肠道微生物群稳态失衡可能导致骨代谢异常和骨质疏松。本研究旨在探讨美国成年人肠道微生物群膳食指数（DI-GM）与骨质疏松之间的关联，识别关键膳食成分，并建立一个包含饮食和临床因素、可用于临床的风险预测模型。我们对9065名成年人进行了横断面分析。DI-GM根据膳食摄入数据计算，骨质疏松是主要结局指标。采用加权多变量逻辑回归模型评估DI-GM与骨质疏松的关联，并计算比值比（OR）及其95%置信区间（CI）。此外，采用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归识别关键膳食成分。最后，构建了一个整合临床和营养因素的预测模型，并通过受试者工作特征曲线（ROC）分析进行评价。DI-GM每增加一个单位，骨质疏松风险降低10%（调整后OR=0.90，95%CI:0.83-0.99）。较高的DI-GM有益成分摄入也与骨质疏松风险降低相关（OR:0.88；95%CI:0.79-0.98）。LASSO筛选出大豆、发酵乳制品和加工肉类是最具影响力的膳食因素；大豆和发酵乳制品摄入量较高与骨质疏松风险降低相关，而加工肉类摄入量较高则与风险增加相关。该预测模型表现出良好的区分能力（AUC=0.757）。较高的DI-GM与骨质疏松风险降低相关，特定膳食成分可能驱动这一关联。所提出的模型可能有助于对骨质疏松高风险人群进行个体化的饮食风险分层和预防策略制定。
- 引言
骨质疏松是一种广泛而严重的骨骼疾病，其特征是骨密度降低、骨微结构破坏、骨脆性增加和骨折风险升高。[1] 全球有超过2亿人受其影响，仅美国每年的医疗费用就超过135亿美元。[2] 2019年，全球55岁及以上人群中每年发生多达3700万例脆性骨折，相当于每分钟约70例骨折。[3] 此外，既往脆性骨折会显著增加后续骨折的风险。[4] 因此，骨质疏松的预防和管理已成为老龄化人口面临的关键公共卫生优先事项，旨在减轻医疗负担、缓解医疗系统压力并提高生活质量。[5]
近期研究表明，骨质疏松患者（包括动物模型）与健康人群之间的肠道微生物组成存在显著差异，骨丢失的严重程度与微生物变化呈正相关。[6,7] 由Kase等人开发的肠道微生物群膳食指数（DI-GM）反映了日常饮食与微生物群相关的质量，最初利用美国国家健康与营养调查（NHANES）数据在美国成年人中建立并验证。[8] 后续研究扩展了DI-GM在不同人群中的适用性；值得注意的是，Jiang等人在香港老年人群中对DI-GM进行了验证，发现较高的得分与更好的认知功能相关。[9] 现有研究还发现，较高的DI-GM得分与代谢功能障碍（如中风、糖尿病和非酒精性脂肪肝）的风险增加相关。[10-12] 将DI-GM与骨骼健康联系起来的研究证据正在出现；Fang等人在绝经后女性中观察到DI-GM与骨质疏松呈负相关，但总体文献仍然有限。[13] 因此，我们在一个大型、多样化的成人队列中评估了DI-GM与骨质疏松之间的关联，以进一步阐明饮食-微生物群-骨骼健康轴。
在先前研究的基础上，本研究整合了NHANES 2007-2018年的数据，探讨DI-GM与骨质疏松之间的潜在联系。本研究特别评估了较高的DI-GM得分（反映改善的饮食模式）是否与降低的骨质疏松发病率显示出统计学显著的相关性。采用先进的机器学习技术，包括最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归，以识别关键膳食决定因素，并随后开发了一个个性化风险评估框架。
- 方法
2.1. 数据来源
本研究的数据集来自NHANES连续5个周期的公开记录（2007-2018年）。该研究严格遵守观察性临床研究的STROBE指南，并获得了国家卫生统计中心（NCHS）伦理委员会的批准。所有参与者均签署了书面知情同意书。NHANES采用混合抽样策略，整合了多阶段概率和分层随机方法，以确保全面且有效的健康数据收集。
2.2. 研究人群
本研究利用了NHANES 2007-2018年的数据。研究共纳入59,842名个体。我们排除了16,799名缺失骨密度（BMD）数据的个体和28,542名缺失DI-GM数据的个体。排除后，有14,051名受试者提供了完整数据。此外，排除了年龄<20岁的个体（n=5436），最终队列包括9065名成年人。参与者被分为两组：8876名无骨质疏松的成年人和189名骨质疏松患者（图1）。
（图1：显示2007-2018年NHANES参与者筛选流程的流程图。NHANES=国家健康与营养调查。）
2.3. 骨质疏松的诊断
本研究以骨质疏松作为主要结局指标。骨密度（BMD）通过双能X射线吸收测定法测量，目标为前4个腰椎（L1-L4）或双侧髋关节。将股骨颈或腰椎的T评分≤-2.5作为骨质疏松的诊断标准。T评分的计算公式为（参与者BMD与健康参考人群平均BMD之差）除以参考组的标准差。[14]
2.4. DI-GM评估
我们根据Kase分类框架构建了微生物群聚焦的膳食指数（DI-GM），该框架是利用NHANES数据在美国成年人中建立和评估的，此后已在多项NHANES分析中得到应用。[8,15] 有益贡献成分包括植物性主食（如豆类和浆果）、发酵底物和富含纤维的谷物。由于国家健康调查中的数据限制，省略了茶类子类型。由于NHANES的膳食回忆数据中未区分茶类，绿茶被排除。[8] 负面因素包括加工肉类、精制谷物、红肉和高脂肪饮食。DI-GM得分根据NHANES 2007-2018年的膳食回忆数据计算。[8] 评分标准：如果有益成分的摄入量达到或超过性别特异性中位数，则得1分；否则得0分。有害成分如果摄入量超过中位数，则得0分；否则得1分。[16] 总分范围为0-13（有益成分0-9；有害成分0-4），并分为0-3、4、5和≥6四个等级。[17]
2.5. 协变量
本研究选择的变量基于先前确定的与骨质疏松显著相关的特征。人口统计学特征包括年龄、种族、性别和体重指数（BMI）。社会经济维度包括教育水平和婚姻状况。健康相关行为变量包括吸烟史和饮酒史。临床合并症指标包括尿酸、磷、血清钙、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、血尿素氮（BUN）、骨折史、糖尿病和高血压。缺失数据采用统计插补技术进行分析。
2.6. 统计方法
本研究仔细整合了NHANES的复杂抽样方法，采用加权分析技术以增强研究结果的代表性和可靠性。NHANES通过分层多阶段概率抽样方法实现国家级代表性。根据国家卫生统计中心（NCHS）的协议，通过使用抽样权重（WTMECPRP）、伪层（SDMVSTRA）和伪聚类（SDMVPSU）来调整设计复杂性。首先根据骨质疏松状态对参与者分层，然后按DI-GM四分位数分组。对于正态分布的连续变量，使用加权t检验（两组）或方差分析（多组）。对于非正态分布的变量，使用加权Mann-Whitney U检验（两组）或Kruskal-Wallis检验（多组）。分类变量采用加权卡方检验进行评估。连续数据以加权均值±SD表示，分类数据以加权频率（%）表示。
应用加权多变量回归模型评估DI-GM与骨质疏松风险之间的关联。构建了三个逐步调整模型：模型1控制了人口统计学变量（年龄、性别和种族）；模型2纳入了社会经济因素（教育水平、婚姻状况）；模型3全面调整了生活方式（吸烟、饮酒、BMI）和临床参数（血清钙、ALT、AST、尿酸、ALP、BUN、磷、高血压、骨折和糖尿病）。使用带有平滑样条的广义加性模型探索潜在的非线性关系，而森林图用于可视化亚组一致性。LASSO回归识别关键膳食预测因子，并将其整合到风险预测列线图中。模型准确性通过受试者工作特征曲线和曲线下面积（AUC）指标进行验证，统计学显著性设定为P<.05。使用DecisionLime 1.1进行分析，并通过交叉验证确保稳健性。
- 结果
3.1. 基线特征
表1分析了9065名参与者的基线数据，分为骨质疏松组（n=189）和非骨质疏松组（n=8876）。骨质疏松组参与者的平均年龄（47.1岁）显著高于非骨质疏松组（39.2岁，P<.001）。种族构成差异显著，骨质疏松组中墨西哥裔比例较高（29.1%），而非西班牙裔黑人（13.23%）和其他西班牙裔（14.29%）亚组比例较低（P<.001）。骨质疏松组参与者的骨折率显著更高（5.29%），而非骨质疏松组为2.41%（P<.05）。此外，骨质疏松组的ALT和ALP水平升高（P<.05）。两组在教育水平、婚姻状况、饮酒量和肠道微生物群评分方面也存在显著差异（P<.05）。骨质疏松组（8.74%）和非骨质疏松组（7.52%）的糖尿病患病率差异无统计学意义（P=0.628）。
（表1：研究参与者的基线特征。略）
3.2. DI-GM与骨质疏松的关联
表2显示，DI-GM得分每增加一个单位，骨质疏松患病率降低10%（OR 0.90 [95% CI 0.82-0.98]）。调整协变量后，每个额外的DI-GM点对应骨质疏松风险降低10%（OR 0.90 [95% CI 0.83-0.99]）。值得注意的是，与得分较低者相比，DI-GM得分≥6的参与者骨质疏松风险降低45%（OR 0.55 [95% CI 0.36-0.85]）。较高的有益肠道微生物群得分显著降低了骨质疏松发病率（OR 0.88 [95% CI 0.79-0.98]），而有害微生物群得分则无统计学关联（OR 0.99 [95% CI 0.86-1.15]）。此外，平滑曲线分析显示，在总体人群中，DI-GM与骨质疏松风险之间存在线性关系（图2）。
（图2：调整了人口统计学变量（性别、种族和年龄）、社会经济因素（教育水平和婚姻状况）、生化指标（血清钙、ALT、AST、尿酸、ALP、BUN、磷）、健康状况（高血压、BMI、糖尿病和骨折史）以及生活方式行为（吸烟和饮酒）后的平滑曲线。ALP=碱性磷酸酶，ALT=丙氨酸氨基转移酶，AST=天冬氨酸氨基转移酶，BUN=血尿素氮。）
（表2：DI-GM与骨质疏松之间关联的多变量逻辑回归分析。略）
按性别、年龄、BMI、婚姻状况、教育水平、种族、高血压、吸烟、糖尿病、骨折和饮酒进行的亚组分析显示，均无统计学显著交互作用（所有P>.05）。DI-GM与骨质疏松之间的关联在所有亚组中保持稳健，表明关系一致（图3）。
（图3：DI-GM与骨质疏松关系亚组分析和交互检验的森林图。DI-GM=肠道微生物群膳食指数。）
LASSO算法用于识别与骨质疏松风险相关性最强的膳食成分。该方法通过将非必要变量的系数收缩至零，从而仅保留最显著的预测因子，提高了模型效率。分析包括14个食物类别以及协变量（如年龄、性别、种族、BMI、吸烟、饮酒和糖尿病）和临床参数（血清钙、ALT、AST、尿酸、ALP、BUN、磷；图4）。通过10折交叉验证确定最佳惩罚参数（lambda），以最小化模型偏差（图5）。关键膳食风险因素包括豆制品、发酵乳制品和加工肉类。
（图4：LASSO惩罚回归分析，用于识别与骨质疏松相关的关键因素。骨质疏松的系数收缩图。LASSO=最小绝对收缩和选择算子。）
（图5：骨质疏松LASSO回归模型10折交叉验证的二项式偏差图。LASSO=最小绝对收缩和选择算子。）
构建了一个预测可视化工具（列线图），通过整合关键膳食因素和骨质疏松的临床混杂因素，用于估计个体化的骨质疏松风险。该工具结合了营养摄入数据和健康指标，以实现个性化风险分层（图6）。通过突出特定饮食模式对骨骼健康的影响，它为高风险人群的针对性干预提供了可操作指导。通过受试者工作特征曲线分析验证了模型的预测准确性，AUC为75.7%，表明在区分有无骨质疏松方面具有显著区分能力（图7）。这些发现表明，结合临床和营养数据是确定骨质疏松风险的可靠方法。
（图6：骨质疏松风险预测模型的建立与验证。基于年龄、种族、加工肉类、大豆、发酵乳制品、ALT、AST、饮酒状况、高血压、血清钙、糖尿病（由LASSO回归分析识别）的骨质疏松列线图模型。ALT=丙氨酸氨基转移酶，AST=天冬氨酸氨基转移酶，LASSO=最小绝对收缩和选择算子。）
（图7：评估列线图模型对骨质疏松预测能力的ROC曲线。ROC=受试者工作特征曲线。）
- 讨论
本研究检查了NHANES 2007-2018年的数据，包括9065名参与者，并仔细评估了DI-GM与骨质疏松之间的相关性。我们的研究结果表明，较高的DI-GM得分，特别是在DI-GM≥6类别以及对肠道菌群有利的类别中，与较低的骨质疏松发病率相关。在亚组研究中，DI-GM与骨质疏松之间的相关性保持一致。后续使用LASSO回归的研究发现，大豆、发酵乳制品和加工肉类是影响骨质疏松风险的重要膳食决定因素。包含这些参数的预测模型显示出显著的临床价值，AUC为75.7%。这些发现不仅证实了“肠-骨轴”假说，而且提供了经验证据，表明针对肠道微生物群的饮食操作可能是增强骨骼健康的一种有效策略。
骨质疏松以骨重塑失衡（破骨细胞过度吸收和成骨细胞形成不足）为特征，由雌激素缺乏、氧化应激和炎症等因素驱动。[18] 绝经后骨质疏松的特点是骨吸收和骨形成均增加（以吸收为主），原因是雌激素缺乏。[19] 雌激素、甲状旁腺激素、炎性细胞因子和维生素D调控骨重塑，而更年期和衰老是骨质疏松的主要原因。肠道菌群在维持骨代谢稳态中起着关键作用，这是人体另一个重要的生理系统。[20,21] 一项近期研究表明，肠道细菌可能显著调节骨生理学。在一项生理学研究中，测量了286名髋部骨折绝经后女性血清中肠道微生物群衍生代谢物——氧化三甲胺（TMAO）的水平。[22] 结果显示，TMAO浓度升高与髋部骨折风险增加显著相关，提示TMAO可能在绝经后女性的骨质疏松和骨折发病机制中发挥作用。[22,23] 骨代谢和骨质疏松受肠道菌群调节，而肠道菌群又受各种食物中营养素的多样性和数量影响。[24] 例如，根据DI-GM有害的高脂肪饮食可以刺激胆汁酸的产生，从而有助于脂质消化。[25] 然而，这些酸对细菌细胞膜有负面影响，表明它们可以对某些微生物群产生强大的选择压力。[25,26] 因此，这些与肠道菌群相关的代谢物对骨质疏松的代谢调节产生负面影响。我们发现大豆、发酵乳制品和加工肉类是骨质疏松发展的主要因素。先前的研究证实了这些结果。发酵乳制品中的细菌和钙通过两种方式协同提高骨密度。[27] 首先，它们增加了身体对骨骼构建至关重要的营养素的供应。[28] 其次，这些产品提高了钙吸收效率，促进抗炎环境，从而通过改变肠道菌群组成（例如，增加乳酸杆菌的数量）来减少骨吸收。[29] 同样，研究表明，大豆中发现的异黄酮（如金雀异黄酮）可以通过刺激成骨细胞活性来抑制骨吸收，类似于雌激素的作用。[30] 异黄酮的代谢转化受肠道细菌调控，可能在这一过程中发挥作用。[31] 然而，加工肉类的盐含量也很高。在绝经后女性中，高钠饮食会改变钙代谢并增强骨吸收。[32]
肠二醇（END）和肠内酯（ENL）是哺乳动物木脂素，由植物木脂素前体在近端结肠中通过肠道菌群代谢产生。[33] 这些代谢物是开发DI-GM的重要组成部分，基于NHANES回忆数据中发现的关联。[8] END和ENL通过多模式机制保护骨骼。雌激素受体（ERα/β）的配体表现出浓度依赖性活性，在低浓度时作为ER激动剂，反式激活骨保护通路，刺激成骨细胞活性并抑制破骨细胞生成。[34,35] 在较高浓度时，它们作为内源性雌激素（如雌二醇）的竞争性拮抗剂，减轻雌激素缺乏介导的骨吸收。[36] 此外，END/ENL的产生与微生物衍生的短链脂肪酸（SCFAs；如丁酸）增加相关，后者可抑制破骨细胞活性并促进矿物质吸收。[35] 肠道菌群与骨骼健康之间的相互作用涉及由微生物代谢物介导的多种生物学通路。[37,38] 肠道菌群通过发酵产生生物活性化合物，如SCFAs、吲哚衍生物、多胺和三磷酸腺苷，这些物质调节骨代谢。[39,40] 例如，SCFAs可通过刺激胰岛素样生长因子-1和胰高血糖素样肽-1的分泌来增强骨形成。[41] 菌群失调诱导的肠道屏障功能障碍会升高全身性脂多糖水平，导致代谢性内毒素血症。[42] 动物研究已证实，脂多糖浓度升高会加速骨丢失，并显著降低腰椎骨密度、骨小梁体积和椎骨数量。[43] 从长远来看，饮食干预是调节肠道菌群和影响骨代谢的一种安全有效的策略。因此，基于“肠-骨轴”理论，推广骨质疏松预防的饮食知识作为日常生活中的一种常见干预措施具有重要价值。[44,45]
本研究具有若干显著优势。首先，这是一项开创性研究，在调整潜在混杂因素后，揭示了DI-GM评分与骨质疏松风险之间存在显著负相关，表明较高的DI-GM值与进行性风险降低相关。其次，分析确定了DI-GM与骨质疏松之间的线性剂量-反应模式，强调了其在维持骨骼健康方面一致的保护作用。通过利用NHANES强大的质量保证方案和代表性抽样框架，本研究在一个大型、种族多样化的美国成年人队列中验证了这些关联。此外，本研究从转化医学的角度为骨质疏松的预防和管理提供了创新见解。在临床实践中，DI-GM评分是指导饮食调整的有效工具，包括增加豆制品摄入、加入发酵乳制品以及限制加工肉类消费。使用LASSO回归开发的预测模型（AUC=75.7%）结合了饮食和临床参数，有助于识别高风险个体并制定量身定制的干预策略。
然而，本研究也存在一定的局限性。首先，其横断面设计无法得出DI-GM与骨质疏松之间的因果关系，也无法排除反向因果关系。然而，潜在的过程必须通过随机或前瞻性实验来验证。其次，依赖自我报告的饮食数据（例如，24小时回忆）可能会引入回忆偏倚，尽管采用了多次回忆平均和加权逻辑回归来减轻这种偏倚。此外，由于NHANES的数据限制，绿茶和其他茶类被排除在DI-GM之外，NHANES在膳食回忆数据中并未一致区分茶类，缺乏具体的茶类亚型数据可能会低估茶源性木脂素对肠道菌群和骨代谢的贡献。最后，未直接检查肠道菌群组成及其代谢物，这限制了对所考虑通路的机制洞察。未来的研究应结合宏基因组和代谢组学方法，以确定负责DI-GM调节骨健康的确切微生物分类群和分子通路。
- 结论
本研究发现，DI-GM（反映与微生物多样性相关的饮食质量）与骨质疏松风险之间存在显著负相关。我们建议采用以植物为中心、多样化、富含膳食纤维、益生菌和益生元的饮食，同时尽量减少动物源性产品、超加工食品和高脂肪食品的消费，以增强肠道菌群功能。鉴于饮食、肠道菌群和骨骼健康的协同作用，未来整合基于DI-GM的饮食框架的预防策略对于骨质疏松管理至关重要。
作者贡献
方法论：冯瑞、徐淑娟、崔杨清。
项目管理：王凯、杨帆。
软件：王凯、杨帆。
监督指导：陈群群。
写作-初稿：冯瑞、徐淑娟、崔杨清。
写作-审阅与编辑：冯瑞、徐淑娟、崔杨清。
【全文结束】