眼泪作为阿尔茨海默病的一扇窗：关于早期检测生物标志物的系统综述 - 认知障碍

阿尔茨海默病是全球痴呆症的首要原因，其特征是β-淀粉样蛋白和tau蛋白的异常聚集，导致神经元退化和脑萎缩。虽然脑脊液和血液生物标志物已推进了阿尔茨海默病的早期诊断，但这些方法具有侵入性和高成本。本系统综述探究眼泪作为一种非侵入性、易获取的阿尔茨海默病生物标志物来源的潜力。利用与中枢神经系统直接相连的眼泪，我们可以有效检测蛋白质、microRNA和细胞外囊泡，这些物质能够反映神经退行性过程。眼泪收集成本低、患者压力小，允许在整个疾病阶段进行连续的生物标志物监测。本综述重点总结了阿尔茨海默病患者眼泪中特定蛋白质、microRNA和细胞外囊泡的最新发现，并考察了眼泪收集和分析方法。文章强调了这些技术用于早期、易获取疾病检测的潜力。未来需要进一步的研究来标准化方法并在更大的队列中验证生物标志物，使眼泪成为阿尔茨海默病早期诊断和管理的有价值工具。

1 背景

阿尔茨海默病是一种异质性、多因素的神经退行性疾病，是全球痴呆症的主要原因。这种与年龄相关的神经退行性疾病影响着全球超过5000万人，占所有痴呆症病例的60%至70%。全球病例数量的增加与人口逐渐老龄化有关，同时也与诊断水平的提高和患者生存期延长有关。组织病理学上，其特征是两种蛋白质的异常聚集：细胞外β-淀粉样蛋白形成的斑块，以及细胞内过度磷酸化的tau蛋白形成的神经原纤维缠结，导致神经元死亡，最终导致脑萎缩。除了这些蛋白质的累积，参与该疾病发展的其他风险因素还包括遗传、环境、血管和代谢因素。

已知脑结构变化和脑脊液生物标志物浓度可在认知症状出现前20年出现；这段时间是允许早期诊断和增进对该疾病病理生理学演变了解的关键窗口。然而，脑脊液生物标志物需要通过昂贵且侵入的方法获取。近年来，血液生物标志物成为有价值的替代方案，具有收集更容易、成本更低和可及性更高等优势。尽管有这些益处，其临床实施仍面临若干挑战。研究表明，前分析因素存在显著变异——例如样本收集方法、处理时间、试管类型和冻融循环——这些会影响生物标志物（如Aβ42和Aβ40）测量水平的可靠性。此外，血浆生物标志物结果的解释因个体间变异性和诊断阈值中灰色区域的存在而复杂化，特别是在疾病早期阶段。这些局限性凸显了开发新的、非侵入性生物标志物的必要性，这些标志物应能在阿尔茨海默病的所有阶段提供稳定可靠的信息，尤其是在其最早阶段。

寻找新的生物标志物是必要的，因为对高风险阿尔茨海默病发展对象的研究和监测至关重要。此外，开发用于该疾病早期诊断的可靠且敏感的工具将能够通过减缓其进展的药物进行早期干预，保护认知能力，并增进我们对神经退行性过程的理解。

视网膜是中枢神经系统的延伸，提供了一个可以观察大脑神经和血管变化的窗口。光学相干断层扫描对视网膜变化的监测已成为识别各种神经退行性疾病诊断和监测潜在生物标志物的强大诊断工具。

因此，视觉系统可能是阿尔茨海默病早期诊断生物标志物的重要来源。视觉系统的组成部分之一是眼泪，这是一种有趣且重要的生物材料，因为收集简单且与中枢神经系统有关；眼泪被认为是脑脊液和血清之间的中间体液。眼泪由泪腺产生，通过过滤血浆构成，由水、脂质、黏蛋白、核苷酸、维生素、电解质和其他成分组成。其主要成分之一是蛋白质，其中乳铁蛋白和溶菌酶是主要蛋白质。眼泪中潜在的生物标志物包括生长和神经营养因子、细胞因子、细胞黏附分子和免疫球蛋白、性激素、蛋白酶和蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶、钙结合蛋白、糖蛋白，以及尤其令人感兴趣的循环microRNA和细胞外囊泡。

眼泪作为生物标志物具有以下优势：如上所述的眼睛与大脑之间的密切关系；可以通过非侵入性和易于获取的技术收集；可以多次收集，从而允许监测生物标志物的波动。此外，该技术成本有效且对患者造成的最小压力，无论其认知状态如何，且眼泪可以在短时间内收集。

众多研究已提出眼泪可作为正常生物过程和致病状态的指标，这得益于眼泪收集和分析技术的进步。已有多项研究对阿尔茨海默病患者眼泪中的生物标志物进行了研究。本研究基于对可获取、成本有效的阿尔茨海默病诊断工具日益增长的兴趣而展开，并通过提出眼泪作为生物标志物发现的可行介质为该领域做出贡献。它为未来旨在临床转化和将基于眼泪的诊断整合到常规实践中的研究奠定了基础。

本系统综述总结了阿尔茨海默病患者眼泪中识别的主要分子改变，包括蛋白质和microRNA的变化。这些发现根据其参与关键病理过程（如神经退行性变、神经炎症和淀粉样蛋白/tau蛋白病理）的潜力，作为诊断生物标志物进行了讨论。

2 方法

2.1 搜索策略

本系统综述遵循系统评价和荟萃分析优先报告条目2020声明指南进行，并已在Insplasy注册（INPLASY2024120034），DOI：10.37766/inplasy2024.12.0034。我们在PubMed和Scopus中使用医学主题词进行搜索，截止至2024年4月。搜索词为：“阿尔茨海默病”、“眼泪”、“阿尔茨海默病生物标志物”、“蛋白质”、“microRNA”和“细胞外囊泡”，以及它们的可能组合。系统综述中使用的搜索字符串为：(“阿尔茨海默病” OR “阿尔茨海默病” OR “AD”) AND (“眼泪” OR “泪液” OR “眼泪生物标志物”) AND (“蛋白质” OR “microRNA” OR “细胞外囊泡”)。

2.2 研究选择与筛选过程

所有识别的记录导入Mendeley参考文献管理器2.138.0版，并移除重复项。两位独立审稿人（I.L.-C.和R.d.H.）筛选标题和摘要的相关性。然后由同一审稿人独立评估潜在符合条件研究的全文。差异通过讨论或与第三方审稿人（J.M.R.）协商解决。

2.3 纳入与排除标准

医学主题词必须出现在文章的标题、摘要或正文中。所选论文为英文。所有论文必须涉及眼泪与阿尔茨海默病之间的关系。我们还纳入了定义眼泪作为阿尔茨海默病生物标志物概念的文章，或以眼泪与阿尔茨海默病为主要主题的概括性文章。这些文章可能早于专注于综述主题的文章。

建立了明确的纳入和排除标准来选择研究。

纳入标准为：（1）研究眼泪作为阿尔茨海默病生物标志物的研究；（2）英文出版物；（3）具有完整且可获取数据的研究。

排除标准包括：（1）重复研究；（2）无法获取全文的### 2.3 纳入与排除标准

建立了明确的纳入和排除标准来选择研究。

纳入标准为：（1）研究眼泪作为阿尔茨海默病生物标志物的研究；（2）英文出版物；（3）具有完整且可获取数据的研究。

排除标准包括：（1）重复研究；（2）无法获取全文的研究；（3）数据不足或不相关的研究；（4）未聚焦于阿尔茨海默病病理学的研究。

2.4 数据提取

数据由两位审稿人使用标准化表格独立提取。提取的信息包括：

研究类型（如观察性、实验性）
样本量和人群特征
用于阿尔茨海默病/轻度认知障碍的诊断标准
眼泪收集方法
分析技术（如酶联免疫吸附试验、液相色谱串联质谱、表面增强拉曼光谱）
主要发现和识别的生物标志物

2.5 质量评估

虽然未应用正式的偏倚风险评估工具（如诊断准确性研究质量评估-2），因为研究设计异质性大，但我们根据以下方面定性评估了纳入研究的方法学质量：

样本量
诊断标准明确性
眼泪收集和分析的标准化程度
局限性报告

2.6 研究选择过程

研究选择过程分几个阶段进行。最初，我们从多个数据库中识别记录，包括PubMed的1346条和Scopus的1420条，以及来自特定注册库的2766条。之后，我们移除了854条重复记录和633条因其他原因（不相关主题、语言限制、数据不足）的记录。

接着，我们筛选了1279条识别记录的标题和摘要，排除了836条不符合纳入标准的记录。然后我们尝试检索443篇潜在相关报告进行进一步评估。

在全文报告评估阶段，我们评估了443篇报告的合格性。我们排除了60篇分析其他疾病的眼泪、184篇分析其他体液以及104篇非英文撰写的文章。

最终，我们在系统综述中总共纳入了95项研究（参考文献部分60篇参考文献，辅助信息部分35篇参考文献）。

在60篇主要参考文献中，我们区分为聚焦眼泪作为阿尔茨海默病生物标志物的主要研究（9篇）和一般背景研究（51篇）。这9项研究基于以下标准入选：

对阿尔茨海默病患者进行定量眼泪生物标志物分析
包含明确定义的阿尔茨海默病或轻度认知障碍诊断标准
应用先进分析技术（如液相色谱串联质谱、酶联免疫吸附试验、表面增强拉曼光谱）
比较阿尔茨海默病患者与对照组数据的研究

图1提供了研究选择过程的总结；PRISMA检查清单和PRISMA流程图可在辅助信息中获取。

3 结果

3.1 眼泪提取方法：眼泪收集与分析

眼睛与大脑之间结构和功能的关系使眼泪成为阿尔茨海默病生物标志物的替代来源。其稳定的组成、可及性和非侵入性采样使其成为检测阿尔茨海默病标志物的有前途的生物材料，整合了脑脊液和血液的优势，并促进了人群水平的早期检测。此外，眼泪易于收集，可长时间储存直至分析。

3.1.1 收集方法

眼泪收集包括使用Schirmer试纸、微海绵装置、微毛细管和微量移液器。这些方法的总结见表1。

关于最佳眼泪采样方法存在持续争论。在常用方法中，由于简单易行，毛细管和Schirmer试纸最为常用，两者均被认为有用，且未证明哪一种优于另一种。其他作者比较了使用毛细管和Schirmer试纸的眼泪收集，后者导致更高的泪液流速和蛋白质浓度。

眼泪收集的标准方法是微毛细管，该方法无需稀释或离心即可获取样本。然而，该程序需要经过培训的人员。在儿童中，微海绵因其高效率、可重复性和收集时减少不适感而更受欢迎。

关于患者偏好，Quah等人2014年的一项研究发现，74%的患者更喜欢使用Schirmer试纸收集眼泪，而非血液检测，这使得该方法在初级健康筛查中被广泛接受。

对于干眼症或泪液分泌减少的患者，适当的眼泪收集方法是微量移液器提取，先用无菌蒸馏水清洁眼表。该方法能够快速轻松地收集少量液体。然而，它在可重复性和分析所需稀释方面存在挑战，这可能会改变结果。作为替代方案，可以使用泪点塞来阻塞泪液引流并增加泪液量。

最近，泪腺功能单元的神经刺激已被用于通过刺激相应神经来增强泪液产生。鼻内和鼻外装置，以及其他电或化学方法，正被开发并用作增加泪液产生的新策略。

3.1.2 分析方法

蛋白质组学和脂质组学的进展使得在眼泪样本体积有限的情况下进行更精确的分析成为可能，增进了对眼泪在各种疾病中作用的了解。收集后，使用电泳、分光光度法、酶联免疫吸附试验、微阵列和基于珠的测试等技术进行眼泪样本成分分析。

最初为通过眼泪研究阿尔茨海默病而进行的研究使用了（非靶向）质谱法，与后来应用的方法相比，该方法存在某些缺点，因为它对检测低丰度蛋白质的灵敏度较低。在某些情况下，使用了基于选择反应监测的液相色谱串联质谱，可以评估泪液中脂质运载蛋白-1、皮离蛋白、溶菌酶-C和泪液蛋白的蛋白质浓度，以及液体本身的定量。其他作者使用免疫细胞化学测定法测定两名有阿尔茨海默病家族史的健康受试者眼泪中Aβ42的含量。

另一种测定健康个体眼泪中Aβ40和Aβ42浓度的方法是通过电化学免疫传感器进行分析，仅需5 μL样本即可检测疾病特异性蛋白质。这种方法揭示，泪液中Aβ40和Aβ42肽的含量可能比血液中高出10倍，并且Aβ水平可能与健康受试者的年龄相关。使用酶联免疫吸附试验免疫测定法，还在主观认知下降、轻度认知障碍和轻度痴呆的受试者中测量了Aβ38、Aβ40和Aβ42蛋白，并在轻度至中度痴呆患者中采用相同技术测定了Aβ1-42。在后一项研究中，还使用Western blot测定了磷酸化tau和淀粉样前体蛋白C末端片段的浓度。

microRNA的存在研究使用了基于全基因组高通量定量聚合酶链反应的microRNA平台。在同一研究中，为了分析哪些细胞过程可能在眼泪蛋白质中过度表达，使用注释、可视化和综合发现数据库进行了基因本体论分析。

最近，眼泪样本使用自组装纳米颗粒介导的放大荧光免疫分析法进行分析，该法由磁性和荧光团负载的聚合物纳米颗粒组成。该技术用于检测腺苷酸环化酶相关蛋白1作为阿尔茨海默病患者潜在眼泪生物标志物。SNAFIA检测显示出低检测限（236 aM）、优异的可靠性（R² = 0.991）和宽分析范围（0.320–1000 fM），可用于泪液中CAP1的定量。

另一种分析方法是整合了Hu等人开发的快速分离系统的眼泪外泌体分析。该方法利用负压振荡策略分离细胞外囊泡，证明细胞外囊泡可在5分钟内快速浓缩。使用靶向其表面标志物的抗体，在分离后立即通过免疫检测定量细胞外囊泡信号。

3.2 泪液中的测定

3.2.1 蛋白质

2016年，一项研究收集了健康个体和阿尔茨海默病患者的眼泪样本。结果显示，阿尔茨海默病患者的泪液流速（12±2 μg/分钟）显著高于健康对照组（6±2 μg/分钟）。此外，通过定量蛋白质组学、电泳和液相色谱-质谱分析，证明阿尔茨海默病患者眼泪中蛋白质浓度显著增加（8.8±2.9 μg/μL），而健康对照组为（4.4±1.4 μg/μL）。在同一工作中，发现阿尔茨海默病患者眼泪中皮离蛋白水平升高，而泪液蛋白、溶菌酶-C和脂质运载蛋白-1水平降低，提示与该疾病相关的泪腺可能存在功能障碍。作者推测，由于与眼部免疫防御相关的蛋白质水平低，阿尔茨海默病患者可能更容易感染，尽管皮离蛋白的增加可能提供抗感染保护。研究还提示，生物标志物溶菌酶-C、脂质运载蛋白-1、泪液蛋白和皮离蛋白的组合可能具有很高的诊断潜力，在阿尔茨海默病患者中灵敏度高达81%，特异性为77%。

Kenny等人研究了轻度认知障碍和阿尔茨海默病患者的眼泪。在阿尔茨海默病患者中，他们识别出与对照组相比特定蛋白质的富集。此外，作者确定真核翻译起始因子4E是仅在阿尔茨海默病患者样本中存在的一种独特蛋白质。

Gijs等人进行了多项研究以分析与阿尔茨海默病相关的眼泪蛋白质。2019年，这些作者开展了一项研究，评估眼泪作为阿尔茨海默病诊断生物标志物来源的潜力。他们发现Aβ42和总tau与阿尔茨海默病分期呈正相关。此外，他们观察到阿尔茨海默病患者的t-tau水平显著高于轻度认知障碍和主观记忆抱怨患者。此外，作者通过计算受试者工作特征曲线下面积确认了这些发现，t-tau水平的眼泪辨别能力为0.81，Aβ42为0.72。

2020年，同一团队分析眼泪报告称，无论认知障碍或痴呆程度如何，与健康对照组相比，Aβ38、Aβ40、Aβ42、t-tau和p-tau的水平普遍升高。唯一根据疾病严重程度变化的水平是t-tau浓度，与健康受试者相比显著增加。该研究是第一篇证明泪液中存在Aβ肽和tau蛋白的论文。

一年后，同一团队进行了一项观察性研究，纳入了主观认知下降、轻度认知障碍、阿尔茨海默病和健康对照患者，测定了泪液中Aβ肽（Aβ38、Aβ40、Aβ42）、t-tau和p-tau的水平。Aβ40和t-tau在超过94%的所有研究组样本中检测到，并且这些水平随疾病严重程度而增加。然而，Aβ38、Aβ42和p-tau仅在23%的样本中检测到。在对照组患者中，未检测到p-tau，这提高了当脑脊液中检测到t-tau时识别阿尔茨海默病的特异性和敏感性。然而，Aβ42在78%的分析对照组样本中检测到，而阿尔茨海默病患者中不足18%。在相关性分析中，作者观察到脑脊液Aβ42与眼泪t-tau呈负相关，脑脊液Aβ42与脑脊液t-tau也呈负相关。另一方面，泪液中Aβ42和t-tau呈正相关，类似于在血浆中的发现。

关于眼泪中Aβ蛋白的存在，观察到两名有阿尔茨海默病家族史的健康患者表现出升高的Aβ42蛋白水平。泪液中Aβ42的存在与视网膜Aβ42斑块的存在相关，而在没有阿尔茨海默病病史的健康患者眼泪中未观察到这些斑块。因此，得出结论，由于患者表型健康，Aβ42的存在可被视为阿尔茨海默病早期诊断的一种方法。

关于Aβ水平，2023年评估了眼泪中Aβ的诊断作用，并将其与视网膜和脉络膜结构相关联。在这项研究中，作者纳入了轻度和中度阿尔茨海默病、轻度认知障碍和健康对照患者。在轻度认知障碍和阿尔茨海默病患者中，泪液中检测到Aβ1-42水平，特异性为93%，灵敏度为81%。此外，该蛋白水平在轻度认知障碍和阿尔茨海默病组中显著低于对照组。然而，各组间在APP-CTF和p-tau的眼泪浓度方面未观察到显著差异。阿尔茨海默病患者泪液中Aβ1-42水平与脉络膜厚度之间存在统计学显著的相关性。这种相关性可能加强阿尔茨海默病的诊断。

眼泪中的功能性蛋白质之一是乳铁蛋白，一种执行多种生理功能的糖蛋白，包括铁结合/转运、免疫反应调节、以及表现抗氧化、抗炎和抗癌特性，以及神经保护作用。此外，乳铁蛋白已被证明与Aβ结合，并且在阿尔茨海默病患者的大脑中，神经元和小胶质细胞、星形胶质细胞、Aβ老年斑和神经原纤维缠结中检测到的乳铁蛋白浓度高于健康对照组。

阿尔茨海默病患者和健康对照者泪液的表面增强拉曼光谱分析清楚地揭示了这些受试者光谱的变化，表明眼泪蛋白质的构象改变。与蛋白质成分相关的光谱区域显示出最显著的变化，提示构象改变主要归因于乳铁蛋白和溶菌酶。如前所述，这些物质是泪液的主要成分。光谱的区间主成分分析使得能够区分阿尔茨海默病受试者与健康或轻度认知障碍受试者。这是唯一一项分析阿尔茨海默病患者眼泪中乳铁蛋白的研究。

鉴于所有这些发现，可以预期乳铁蛋白水平可作为未来基于眼泪的阿尔茨海默病潜在生物标志物。这些结果总结在表2中。

3.2.2 MicroRNA

miRNA是小的RNA分子，通常长18至22个核苷酸，与信使RNA结合，导致翻译和基因表达抑制。它们存在于所有真核细胞中。miRNA可以分泌到细胞外环境中，并作为各种疾病的生物标志物。此外，它们可能在细胞间通讯中发挥重要功能。这些分子在细胞核中作为初级miRNA转录，在那里被酶切加工并运输到细胞质。在细胞质中，它们通过结合Argonaute家族蛋白进行进一步加工。与这些蛋白结合的miRNA稳定存在于生物体液中，如眼泪。这些miRNA参与星形胶质细胞、小胶质细胞、脑血管系统和与tau蛋白和Aβ相关的突触改变的调节，以及其他功能。已经证明miRNA参与与阿尔茨海默病相关的病理过程，如tau蛋白磷酸化和淀粉样前体蛋白及Aβ的形成。

在阿尔茨海默病患者的血液样本中检测到大量miRNA（见辅助信息）。迄今为止，已从泪液中分离出约300种不同的miRNA。其中许多是新识别的，其调控功能在很大程度上仍未明确。此外，少数研究探索了眼泪样本中的miRNA。在Kenny等人的研究中，发现阿尔茨海默病患者眼泪中miRNA总水平升高，高于轻度认知障碍和对照组。值得注意的是，miRNA-200b-5p作为眼泪潜在生物标志物出现，其在患者眼泪样本中的水平显著高于轻度认知障碍和对照组。这些结果表明，泪液分析可作为阿尔茨海默病有前途的诊断工具。

4 讨论

眼泪生物标志物分析代表了阿尔茨海默病早期检测和监测的一种有前途且非侵入性的方法，为诊断和临床研究领域提供了新的视角。然而，尽管研究数量众多，但仍需考虑标准的统一、方法的标准化以及确定哪些生物标志物可能对该病早期诊断最有效等问题。

4.1 最适合神经退行性疾病患者的收集方法

建立样本收集、储存、处理和分析方法的标准至关重要，以便于研究之间的比较并确保所获数据的一致性和可靠性。结果的差异可能源于样本收集、分析过程和储存方法的不同。收集眼泪时，必须避免激活角膜神经和反射性流泪，因为这会显著改变泪液的组成。此外，外部因素如环境条件、采样时间和持续时间、渗透压、人工泪液或隐形眼镜的使用，以及局部和全身药物的应用，都会影响泪液的组成并影响结果的解释。昼夜节律变化也可能改变泪液组成，因此在一天中的同一时间采集样本以最小化这些潜在影响非常重要。

此外，样本处理应标准化。收集后，样本必须转移到干冰上以防止蛋白质降解。此外，不应使用保护性或稳定化溶液来防止降解，因为它们可能干扰样本分析。最后，储存应以等分形式在-80°C下进行。此外，应避免冻融循环，以防止样本的任何降解或改变。

阿尔茨海默病患者通常是老年人，众所周知泪液功能随年龄增长而下降。这可能需要对老年患者进行多次访问以获得足够样本。在本综述分析的方法中，使用Schirmer试纸似乎是最合适的。然而，应注意该方法需要约5分钟的收集时间和后续的样本提取处理。此外，收集的样本通过重量估算，在加工过程中蒸发可能使测量复杂化并歪曲溶质的浓度。也已证明该技术可因与眼表直接接触而诱导反射性流泪增加。此外，已经在阿尔茨海默病患者眼泪蛋白质研究中使用了该技术的作者推测，某些蛋白质的表达可能是由收集方法本身引起的，因为Schirmer试纸可能包含除眼泪外的细胞。

另一种合适的选择是使用微毛细管收集眼泪，虽然这可能是一种较慢的方法且容易因眨眼而中断，但提供更容易的样本处理，并且在分析上提供最准确的泪液分析物浓度。此外，由于这些患者可能因高龄和神经退行性病理而存在泪液分泌不足，可能需要事先刺激泪液功能或用不同体积的盐水溶液诱导分泌。然而，需要考虑这些程序可能导致样本稀释，从而歪曲结果。

最后，我们发现只有一项已发表的协议专门针对阿尔茨海默病中眼泪样本的未来分析和收集：TearAD研究。这凸显了在这些患者中标准化眼泪收集技术的必要性。TearAD研究是一项多中心、纵向观察性研究，具有批准的设计，涉及认知健康对照以及主观认知下降、轻度认知障碍和阿尔茨海默病患者。将从这些参与者处收集眼泪样本，使用Schirmer试纸，并通过多重免疫测定法测定Aβ38、Aβ40、Aβ42、t-tau和p-tau的水平。该研究将分析这些蛋白质与海马萎缩以及通过正电子发射断层扫描或脑脊液确定的Aβ阳性之间的潜在相关性。它还将评估泪液、血液和脑脊液中Aβ和tau蛋白水平的一致性。

4.2 更精确的分析方法

在寻找新生物标志物过程中对眼泪成分的研究正引起医学诊断领域的兴趣；然而，由于可用样本量有限以及其组成和分析的复杂性，技术挑战依然存在。

迄今为止，已识别出多种眼泪蛋白质和脂质作为与各种疾病相关的潜在生物标志物。近年来，蛋白质组学、代谢组学和脂质组学等技术的进步显著增进了对眼泪生化组成的理解。这些技术对眼泪成分的收集、储存和分析有特殊要求。然而，它们已经能够识别出包括眼泪在内的多种体液中的众多生物标志物。

阿尔茨海默病患者的眼泪成分已在九项研究中得到分析，每项研究都采用了不同的样本分析技术。使用的方法总结在表2中。可以看出，没有一项研究使用完全相同的分析方法，这表明我们距离开发标准化的分析方法还很远。

在Kalló等人的研究中，使用电泳和液相色谱串联质谱分析眼泪样本，并开发并应用了基于选择反应监测的靶向蛋白质组学方法来检查眼泪蛋白质的定量变化。由于眼泪中蛋白质浓度高，只接受那些至少有两个肽段能以>95%置信度检测到的蛋白质。

拉曼光谱已被证明在眼泪蛋白质组成研究中很有用。然而，该技术在灵敏度、噪声/信号水平和可重复性方面存在局限性，原因在于眼泪成分的非均质性。为了克服这些限制，已开发出表面增强拉曼光谱，它在光谱信号的灵敏度和特异性方面显示出改进的结果。

一种仅在健康受试者中测试过的分析方法是使用电化学免疫传感器测定Aβ。该方法表现出高精度，比其他分析技术更快且更具成本效益，使其成为早期检测的潜在测试。

尽管取得了这些结果，但作者们意识到他们研究的局限性，并建议需要更高灵敏度和精确度的测试。

4.3 更具诊断性的眼泪测定

关于阿尔茨海默病患者是表现为泪液流速增加还是减少，尚未达成共识。同样，对于哪些蛋白质表现出差异表达，或阿尔茨海默病患者眼泪中的总蛋白质浓度，似乎也没有一致意见。

根据Kalló等人的研究，阿尔茨海默病患者眼泪中唯一增加的蛋白质是皮离蛋白，一种具有广谱活性的抗菌蛋白。在这些患者中减少的眼泪蛋白质包括脂质运载蛋白-1、泪液蛋白和溶菌酶，它们在防御机制和眼部化学屏障中发挥作用。广谱抗菌蛋白的增加与参与免疫防御的蛋白质的减少之间的平衡可以解释为什么阿尔茨海默病患者不会遭受更多眼部感染。尽管样本量较小（14名阿尔茨海默病患者和9名年龄匹配的对照），但作者建议，泪液流速增加且这些蛋白质浓度改变的个人应接受检查以排除阿尔茨海默病。

得益于Kenny等人的结果，我们知道阿尔茨海默病患者的眼泪中含有高浓度的miRNA，此外还有独特的蛋白质组成。虽然阿尔茨海默病中miRNA增加的确切原因尚不清楚，但已知miRNA表达会响应于阿尔茨海默病退行性过程中常见的细胞紊乱而迅速改变。这些变化，加上阿尔茨海默病中发生的眼部改变，可能会驱动细胞反应，增加阿尔茨海默病患者眼泪中的miRNA表达。

只有miR-200b-5p被确定为可能的眼泪生物标志物，因为它仅在阿尔茨海默病患者的眼泪样本中发现。然而，尽管作者提出miRNA-200b-5p可作为阿尔茨海默病的良好生物标志物，但这似乎不太合理，因为它与眼睛和中枢神经系统（两者均与阿尔茨海默病有关）的关系受到质疑。

有趣的是，在阿尔茨海默病小鼠模型中的研究也调查了miRNA（见辅助信息）。因此，确定哪些眼泪miRNA与该病的发病机制密切相关将很重要。

尽管Li及其合作者认为其浓度在健康个体和轻度认知障碍患者之间没有差异令人惊讶，但重要的是要考虑轻度认知障碍是大多数神经退行性疾病前驱阶段神经退行性变以及自然衰老导致的认知损伤所产生的一种异质性状态。此外，并非所有轻度认知障碍患者都会发展为阿尔茨海默病。在阿尔茨海默病患者泪液中差异表达的蛋白质中，发现了eIF4E。这些数据与eIF4E在阿尔茨海默病患者大脑中过度表达是一致的。

Cennamo等人还证明，阿尔茨海默病患者的眼泪发射光谱显示出不同的蛋白质构象，特别是乳铁蛋白和溶菌酶，与轻度认知障碍患者和健康受试者相比。这项研究侧重于在轻度认知障碍中似乎发生改变并在阿尔茨海默病中更为显著的次级蛋白质结构评估。乳铁蛋白水平的这些改变已在之前的研究中报道过，这些研究分析了阿尔茨海默病患者的唾液样本。因此，乳铁蛋白作为阿尔茨海默病生物标志物的重要性在于该蛋白与APP加工调节及其与Aβ聚集和神经炎症联系的关联。

Gijs等人的工作是首个证明泪液中存在Aβ肽和tau蛋白的研究。此外，这些作者展示了这些蛋白质的存在具有区分阿尔茨海默病患者与对照的高度能力。同样，作者强调了t-tau水平在健康受试者与痴呆、轻度认知障碍和主观认知下降患者之间的差异，但在比较这三种病理状态时未发现这些差异。然而，健康受试者眼泪中未发现p-tau这一事实很有趣，因为它可以区分健康受试者和具有一定程度痴呆的患者。此外，作者警告说，原始眼泪样本的处理必须稀释，且进行免疫测定需要大样本量，这使得使用眼泪样本变得困难。作者证明，眼泪t-tau水平在神经退行性变患者中升高，脑脊液Aβ42蛋白与眼泪t-tau呈负相关。这表明眼泪样本可能在t-tau方面反映脑脊液样本，并且泪液中的这些蛋白质在诊断疾病严重程度和神经退行性变方面具有潜力。然而，眼泪样本的临界值尚无法确定。

在Gharbiya等人的研究中，展示了轻度认知障碍和阿尔茨海默病患者眼泪中Aβ1-42水平的降低。关于眼泪中Aβ1-42水平降低的可能解释可能类似于脑脊液中的情况，即肽被隔离在脑内。然而，在这种情况下，减少可能是由于在泪腺内的隔离。此外，在泪腺及其腺泡细胞中发现的Aβ片段可以解释眼泪中Aβ1-42的低水平。

4.4 细胞外囊泡：阿尔茨海默病中基于眼泪的生物标志物的未来方向

尽管细胞外囊泡已在脑脊液、血液和唾液等其他生物体液以及各种神经退行性和全身性疾病中得到广泛研究，但它们在阿尔茨海默病中通过泪液的作用在很大程度上仍未被探索。通用术语“细胞外囊泡”指从内体系统（外泌体）和质膜（微囊泡或胞外体）释放的脂质囊泡。它们被认为是一种新型的细胞间通讯系统，促进蛋白质、RNA、脂质和代谢物的转移。这些囊泡几乎可以从所有组织和细胞中脱落，并在通过循环体液（如血液、尿液、脑脊液、唾液、乳汁和眼泪）运输细胞间信号和效应分子方面发挥关键作用，使其成为医学诊断和治疗的重要来源。眼泪已被确定为与血液样本类似的液体活检中细胞外囊泡的来源。由于泪液分泌过程，眼泪携带着来自身体其他看似无关器官的丰富生物信息。分析眼泪中细胞外囊泡的研究已证明其价值，突出了它们识别眼部系统病理变化（如干眼症和青光眼）以及非眼部组织变化（如乳腺癌和前列腺癌）和中枢神经系统疾病（如多发性硬化症和帕金森病）的能力。

在神经退行性疾病的背景下，已提出这些细胞器在脑内错误折叠蛋白质的传播中发挥作用。此外，已证明胶质细胞与神经元之间的部分通讯是由细胞外囊泡介导的，并且它们的破坏对这些疾病的发展有影响。细胞外囊泡在中枢神经系统中执行的功能范围从清除不需要的生物分子到传播与神经退行性疾病相关的致病蛋白质。在临床前模型和患者样本中对细胞外囊泡（外泌体和微囊泡）的蛋白质组学表征有可能揭示在传统神经退行性变生物标志物显现之前影响正常生理的新型蛋白质和分子网络。

分析细胞外囊泡相对于全生物体液的优势在于，后者中存在的大量蛋白质可能会阻碍对低丰度生物标志物的识别。

尽管在寻找外泌体时应探索的首要生物材料是脑脊液，因其靠近中枢神经系统，但该技术对患者来说痛苦，会引起患者显著焦虑，存在风险，并需要训练有素的临床人员。然而，已有研究表明脑脊液和血液中存在细胞外囊泡（见辅助信息）。

有明确证据表明细胞外囊泡可以穿过多种生物屏障，如在脑脊液、血液和眼泪中存在胶质/神经元来源的细胞外囊泡所证明的那样。由于泪液分泌过程，眼泪携带着来自身体其他起初看似无关的器官的丰富生物信息。

鉴于眼泪收集的非侵入性和细胞外囊泡丰富的生物信息含量，探索它们在泪液中的存在和诊断价值可能为阿尔茨海默病的早期检测和监测开辟新途径。

我们建议未来的研究应侧重于：

开发从泪液中分离细胞外囊泡的标准化方案
表征阿尔茨海默病泪液来源细胞外囊泡的蛋白质组和转录组特征
比较眼泪、血液和脑脊液中的细胞外囊泡生物标志物，以评估一致性和诊断效用

4.5 局限性

本系统综述存在一定的局限性。尽管存在大量研究调查各种体液（脑脊液、血浆或血液）中的阿尔茨海默病生物标志物，但值得注意的是，其中只有少数使用了眼泪。此外，所综述的研究也存在若干局限性。首先，样本量小限制了结果的普适性。此外，眼泪收集方法的变异，如使用Schirmer试纸、微毛细管、微海绵和微量移液器，导致结果不一致。分析方法缺乏标准化也影响了研究之间的可比性。外部因素如年龄、疾病阶段、药物使用和环境条件可能影响眼泪组成，从而影响结果。最后，许多研究是横断面研究，限制了建立因果关系的能力。

为推进该领域发展，必须标准化眼泪收集和分析方法。还需进行更大规模和更多样化样本的研究以验证发现。纵向研究对于观察生物标志物随时间的变化及其与疾病进展的关系将非常有价值。此外，应探索眼泪中的新生物标志物，如细胞外囊泡，作为阿尔茨海默病的潜在指标。最后，开发可用于医疗实践以进行早期诊断和疾病监测的眼泪收集和分析临床方案至关重要。

5 结论

总之，尽管眼泪分析领域在阿尔茨海默病的研究和早期检测方面看起来非常有前景，但仍需标准化样本收集、预处理和分析的方法。此外，研究应涉及更大规模的队列，并且纳入标准必须统一。需要建立与疾病相关的各种诊断蛋白质和miRNA浓度的临界值。

在这种神经退行性疾病中一个尚未探索的方法是研究和分类这些患者眼泪中的细胞外囊泡。最后，目前，这些测定尚不能单独被视为该病的诊断依据。我们相信，当与其他已建立的眼部生物标志物（如通过OCT测量的视网膜厚度变化和血管改变）结合时，它们可能代表阿尔茨海默病早期诊断的重要一步。

作者贡献

概念化：I.L.-C.，J.M.R.，和R.d.H.；方法论：I.L.-C.，R.M.-C.，Y.H.-R.，L.S.-P.，L.E.-H.，E.S.-G.，J.A.M.，J.A.F.-A.，H.L.-L.，J.J.S.，A.I.R.，J.M.R.，和R.d.H.；验证：I.L.-C.，E.S.-G.，A.I.R.，J.M.R.，和R.d.H.；正式分析：I.L.-C.，R.M.-C.，Y.H.-R.，L.S.-P.，L.E.-H.，E.S.-G.，J.A.M.，J.A.F.-A.，H.L.-L.，J.J.S.，A.I.R.，J.M.R.，和R.d.H.；调查：I.L.-C.，（R.M.-C.，Y.H.-R.，L.S.-P.，L.E.-H.，E.S.-G.，J.A.M.，J.A.F.-A.，H.L.-L.，J.J.S.，A.I.R.，J.M.R.，和R.d.H.；资源：J.J.S.，A.I.R.，J.M.R.，和R.d.H.；数据管理：I.L.-C.，R.M.-C.，Y.H.-R.，和R.d.H.；写作—初稿准备：I.L.-C.，R.M.-C.，Y.H.-R.，J.M.R.，和R.d.H.；写作—审阅与编辑：I.L.-C.，R.M.-C.，Y.H.-R.，L.S.-P.，L.E.-H.，E.S.-G.，J.A.M.，J.A.F.-A.，H.L.-L.，J.J.S.，A.I.R.，J.M.R.，和R.d.H.；验证：I.L.-C.，E.S.-G.，A.I.R.，J.M.R.，和R.d.H.；可视化：I.L.-C.，R.M.-C.，Y.H.-R.，J.M.R.，和R.d.H.；监督：I.L.-C.，R.M.-C.，Y.H.-R.，J.M.R.，和R.d.H.；项目管理：J.J.S.，A.I.R.，J.M.R.，和R.d.H.；资金获取：J.J.S.，A.I.R.，J.M.R.，和R.d.H.。所有作者均已阅读并同意稿件发表版本。

致谢

L.S.-P.目前由马德里康普顿斯大学的博士前奖学金（CT82/20-CT83/20）支持。J.A.M.目前由马德里康普顿斯大学的博士前奖学金（CT58/21-CT59/21）支持。L.E.-H.由H2020-SC1-BHC-08-2020资助的101189689号拨款以及FIB.HCSC-IDISSC 22TS-49-2024号拨款支持。H.L-L.由MCIN/AEI/10.13039/501100011033和FSE+资助的PRE2021-100112号拨款支持。