赞比亚发育迟缓与严重急性营养不良儿童的小肠微生物群Small intestinal microbiota in Zambian children with stunting and severe acute malnutrition | Philosophical Transactions of the Royal Society B | The Royal Society

摘要

儿童营养不良与肠道微生物组变化相关；然而，大多数研究关注粪便样本，对小肠微生物组的了解较少。本研究对赞比亚发育迟缓（即非同时消瘦）的儿童（n=53）和严重急性营养不良（SAM）儿童（n=24）的十二指肠微生物群进行了特征描述，并比较了全球不同地区发育迟缓儿童的微生物组。通过16S rRNA基因扩增子测序分析了十二指肠抽吸物。探讨了细菌组成与临床特征及肠病生物标志物之间的关联。还通过使用公开可用数据集比较不同国家营养不良儿童的十二指肠16S rRNA基因数据集，评估了年龄和地理对微生物多样性和组成的影响。在发育迟缓和SAM儿童中，十二指肠微生物群均以链球菌属、颗粒链菌属、吉米杆菌属和克雷伯氏菌属为主。与发育迟缓儿童相比，SAM儿童的α多样性较低。荟萃分析揭示了不同国家年龄匹配儿童的细菌组成相似性，但相对丰度及其与营养状态的关联存在差异。本研究为不同营养不良状态下儿童的十二指肠微生物群提供了见解，强调了地理和年龄因素在塑造近端小肠微生物群方面的潜在影响。

本文是"生物、生物医学和环境驱动因素对发育迟缓的影响"主题特刊的一部分。

1. 背景

营养不良仍是全球重大公共卫生挑战，约1.48亿5岁以下儿童受发育迟缓影响，4500万受严重急性营养不良（SAM）影响[1]。发育迟缓和SAM均与死亡风险增加、认知发育受损和终身健康后果相关，但这些营养不良形式表现出不同的病理生理特征。发育迟缓是一种慢性营养不良形式，导致随时间推移的生长受损和发育延迟，而SAM则表现为更直接、危及生命的营养不良形式，需要紧急干预。这些营养不良类型的潜在原因复杂且多因素，涉及饮食摄入不足、感染、卫生条件差以及肠道微生物群可能的改变[2–4]。

肠道微生物群因其在儿童健康、生长和免疫中的作用而受到关注。在生命早期，肠道微生物群经历动态成熟，受年龄、饮食、环境和遗传因素影响，在营养吸收、免疫功能和抵御病原体方面发挥作用[5,6]。新兴研究表明，肠道微生物群的破坏（称为生态失调）可能通过损害营养吸收和降低代谢效率而加剧营养不良[7–9]。微生物群的破坏已被牵涉到发育迟缓和SAM中；大多数这些研究已对粪便微生物群进行了表征[10–16]。由于样本采集的挑战，相对较少的研究对小肠的微生物群落进行了剖析[17–19]，而营养吸收主要发生在此处。十二指肠微生物群与大肠中的微生物群不同，这是由于pH值、氧水平、营养暴露、抗菌肽、粘液组成和胆汁暴露的差异[20]。鉴于十二指肠微生物群与营养环境的直接界面，了解该区域肠道的微生物景观可能揭示将营养不良与生长受损联系起来的机制的关键见解。

本研究旨在表征赞比亚仅发育迟缓或SAM（其中大多数也是发育迟缓）儿童的十二指肠细菌群落。此外，通过将赞比亚发育迟缓儿童的十二指肠微生物特征与全球多个国家其他发育迟缓队列的报告进行比较，我们还试图评估年龄和地理位置对小肠细菌组成的影响。

2. 方法

(a) 严重急性营养不良与仅发育迟缓比较

(i) 参与者和样本采集

这是一项横断面比较研究，样本来自先前报告的对住院SAM儿童[21]和赞比亚卢萨卡一个高密度社区中发育迟缓儿童进行的研究[22]。

发育迟缓儿童（BEECH研究）

2016年8月至2019年6月，297名0-18个月大、发育迟缓（身高-for年龄z分数（LAZ）≤-2）、消瘦（体重-for身高z分数（WLZ）≤-2）或营养不良（体重-for年龄z分数（WAZ）≤-2）的儿童在BEECH研究中被招募，如前所述[22]。他们接受了营养补充，包括高能量蛋白质补充剂（玉米-大豆混合物）、每日一个鸡蛋和多种微量营养素撒剂（Nutromix，Hexagon Nutrition，钦奈，印度），并随访至少六个月。118名儿童在连续四个月没有显示连续阳性线性生长且LAZ仍低于-2的情况下被宣布为无响应者，接受其他生长失败原因的调查，然后转诊进行食管胃十二指肠镜检查（OGD）。持续腹泻和过去一个月服用过抗生素的儿童未被纳入本研究。在内窥镜检查期间从53名儿童收集了十二指肠抽吸物，立即速冻并保存在-80°C。在内窥镜检查前立即采集血液样本；血浆和血清通过离心分离，并在-80°C储存以供后续肠病标志物评估。

儿童SAM（营养不良肠病研究）

在大学教学医院住院并接受标准营养康复（即基于牛奶的饲料F75和F100）的34名SAM儿童（WLZ≤-3，或中上臂围（MUAC）<11.5厘米，或存在水肿）被招募到营养不良肠病研究中，如前所述[21]。简言之，在获得知情同意后，对患有SAM和原因不明的持续腹泻（粪便寄生虫学和培养阴性）的儿童进行食管胃十二指肠镜检查（OGD）。抗生素根据SAM管理的国家指南开具，但未常规监测。由经验丰富的儿科医生在OGD当天评估儿童以确认适合内窥镜检查，然后从6:00后禁食F100饲料，直到10:00进行内窥镜检查。2名儿童在OGD时不符合WLZ≤-3、MUAC<11.5厘米或水肿存在的标准，因为在安排前人类生长测量和其他临床特征有所改善。所有儿童均作为病房中的SAM病例进行管理。

从24名儿童收集了十二指肠抽吸物，并立即速冻并保存在-80°C。在内窥镜检查前采集空腹血液样本并如上所述处理。

(ii) 研究肠病标志物

使用两种不同的ELISA测定血浆中的肠道脂肪酸结合蛋白（iFABP）：剑桥生物科学（Cambridge，UK）用于仅发育迟缓的儿童，Hycult Biotech（Uden，Netherlands）用于SAM儿童。三个分析物使用相同的方法在两个队列中进行分析：血浆脂多糖（LPS）使用Pyrochrome Limulus阿米巴细胞裂解物（LAL）测定法（Associates of Cape Cod，Liverpool，UK）测量；sCD14通过ELISA（R&D systems，Minneapolis，USA）测定；胰高血糖素样肽-2（GLP2）通过血清ELISA（Millipore）测量。根据制造商说明进行测定，血浆/血清样本稀释，使相应分析物落在标准曲线范围内。

(iii) 十二指肠活检的组织学评估

在两项研究中，使用标准一次性活检钳从十二指肠第二部分收集内窥镜活检，如前所述[23]。将三块活检组织最初放入生理盐水中以帮助在解剖显微镜下定向，然后转移到醋酸纤维素条（0.45μm孔径；目录号11106-30-N，Sartorius AG）上的甲醛盐溶液中。固定在10分钟内完成；样品嵌入石蜡蜡中，用苏木精和伊红染色，并使用Olympus VS120扫描显微镜成像。形态测量如前所述进行评估[24]。

(iv) DNA提取和16S rRNA基因扩增子测序

样本在-80°C下储存3-4年后提取DNA；即ME研究样本为2014/2015-2018年，BEECH样本为2017/2018-2021年。将先前在-80°C冷冻的十二指肠抽吸物（BEECH约200μl；ME 100μl）解冻，并添加尖峰细菌（Alicyclobacillus acidiphilus）（9.90×10^5个细胞/样本^(-1)），以实现细菌丰度的后续绝对定量。此方法未考虑不同细菌类群之间的16S rRNA基因拷贝数变异。在2ml Axygen螺帽管中将抽吸物在5000 g×10分钟、10°C下离心沉淀。去除所有上清液仅剩50μl后，加入50μl蛋白酶K（2μg/μl，最终浓度1μg/μl）消化10小时，65°C，然后在95°C下孵育10分钟以使酶失活。通过加入250μl 0.1mm氧化锆硅胶珠、一个3.97mm钢球、710μl 2x缓冲液A（0.2M NaCl，0.2M Tris，0.02M EDTA）和20% SDS的500:210（v/v）混合物以及500μl pH 8苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，v/v），提取DNA。使用Biospec Minibeadbeater-96进行珠磨4分钟。使用Qiagen QiaQuick凝胶提取柱纯化提取的DNA。使用条码515F和806R引物扩增16S rRNA基因的高变区4[25]。PCR方案包括一个94°C 2分钟的循环，随后进行35个扩增循环，每个循环包括：94°C变性15秒，50°C退火30秒，68°C延伸30秒。之后进行一个68°C 2分钟的循环。条码扩增子测序（2×250核苷酸配对端读取；Illumina MiSeq仪器）深度为1.06×10^5±1.61×10^4（平均+s.d.）每份十二指肠抽吸物样本用于营养不良肠病研究参与者，以及5.6×10^4±1.21×10^4（平均±s.d.）每样本用于BEECH研究抽吸物。

(v) 统计分析和生物信息学

对250核苷酸配对端读取进行解复用，并使用基于DADA2的自定义管道（见数据可用性）对噪声进行去噪并识别扩增子序列变异（ASVs）。在R v.4.3.1中使用基于SILVA rRNA数据库（release 138.1）的朴素贝叶斯分类器进行分类分配。为确定每个十二指肠抽吸物样本中的细菌负载，(i)将原始ASV计数转换为相对丰度，(ii)对尖峰（基于Alicyclobacillus属分配）的ASV相对丰度求和，(iii)计算细菌负载（每毫升样本的细胞数）为（每毫升样本添加的尖峰细胞数）×（1-尖峰相对丰度）/尖峰相对丰度）。然后从计数丰度表中移除分配给尖峰的ASVs，并使用DESeq2[26]估计的大小因子对原始计数进行归一化，以解释库大小的差异。通过将DESeq2归一化数据乘以细菌负载生成绝对计数。这些绝对丰度值用于下游分析。

过滤掉模糊分类分配（在科水平为线粒体或在纲水平为叶绿体）的ASVs，留下989/1035个ASVs用于分析。使用msa.v.1.34包[27]在R中使用默认设置对ASV序列进行多序列比对，然后用作输入创建用于系统发育树构建的邻接算法的距离矩阵。

使用绝对ASV丰度和Shannon多样性指数量化α多样性，以考虑ASV均匀性。还计算了Faith系统发育多样性（PD）指标以考虑系统发育多样性。为检查α多样性与参与者特征（如营养不良组、年龄和人体测量学（LAZ、WAZ和WLZ））之间的关系，进行了线性回归。

Shannon多样性指数或Faith PD是因变量，参与者特征是预测变量。使用DHARMa包[28]评估模型的残差诊断，显示大多数模型满足正态理论推断假设（电子补充材料，数据集1）。那些不满足任何假设的模型最多有两个异常值，但仍考虑用于推断。对单变量关联进行p值≤0.05的后续多变量模型检验，调整营养不良组、年龄和性别。由于与营养不良组存在共线性，未调整HIV状态和母乳喂养状态，这通过相关矩阵进行评估（电子补充材料，数据集1）。多变量模型中的p≤0.05被认为具有统计显著性。

使用Bray–Curtis距离对相对属丰度进行β多样性量化。使用PERMANOVA +附加组件在PRIMER7[30]中实施的带有Behrens–Fisher修改的非参数多变量方差分析（PERMANOVA）测试了不同营养不良类别的比较，以解释不平衡组[29]。还评估了样本到中心点距离的β分散的T检验分析（PERMDISP）。

使用分析组成微生物组偏差校正2（ANCOM-BC2）[31]的对数线性建模来确定观察到的属计数是否在营养不良组（作为分类变量）之间不同，或是否与人体测量学和形态测量学等样本特征相关。原始微生物计数数据通常高度偏斜且不服从正态分布，这违反了线性回归的假设并可能导致不可靠的结果。此外，属级丰度的范围可能差异很大，使直接比较具有挑战性。对数归一化是常用方法，用于稳定方差、减少极端值的影响并将数据带入不同分类单元的可比尺度。

组间比较仅根据年龄和性别进行调整，因为母乳喂养和HIV状态与营养不良组相关。未出现在仅一个组中的属未包含在此分析中，但在结果中注明。与样本临床特征的关联根据年龄、性别、母乳喂养和HIV状态进行调整。所有分析限于至少在10%的样本中出现的属。

对于所有关联，使用Benjamini–Yekutieli错误发现率对p值进行多重测试校正，pFDR≤0.05表示统计显著性。报告的结果是那些不同丰度并通过ANCOM-BC2敏感性分析以消除假阳性的结果。绘制突出显著关联的散点图和箱线图以确定真实关联和由异常值驱动的关联。这是通过目视观察图表完成的。

(b) 跨研究十二指肠细菌组成荟萃分析

(i) 纳入研究

本荟萃分析包括四项研究（包括上述BEECH研究，第2a(i)节），使用16S rRNA基因扩增子测序评估营养不良儿童的小肠细菌群落。没有可用的来自年龄匹配健康儿童的小肠16S rRNA基因数据集。我们分析中包含的其他三项研究如下所述。

AFRIBIOTA项目

这项病例对照研究招募了来自马达加斯加安塔那那利佛和中非共和国班吉的2-5岁儿童，以了解发育迟缓儿童（LAZ<-2）小肠微生物组的组成[32]。任何HIV血清阳性、急性营养不良（WLZ≤-2）、持续腹泻或过去两周服用过抗生素的儿童均被排除。使用鼻十二指肠插管从46名发育迟缓儿童收集十二指肠抽吸物样本，DNA提取使用QiaAmp cador Pathogen Mini商业试剂盒进行，增加了珠磨步骤。使用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒进行了进一步提取，以在使用v4.SA501–v4.SA508和v4.SA701–v4.SA712引物进行PCR扩增后去除文库中不需要的扩增子。在MiSeq仪器上对扩增子文库进行测序。该研究未提供绝对丰度。

与该研究相关的31个FASTQ文件（项目ID：PRJEB27868）用于此分析。从相应发表数据[17]检索的元数据未包括人体测量学的数值，因此所有样本均包含用于发育迟缓的分类分析。该数据集中发育迟缓被分类为中度（-3<LAZ≤-2）或重度（LAZ<-3）。

孟加拉国环境肠病（BEED）研究

该社区干预旨在验证EED候选生物标志物并确定潜在治疗目标。对生活在达卡、孟加拉国的12-18个月大发育迟缓儿童（LAZ≤-2）或有发育迟缓风险（LAZ -1至-2）的儿童进行了为期三个月的牛奶/鸡蛋营养干预，旨在改善线性生长[18]。对LAZ未改善且无其他临床症状的儿童进行食管胃十二指肠镜检查（OGD）。在内窥镜检查期间从36名儿童收集了十二指肠抽吸物，用于16S rRNA基因扩增子测序，DNA提取和测序使用与上述赞比亚数据集类似的方案进行。

与该研究相关的序列读取档案中有58个配对端FASTQ文件（项目ID：PRJEB32184），全部检索到。从相应发表数据[18]检索元数据，显示一些儿童有多个FASTQ文件。这些作为单独的FASTQ文件处理，并在评估组成和丰度下游后对相对丰度取平均。OGD时的人体测量学用于分析。我们排除了16名非发育迟缓（LAZ≥-2，n=15）或严重消瘦（WLZ≤-3，n=1）的儿童，留下17名儿童用于荟萃分析。

环境肠病和营养不良研究（SEEM）

这是一项社区干预研究，旨在识别从巴基斯坦Matiari取样的消瘦儿童（WLZ≤-2）活检样本中的EE特征[33]。儿童从出生开始登记并每月监测。如果第九个月WLZ≤-2，则提供标准营养干预（AchaMum）。在2个月营养干预后WLZ仍≤-2且无已知营养不良原因的儿童有资格进行OGD。从43名这些儿童中收集了十二指肠抽吸物，用于16S rRNA基因扩增子测序，DNA提取和测序使用与上述赞比亚数据集类似的方案进行。

从所有43个已识别样本（项目ID：PRJEB75181）中检索配对端FASTQ文件，并从相应发表数据[19]获取元数据。我们排除了14名非发育迟缓（LAZ≥-2，n=9）或严重消瘦（WLZ≤-3，n=5）的儿童，留下29名儿童纳入荟萃分析。

(ii) 数据提取、处理和生物信息学分析

本分析中使用的所有数据集均公开可用，并使用NCBI的SRA Linux工具包检索。用于分析的修改脚本可在GitHub上获得（见数据可用性声明）。检索的FASTQ文件使用DADA2 ITS primerHit函数检查引物序列，该函数在BEED和SEEM数据中识别出引物序列，但在AFRIBIOTA数据集中未识别。使用BBTools移除引物序列。使用与自定义管道相同的步骤进行ASV调用和分类分配，稍作修改以适应AFRIBIOTA数据集的单端读取。未对AFRIBIOTA数据集进行绝对丰度量化。对于具有多个FASTQ文件的样本，在分析前对相对丰度取平均。本分析中使用的SRA ID和相关元数据列于电子补充材料，表S1中。

使用Shannon指数估计每个样本的α多样性，并使用回归分析评估与人体测量学的关联，调整研究、年龄和性别。使用DHARMa包[28]评估模型的残差诊断，显示所有模型均满足正态理论推断假设（电子补充材料，数据集S2）。使用Bray–Curtis距离对属相对丰度估计β多样性，使用PCoA图可视化，并使用成对PERMANOVA和样本到中心点距离的β分散方差分析（PERMDISP）测试与国家和研究的关系。

此分析限于具有类似提取、测序和数据处理方法的年龄匹配组。SEEM数据集的样本测序深度高于BEED和BEECH数据集。BEED和SEEM未显著不同（电子补充材料，图S1）。使用大小因子对数据进行缩放，以解释测序深度的差异，但没有缩放或变换数据可以完全"校正"跨不同研究收集的信息量差异。

使用ANCOMBC2确定核心属（定义为至少80%样本中存在的属）的绝对丰度与人体测量学的关联，并根据年龄、性别和研究进行调整。对于所有关联，使用Benjamini–Yekutieli错误发现率对p值进行多重测试校正，pFDR≤0.05表示统计显著性。报告的结果是那些不同丰度并通过ANCOM-BC2敏感性分析以消除假阳性的结果。绘制突出显著关联的散点图和箱线图以确定真实关联和由异常值驱动的关联。

为评估BEED和SEEM数据集中可能由基于人体测量学阈值的子集导致的关联差异，还对完整数据集进行了属绝对丰度与LAZ（BEED）或WLZ（SEEM）的对数转换绝对丰度之间的Pearson相关性，遵循其原始分析中使用的方法。零值在对数转换前替换为0.01。

(c) 样本和参与者特征

与儿童相关的特征（即人体测量学、年龄、性别、生物标志物和形态测量学指标）被总结为中位数和四分位数范围（IQR）。使用卡方检验分析分类变量之间的差异，使用Mann–Whitney U检验分析连续变量。

3. 结果

(a) 赞比亚研究人群特征

赞比亚研究组由77名儿童组成（53名来自BEECH研究的发育迟缓儿童和24名来自营养不良肠病研究的SAM儿童），年龄相似（SAM儿童中位年龄为15个月，发育迟缓儿童为18个月）。样本采集时的研究人群如表1所示。62%来自SAM的营养不良肠病研究儿童也是发育迟缓的，但来自BEECH研究的发育迟缓儿童中无一人严重消瘦（WLZ≤-3）。总体而言，与仅发育迟缓的儿童相比，SAM儿童中HIV阳性儿童更多。SAM儿童也具有更高的肠病标志物水平和更高的胃pH值，反映了这些儿童中已知的高发病率无酸症[34]。两个组之间的形态测量学指标相似，但最严重的肠病见于SAM儿童[21]。

表1. 研究队列在样本采集时的描述。WAZ，体重-for年龄Z分数；LAZ，身高-for年龄Z分数；WLZ，体重-for身高Z分数；GLP2，胰高血糖素样肽2；iFABP，肠道脂肪酸结合蛋白；LPS，脂多糖；sCD14，可溶性CD14；N缺失，缺失数据的儿童数量。

注：所有统计量均表示为中位数与四分位范围（IQR）或分类变量的百分比。

(b) 营养不良赞比亚儿童的十二指肠微生物景观

从发育迟缓和SAM组的十二指肠抽吸物中回收的细菌群落主要由厚壁菌门（链球菌属、吉米杆菌属、颗粒链菌属和嗜酸菌属）、变形菌门（假单胞菌属、嗜血杆菌属）和放线菌门（放线菌属）组成（图1A），其中链球菌属在SAM和发育迟缓儿童中分别占所有读数的56.4±30.9%和65.7±18.8%（图1A；电子补充材料，表2）。这两个组之间的测序深度没有差异（表1）。

与SAM儿童相比，发育迟缓队列的α多样性更高，如Faith PD和Shannon指数所测量（图1B）。当这些儿童一起分析时，Faith PD与年龄（β=0.184，p=0.016）、WAZ（β=0.658，p=0.013）呈正相关，与sCD14（β=-1.039，p=0.0077）呈负相关（电子补充材料，图S2，表S3）。Shannon指数也与WAZ（β=0.142，p=0.013）呈正相关，与sCD14（β=-0.202，p=0.016）呈负相关（电子补充材料，表S4）。这些α多样性指标与sCD14的关联，但不是与年龄和WAZ的关联，在纳入混杂因素（营养不良组、HIV状态和母乳喂养状态）的回归模型中仍然显著（电子补充材料，图S2，表S3 & S4）。

PERMANOVA分析表明，不同的营养不良组具有显著不同的肠道微生物群，主要是由于每组内群落分布方式的差异（图1C）。SAM儿童比仅发育迟缓儿童表现出更多的个体间变异。

(i) SAM和仅发育迟缓队列之间十二指肠微生物群的差异

在每个队列中至少10%的样本中检测到81个属（电子补充材料，表S2）。其中HT002、瘤胃球菌属、Subdoligranulum、Blautia、Fecalibacterium、克雷伯氏菌属、副拟杆菌属、Agathobacter、Prevotella_9、Ligilactobacillus以及Butyricicoccaceae、Enterobacteriaceae和Prevotellaceae家族中的未知属几乎仅在SAM儿童中检测到，而Allorhizobium–Neorhizobium–Pararhizobium–Rhizobium、柯林斯菌属、F0332、Lachnospiraceae家族中的未知属、Methylobacterium–Methylorubrum、Ralstonia、TM7x、[Eubacterium] nodatum组、Mogibacterium和[Eubacterium] yurii仅在仅发育迟缓的儿童中检测到。克雷伯氏菌属占一名SAM儿童和严重水肿（水肿=3）儿童97%的细菌含量。

在两个组中都存在的属中，10个属的丰度差异显著（图2）。与仅发育迟缓的儿童相比，SAM儿童中Alloprevotella（对数折叠变化（LFC）= -2.01，p=0.001）和埃希氏菌-志贺氏菌属（LFC= -2.48，p=0.001）的丰度更高。Abiotrophia（LFC= 1.92，p= 5.27×10^-5）、放线菌属（LFC= 2.75，p= 4.52×10^-7）、Burkholderia–Caballeronia–Paraburkholderia（LFC= 1.38，p= 0.004）、棒杆菌属（LFC= 1.27，p= 0.021）、吉米杆菌属（LFC= 1.78，p= 0.001）、颗粒链菌属（LFC= 1.74，p= 0.004）、Peptostreptococcus（LFC= 1.53，p= 0.005）和假单胞菌属（LFC= 2.04，p= 0.004）在发育迟缓儿童中的丰度更高（电子补充材料，表S5）。

还使用回归分析对属计数与人体测量学、形态测量学和生物标志物数据之间的关系进行建模。该分析未发现这些指标与赞比亚儿童特定细菌属丰度之间的强关联（电子补充材料，表S6和S7）。

(c) 跨国家发育迟缓儿童的小肠细菌谱

我们随后将赞比亚发育迟缓儿童（BEECH队列）的十二指肠细菌谱与使用16S rRNA基因扩增子测序表征小肠微生物群的其他发育迟缓儿童队列进行了比较。这些包括来自中非共和国（CAR）和马达加斯加（AFRIBIOTA）、孟加拉国（BEED）和巴基斯坦（SEEM）的发育迟缓儿童。来自CAR和马达加斯加的儿童比赞比亚、孟加拉国和巴基斯坦的儿童年长（表2；电子补充材料，图S3）。赞比亚儿童的中位LAZ评分最低，且大多数这些儿童有严重发育迟缓（LAZ≤-3）（电子补充材料，图S3），而巴基斯坦儿童的WAZ最低，其中55%严重营养不良（表2；电子补充材料，图S3）。

表2. 荟萃分析中包括的每个国家的人体测量学分布。CAR，中非共和国；N，样本数量；WAZ，体重-for年龄Z分数；LAZ，身高-for年龄Z分数；WLZ，体重-for身高Z分数。

注：所有统计量均表示为中位数与IQR或分类变量的百分比(%)。AFRIBIOTA儿童未提供数字人体测量学。

CAR和马达加斯加儿童的α多样性（电子补充材料，图S4a）显著更高，并且与所有其他样本集群分开（电子补充材料，图S4b）。成对PERMANOVA分析表明，AFRIBIOTA儿童的微生物群与BEECH、BEED和SEEM队列显著不同（电子补充材料，表S8）。BEECH和SEEM队列的β多样性没有差异，但与BEED队列均显著不同。

为了解年龄匹配儿童中在DNA提取和测序流程相似的鉴别微生物特征，我们排除了AFRIBIOTA研究进行差异丰度分析。这表明孟加拉国儿童的十二指肠微生物群具有比巴基斯坦和赞比亚儿童更高的Shannon多样性（图3A），并在PCoA分析中与它们分开（图3B）。LAZ和WAZ评分最低（分别为-6.45和-5.03）的儿童在巴基斯坦研究中入组，所有站点参与者中的α多样性最低（Shannon指数=0.013）。当一起分析时，α多样性与LAZ、WAZ和年龄相关（电子补充材料，表S9，图S5）。

与巴基斯坦（平均丰度=66.9±20.2%）和孟加拉国（平均丰度=43.4±23.1%）的十二指肠抽吸物一样，链球菌属是赞比亚队列中的主导属，其次是相对丰度中的吉米杆菌属、颗粒链菌属、嗜血杆菌属、奈瑟菌属和罗氏菌属。这些属加上放线菌属、棒杆菌属、Leptotrichia和韦荣氏球菌属构成了至少80%样本中存在的核心属（表3，图3C）。在ASV方面，有两个ASV映射到链球菌属，一个ASV映射到吉米杆菌属，两个ASV映射到颗粒链菌属，这些ASV在每个队列中至少80%的儿童中存在，并在所有三个组中共通（表3）。

在BEECH、BEED和SEEM研究中纳入荟萃分析的至少80%发育迟缓儿童的核心属和ASV的流行率和平均丰度。

注：NA表示特定组中核心属组中不存在该属。

在联合分析的数据集中，未观察到这些核心属与人体测量学（LAZ、WAZ或WLZ）之间的关联（电子补充材料，表S10-S12）。当对各个研究进行关联分析时，也观察到同样的情况（电子补充材料，表S13-S15）。这可能是因为本荟萃分析的纳入标准仅限于在样本采集时LAZ≤-2且WLZ≥-3的样本，显著降低了BEED和SEEM的样本量。当使用类似其原始分析的方法分析完整数据集时，LAZ与之前确定的所有核心分类群一致呈负相关，除了BEED数据中的放线菌属和棒杆菌属（电子补充材料，表S16），而在SEEM队列中未观察到与WLZ的关联（电子补充材料，表S17），如先前报道[18,19]。

4. 讨论

本研究表征了SAM儿童和发育迟缓儿童的十二指肠细菌景观，揭示了两个营养不良类别之间微生物多样性、组成和年龄相关趋势的几个区别。

链球菌属在两组儿童的十二指肠微生物群中均成为最丰富的属，这与在其他营养不良儿童队列[18,19]以及患有小肠炎症性疾病的成人中的观察结果一致[35-37]。链球菌属富含具有与碳水化合物和氨基酸代谢相关基因的物种[38]。通过这些途径分解营养物质可能会增加它们在小肠中的生物利用度[39]，并进一步导致短链脂肪酸的产生，为肠细胞提供能量。一些物种，如从小肠中分离出的链球菌equinus，也显示出免疫调节特性[40]。

链球菌属已被证明与韦荣氏球菌属共同出现，韦荣氏球菌属在粪便样本中的丰度与营养不良相关[17,41]。韦荣氏球菌属在94.4%的仅发育迟缓的赞比亚儿童中存在。属于奈瑟菌属、颗粒链菌属、吉米杆菌属、罗氏菌属和放线菌属的分类群在我们的赞比亚研究队列中也很普遍；这些属通常在患有包括营养不良在内的胃肠道疾病的成人小肠中被检测到[36]。比较健康成人志愿者上部和下部肠道的研究也表明这些属是小肠的核心成员[39,42,43]。与疾病的区别可能不是这些属的存在/缺失，而是与健康参与者相比这些属的相对比例。在癌症研究中，链球菌属丰度的增加与疾病相关[44,45]。在我们的分析中，未观察到这些核心属的丰度与人体测量学或肠病特征之间的关系。

大多数研究小肠内容物的研究都采用了16S rRNA基因扩增子分析，这通常仅提供属水平的分辨率，因此物种和特定菌株的关联相对探索不足。需要进行额外的研究，采用更深入的宏基因组测序，具有更高的分辨率，以探索与特定细菌菌株及其编码的代谢特征的关联。十二指肠代谢组学和小肠的元转录组分析也可能提供对这些属和物种在营养不良中的功能作用的见解。

α多样性的降低通常被用作肠道生态失调的指标，并与不良健康结果相关[46-49]，但与使用粪便样本的大多数发育迟缓儿童研究一样[50]，我们未观察到赞比亚发育迟缓儿童或仅SAM儿童的α多样性与人体测量学之间的关联。与发育迟缓儿童相比，SAM儿童的十二指肠微生物群的α多样性（由Faith PD和Shannon指数测量）较低，这可能是这些儿童使用抗生素的结果。这是赞比亚和其他国家按照WHO指南治疗SAM的标准护理。SAM儿童中HIV的患病率也高于仅发育迟缓儿童；HIV也与儿童α多样性降低相关[51]。在赞比亚、孟加拉国和巴基斯坦发育迟缓儿童十二指肠微生物群的联合分析中，α多样性与LAZ和WAZ呈正相关。

我们观察到炎症（sCD14）与发育迟缓儿童的α多样性之间存在微弱的负相关，但在SAM儿童中不存在。sCD14作为免疫激活和肠道屏障功能障碍的生物标志物[52]，在单核细胞和巨噬细胞暴露于细菌LPS后释放。这种差异可能反映了由微妙的微生物失衡和增加的肠道通透性驱动的低度炎症状态，这与发育迟缓儿童的肠病相关。在SAM儿童中未观察到类似关系可能表明，在更严重的营养不良形式中，微生物群已经如此紊乱，以至于α多样性不再是这些儿童屏障功能障碍差异的有信息性的指标。

粪便微生物群在健康儿童生命的前2-3年经历动态发育计划，功能多样性增加，这一过程在急性营养不良儿童中受到干扰[53,54]。由于技术和伦理原因，不可能对健康婴儿和儿童的小肠微生物群进行纵向采样，这意味着目前缺乏关于小肠微生物群是否存在类似的"正常"成熟计划的知识。尽管缺乏此类纵向数据，本研究扩展了我们对肠道这一重要区域微生物群的理解。

发现了几种在十二指肠中特定于SAM或仅发育迟缓的分类群。SAM儿童表现出更高比例的克雷伯氏菌属、埃希氏菌-志贺氏菌属和Blautia。在粪便样本中，克雷伯氏菌属和埃希氏菌-志贺氏菌属先前已与营养不良相关，与健康儿童相比[13]。相反，发育迟缓儿童携带了诸如[Eubacterium] nodatum和Mogibacterium等分类群，这些是口腔微生物群的常见成员[55]。这些对比的微生物谱可能反映了SAM与发育迟缓的独特微生物适应或贡献。值得注意的是，SAM儿童的胃pH值高于发育迟缓儿童，这可能会影响口腔微生物向十二指肠区室的传播；然而，在我们的分析中，这与任何微生物特征或多样性指标均未相关。需要进一步工作来确定口腔微生物群的去区室化如何有助于营养不良儿童小肠微生物群中一些这些分类群的优势。

与BEED研究[18]不同，其中核心分类群被确定为与线性生长呈负相关，或SEEM研究[19]中，Granulicatella adiacens和Abiotrophia defectiva与炎症标志物脂质运载蛋白呈正相关，在赞比亚儿童中未观察到特定细菌分类群的丰度与人体测量学或EE标志物之间的强关联。这可能是因为这些研究之间招募标准不同、样本量和分析方法不同。原始的BEED和SEEM分析使用对数转换数据的Pearson相关性，而这里，这些关系使用线性回归进行评估，包括性别和年龄作为协变量。当我们使用BEED和SEEM数据集的较小子集（即仅那些LAZ≤-2和WLZ≤-3的子集，类似于赞比亚儿童）进行荟萃分析时，未观察到细菌丰度与人体测量学之间的关联。这可能是由于样本量减少、不同的分析方法和/或人体测量学作为小肠微生物群和肠道屏障功能当前状态的不精确代理的结果。为解决这些问题，未来更大的研究需要对年龄和地点匹配的有和没有EED/营养不良的儿童进行小肠微生物群采样。这将需要开发更可预测的EED生物标志物和非侵入性小肠微生物群采样技术[56,57]。

荟萃分析还包括来自CAR和马达加斯加队列的儿童，他们明显比其他组年长。他们的微生物多样性明显更高，微生物群富含Alloprevotella、梭杆菌属和韦荣氏球菌属，与赞比亚、孟加拉国和巴基斯坦的儿童相比。这一发现与现有文献一致，表明肠道微生物多样性在儿童早期往往随年龄增加，尽管这以前仅通过粪便样本进行评估[58,59]。

(a) 优势

本研究的优势在于，在同一实验室使用相同的方案和分析管道对来自赞比亚、孟加拉国和巴基斯坦的样本进行了测序。

(b) 局限性

本研究有几个局限性，其中最显著的是SAM儿童常规接受抗生素作为标准临床管理的一部分，遵循WHO指南。这是已知且可能是该组观察到的微生物谱的主要贡献者；然而，这未被常规监测。因此，抗生素使用、持续时间和与采样时间的接近性的影响在我们的分析中未被考虑。

此外，所使用的样本并不代表SAM或发育迟缓儿童的全部谱系。也就是说，所包括的儿童要么有持续腹泻，要么对营养干预反应不佳。仅发育迟缓儿童是从单个社区招募的，而住院SAM的儿童则来自多个社区。尽管如此，登记调查表明，大多数SAM儿童来自社会经济地位、供水、饮食和卫生与招募发育迟缓儿童的社区相似的社区[60,61]。此外，缺乏来自年龄和地理位置匹配的健康儿童的十二指肠样本限制了研究结果的可解释性。

iFABP测量使用不同的试剂盒对两个赞比亚组进行，这可能引入我们分析中未考虑的技术变异。

使用16S rRNA基因扩增子测序在解决物种和菌株水平变异方面有限，因此无法精确界定不同群落的代谢能力。宏基因组测序与微生物RNA-Seq相结合将提供对各自细菌群落编码功能的更深入见解。

对于荟萃分析，DNA提取和PCR扩增可能存在方法学混杂。AFRIBIOTA数据集是使用与BEECH、BEED和SEEM数据集不同的技术从DNA中生成的。用于靶向16S rRNA V4区域的引物也与BEED、BEECH和SEEM研究不同。

5. 结论

本研究提供了关于营养不良儿童小肠微生物群的宝贵见解，并强调了地理、年龄和营养状况在塑造小肠微生物群方面的潜在作用。需要进行额外的研究，包括更大队列的仔细表型儿童，加上年龄匹配的健康对照（未来可能通过较少侵入性的胶囊采样技术实现），以及更复杂的测序技术，以确认这些和其他因素对小肠微生物组成结构和表达功能的影响。未来的研究还应调查干预措施（如靶向营养补充）或针对微生物群的疗法（如益生元和益生菌）如何改变营养不良儿童的小肠细菌多样性和代谢，以及这些变化对肠道屏障功能和营养吸收的影响。了解这些关系可能会揭示改善生长结果和增强抵抗营养不良相关肠病弹性的新方法。

伦理

BEECH（参考006-02-16）和营养不良肠病（参考006-01-13）研究分别于2016年5月31日和2013年4月11日获得赞比亚大学生物医学研究伦理委员会批准。

数据可用性

赞比亚儿童的16S RNA数据集可在ENA上找到，登录号为PRJEB94106和PRJEB94105。处理原始数据所用的代码可在GitLab上获取：

补充材料可在线获取[62]。

人工智能使用声明

我们在创建本文时未使用人工智能辅助技术。

作者贡献

M.N.M.：正式分析，可视化，撰写-原始草稿，撰写-审阅和编辑；K.A.：正式分析，方法学，撰写-审阅和编辑；V.K.：正式分析；N.P.McN.：方法学，监督，撰写-原始草稿，撰写-审阅和编辑；E.B.：正式分析，撰写-审阅和编辑；M.J.B.：概念化，方法学，项目管理，监督，验证，撰写-审阅和编辑；J.P.：验证，撰写-审阅和编辑；B.A.：概念化，数据管理，监督，撰写-审阅和编辑；J.I.G.：概念化，资源，监督，撰写-审阅和编辑；P.K.：概念化，资金获取，项目管理，资源，撰写-原始草稿，撰写-审阅和编辑。

所有作者均最终批准出版，并同意对所执行的工作负责。

利益冲突声明

我们声明无竞争利益。

资金

资金来源于比尔和梅琳达·盖茨基金会（OPP1066118）和医学研究委员会（MR/K012711/1和MR/V012452/1）提供给P.K.。

主题

这是关于"生物、生物医学和环境驱动因素对发育迟缓的影响"主题特刊的14篇贡献之一。

补充

电子补充材料可在线获取：

致谢

我们感谢Rose Banda、Likando Munalula、Rose Soko和已故的Nancy Mulamfu对参与这些研究的儿童提供的专业护理。我们感谢Marty Meier、MariaLynn Crosby和Jessica Hoisington-López（华盛顿大学）在DNA分离和纯化以及16S rRNA基因扩增子测序方面的协助。

【全文结束】