无全身性疾病，无鱼或麸质不耐受，未服用药物或食品补充剂，过去3个月无饮食改变或激素治疗，过去1个月无美容护理，研究前或研究期间无大量日晒。106名女性被随机分配到安慰剂组（麦芽糊精）或治疗组（Peptan®F）。参与者在早餐前服用含有10克安慰剂或10克Peptan的粉末饮料。治疗持续84天。在基线、治疗4周和12周后，在受控环境中（室温20±2°C，相对湿度45±5%，适应20分钟后）评估皮肤参数。在前臂进行单次测量，在整个研究期间，相同位置用于一种测量类型。使用Dermcup®设备（Atys Medical，Soucieu en Jarrest，法国）通过高频实时超声测量真皮胶原密度。在垂直横截面上可视化真皮中的回声胶原纤维和弹性纤维。通过10分量表视觉评分量化回声性。使用Vivascope3000®设备（MAVIG GmbH，慕尼黑，德国）通过反射共聚焦显微镜评估网状真皮中胶原的碎片化，该设备提供表皮和真皮≤5 μm的水平光学切片，最大深度200 μm，可视化细胞微观结构。位于乳头状真皮下25 μm处的堆叠图像提供网状真皮碎片化的信息。使用ConfoScan软件（NIDEK Technologies Srl，Padova，意大利）对图像进行量化。简而言之，在定义的感兴趣区域内通过二值化识别胶原纤维，每个受试者所有时间点使用相同阈值。碎片化计算为对象数量/平均对象表面积。
离体实验：从一名49岁高加索女性的大腿成形术样本中制备平均直径10 mm的人体皮肤外植体。外植体在37°C、5% CO₂条件下，在含5%血清的BIO-EC外植体培养基中培养9天，并与0.01、0.1或1 mg/mL的特定鱼源胶原蛋白肽（Peptan®F）孵育。实验重复三次。在第2、5和7天更换含有产品的培养基。第9天，收获外植体，在Bouin溶液中固定，脱水，石蜡包埋。制备5 μm切片，安装在硅烷化玻片上，进行不同染色。使用Masson三色染色（Goldner变体）观察一般皮肤形态。使用阿尔新蓝染色酸性糖胺聚糖，使用天狼星红染色总胶原蛋白。使用Leica DMLB显微镜在20倍放大下进行显微观察。每个样本的重复组各拍摄10张照片，使用DP 72 Olympus相机（Olympus Life Science，汉堡，德国）。每个条件选择15张代表性图片，使用Olympus CellD软件进行量化。
统计分析：使用SPSS 17.0版（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）或GraphPad Prism 5.04版（GraphPad Software, La Jolla, CA, USA）进行统计分析。正态性通过Shapiro-Wilk检验。基线组间同质性通过ANOVA检验。随时间变化的组内差异以及各时间点治疗组间的差异通过ANOVA或ANCOVA计算，并使用Dunnett检验进行事后分析。P < 0.05视为统计显著。
结果
Peptan改善人体皮肤水分：皮肤老化与含水量下降相关。在第一项临床初步研究中，我们评估了口服Peptan对皮肤水分的影响。33名女性按皮肤含水量最小化变异平均分配到安慰剂组和两个治疗组（图1）。参与者每天口服10克安慰剂或鱼源（Peptan®F）或猪源（Peptan®P）Peptan，持续8周。所有参与者均按方案完成研究，无不良事件报告。评估了两个皮肤水分参数：作为电导率函数的皮肤水分水平和T皮肤水分水平。治疗8周后，与安慰剂组相比，猪源Peptan（Peptan®P）组的皮肤水分水平显著增加，而鱼源Peptan（Peptan®F）组也显示出增加趋势。具体数据如图2所示。经表皮水分流失率（TEWL）在两组间无显著差异（数据未显示）。这表明口服Peptan能有效改善皮肤水分，而不影响TEWL。
Peptan增加人体真皮胶原密度：为了更深入了解Peptan改善皮肤老化参数的功效，我们进行了一项随机、安慰剂对照、双盲试验。106名女性经筛选后被随机分配，每日服用10克安慰剂（n=52）或Peptan（n=54），以调味粉末饮料形式服用，持续12周。101名参与者按方案完成研究，其中18名受试者（安慰剂组n=7，Peptan组n=11）在产品服用方面出现轻微偏离方案（图3）。无不良事件报告。安慰剂组有3名受试者退出，其中2名因个人原因，1名因不依从。Peptan组有2名受试者失访。每组各有1名受试者的反射共聚焦显微镜数据无法分析。因此，下文呈现了安慰剂组48名受试者和Peptan组51名受试者的结果。如表1所示，两组在基线时的年龄、光型分布以及皮肤类型方面无差异。
表1. 随机分配到安慰剂组和Peptan组女性的基线特征。数据以均值（标准差）或人数（百分比）表示。
在老化过程中发生改变的一个主要结构皮肤参数是真皮中胶原层的密度。我们通过高频超声测量回声性来评估Peptan摄入对该参数的影响。在研究过程中，安慰剂组的真皮回声性没有变化。口服Peptan后，早在治疗开始后4周，真皮回声性就与基线值相比出现了高度显著增加，并且这种效应在治疗12周后仍然持续，表明真皮胶原密度随时间持续增加。服用Peptan12周后，治疗效应（12周-0周）显著高于安慰剂组（分别为8.83% vs. 无变化，P = 0.007）（图4）。
Peptan减少人体真皮胶原碎片化：在老化过程中，皮肤中不仅胶原的数量发生变化，胶原网络的质量也会改变。因此，在相同的临床研究中（图3），我们使用Vivascope反射共聚焦显微镜研究了网状真皮中胶原纤维的碎片化程度。这项先进技术提供从角质层向下150微米范围内的共聚焦图像堆栈，胶原纤维呈现为白色结构。
图5a显示了两位受试者在基线时和分别口服安慰剂或Peptan12周后网状真皮的示例图像。12周时，服用安慰剂的受试者（图5a.C）的表皮明显表现出比基线时（图5a.A）更小的胶原结构。相比之下，服用Peptan的受试者在服用12周后（图5a.D）显示出比基线时（图5a.B）更大的胶原碎片。因此，与安慰剂组相比，Peptan组摄入后的胶原纤维碎片化程度更低。
对共聚焦图像的定量分析证实，在安慰剂摄入下，网状真皮的胶原碎片化没有变化（图5b）。相反，摄入Peptan在4周时已显著降低了17.8%的碎片化程度，在12周时则进一步降低了31.2%。这些数据明确证明了Peptan在减少真皮胶原层碎片化方面的功效。
Peptan增加人体皮肤外植体中的胶原和糖胺聚糖含量：上文呈现的数据表明，人体口服Peptan可改善皮肤水分以及真皮胶原网络的质量和数量。为了更好地理解Peptan如何发挥这些作用，我们分析了不同浓度Peptan作用下人体皮肤外植体的一般形态、糖胺聚糖和胶原含量。
皮肤外植体的一般形态未受Peptan孵育的影响。对照组和Peptan处理的外植体均表现出轻微的角化不全，表皮未见刺激迹象，乳头状真皮中的胶原网络细胞化良好（数据未显示）。
如图6所示，基底层表皮中的糖胺聚糖水平在Peptan孵育后增加，在组织学切片中可见为蓝色染色（图6a）。图像量化（图6b）显示，在0.01–0.1 mg/mL Peptan范围内，这种增加呈剂量依赖性，分别增加了5倍和高度显著的18倍。在1 mg/mL Peptan时，效应达到饱和，与对照组相比显著增加了17倍。
与糖胺聚糖含量一致，人体皮肤外植体的天狼星红染色显示，乳头状真皮中的胶原含量在Peptan孵育后增加（图7a）。这种增加是剂量依赖性的，在0.01 mg/mL Peptan存在下增加3%，在0.1 mg/mL Peptan存在下显著增加9%（图7b）。同样，在1 mg/mL Peptan时，效应达到饱和，显著增加了5.4%。考虑到乳头状真皮中胶原的高基础含量，5%的增加被认为是一个明确的生物学差异。
因此，Peptan在增加人体皮肤中结合水的糖胺聚糖和胶原含量方面非常有效。这些效应可能是在临床研究中观察到的皮肤水分增加（图2）和胶原密度增加（图4）的基础。
讨论
胶原蛋白肽是功能性食品和膳食补充剂（如营养美容品）中使用的生物活性成分，有助于改善皮肤生理参数。在本研究中，我们报告了口服特定胶原蛋白肽（Peptan®）的补充剂能改善皮肤水分以及真皮胶原网络的密度和结构。据我们所知，这是首个显示胶原蛋白肽对真皮胶原碎片化有影响的临床研究。对在离体条件下培养的、存在特定胶原蛋白肽（Peptan®）的人体皮肤外植体的分析表明，真皮胶原和表皮糖胺聚糖含量的增加可能是观察到这些生理效应的原因。
皮肤的特性由其不同层的复杂结构决定，这种结构在老化过程中逐渐退化。皮肤含有高达70%的胶原蛋白，为组织提供抗拉强度。然而，胶原蛋白含量随年龄增长而下降，并且绝经期的激素变化会加速女性这一过程[31]。在绝经后的头四年，胶原蛋白的合成减少高达30%[32]。以回声性降低为特征的真皮减弱与皮肤皱纹增加有关[33]。我们发现，女性口服鱼胶原蛋白肽（Peptan®F）补充剂后，通过高频超声测量，真皮胶原密度增加了9%。此外，胶原蛋白肽（Peptan®F）以剂量依赖的方式将人体皮肤外植体真皮中的胶原蛋白量增加了最多5%，考虑到乳头状真皮中胶原的基础含量很高，这可以被认为是一个重要的生物学增加。这一发现有力地表明，胶原蛋白肽通过诱导胶原蛋白合成来增强真皮，并可能因此减少皮肤皱纹。我们的结果与最近两项直接显示口服胶原蛋白肽后胶原蛋白合成被诱导的研究一致。Zague等人[21]报道，给大鼠喂食牛胶原蛋白肽可增加皮肤中I型和IV型胶原蛋白的含量。Liang等人[20]能够将喂食鱼胶原蛋白肽后大鼠皮肤中I型和III型胶原蛋白mRNA和蛋白质水平的诱导与真皮厚度和羟脯氨酸含量的增加联系起来。此外，猪胶原蛋白肽被证明可以增加猪皮肤中胶原纤维的直径[22]。最近，一项使用含有鱼胶原蛋白肽（Peptan®F）配方的初步试验显示，胶原蛋白肽治疗12周后胶原密度增加[26]。另一项临床试验在口服猪胶原蛋白肽补充剂8周后，检测到皮肤淋巴液中前胶原蛋白和弹性蛋白的增加，表明细胞外基质合成被诱导[27]。然而，关于真皮胶原网络结构变化的数据尚未评估。
在皮肤老化过程中，MMP对真皮胶原网络的碎片化已被描述为不仅对皮肤结构，而且对真皮成纤维细胞的微环境都有重大影响[34]。细胞从松弛且日益无序的较短、较细的胶原纤维网络上脱落，缺乏机械刺激，而机械刺激是诱导胶原蛋白合成的关键因素[4,32]。不同MMP的诱导已被描述为与胶原碎片化有关[5]。在培养于胶原网格中的成纤维细胞模型中，MMP1的消化模拟了胶原碎片化对成纤维细胞功能的负面影响，这与在体内老化皮肤中观察到的情况相似[35]。在上述报道的临床研究中，我们使用了一项先进技术——反射共聚焦显微镜，来评估口服鱼胶原蛋白肽（Peptan®F）补充剂对人体皮肤真皮胶原碎片化的影响。胶原蛋白肽补充剂显著减少了网状真皮中胶原的碎片化。据我们所知，这是首个针对这种抗衰老效应的临床证据。先前的一项研究表明，给大鼠喂食鱼胶原蛋白肽可以减少皮肤中的胶原碎片化，这与我们的结果一致[20]。这种效应与MMP1表达降低及其抑制剂TIMP1的诱导有关。
皮肤的水分含量取决于皮肤蒸发率和表皮的水合水平，有助于维持皮肤健康和年轻外观[7]。在上述临床试验中，我们观察到，与安慰剂相比，猪源和鱼源胶原蛋白肽（Peptan®）补充剂后，皮肤水分水平显著增加。然而，TEWL（角质层完整性的衡量指标）未受影响。由于结合水的糖胺聚糖（主要是透明质酸）的存在决定了皮肤的水合水平，我们评估了胶原蛋白肽对人体皮肤外植体表皮中糖胺聚糖的影响。胶原蛋白肽（Peptan®F）非常显著地以剂量依赖方式增加了表皮中糖胺聚糖的数量，表明糖胺聚糖合成的增加是保湿效应的原因。与我们的结果一致，一项非对照研究报告，鱼胶原蛋白肽与氨基葡萄糖和维生素C联用，在干性皮肤女性中6周后增加了皮肤水分和弹性[30]。另一项试验显示，与我们的发现类似，鱼或猪胶原蛋白肽补充剂4周后，皮肤水分呈剂量依赖性增加，但TEWL未受影响[29]。有趣的是，一项使用含有5克鱼胶原蛋白（Peptan®F）配方的开放标签研究报告了皮肤干燥和面部皱纹的改善，表明5克胶原蛋白肽的剂量可能有效[26]。最近的一项临床试验未能观察到猪胶原蛋白肽补充剂8周后对皮肤水分或TEWL的影响；然而，皮肤水分的基线值相当低，并且某些给药剂量非常弱（2.5克/天）[28]。一系列体内研究进一步证明，鱼胶原蛋白肽和胶原蛋白肽衍生的二肽可以预防光老化小鼠模型中含水量的下降和TEWL的增加[16,18,19]，其中一项研究将其与真皮透明质酸含量的增加联系起来[16]。这一提出的作用机制得到了来自一项研究脯氨酸-羟脯氨酸（摄入胶原蛋白肽后人体血液中存在的主要二肽之一）对人体真皮成纤维细胞功能影响的进一步数据支持[36]。观察到脯氨酸-羟脯氨酸可增加透明质酸分泌，这与其增加透明质酸合酶2（HAS2）表达有关，HAS2是透明质酸合成的关键酶[17]。最近，已建立了诱导的HAS表达与人体皮肤水分改善之间的联系[37]。
迄今为止，胶原蛋白肽调节成纤维细胞功能的确切作用机制尚不清楚，但胶原蛋白肽中的某些肽序列可能被成纤维细胞的细胞膜特异性识别。已经在其他细胞类型上进行了大量研究，例如成骨细胞、破骨细胞[38]和软骨细胞，它们源自相同的干细胞系，并共享某些特征，例如产生胶原蛋白的能力。此外，在摄入胶原蛋白肽后循环系统中丰富的二肽脯氨酸-羟脯氨酸和羟脯氨酸-甘氨酸，可能在成纤维细胞中含有一定水平的生物活性[17,18]。
总之，我们提供了临床证据，证明特定胶原蛋白肽（Peptan®）能有效改善皮肤水分，并首次证明能预防和减少真皮胶原网络的碎片化，从而对抗皮肤老化的标志之一。这些生理皮肤参数的改善可能与其在相应皮肤层中增加胶原蛋白和糖胺聚糖的合成有关。这些数据表明，口服特定胶原蛋白肽补充剂可以从内部改善皮肤结构和健康。
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