摘要
肠道微生物组的紊乱与心脏代谢紊乱及其他健康结果有关。抗生素是已知的肠道微生物组干扰因素，但其长期后果尚未得到充分探索。本研究将瑞典处方药物登记处的个体水平数据与14,979名成年人的粪便宏基因组相结合，以检查8年内口服抗生素使用与肠道微生物组之间的关联。在多变量混杂因素调整的回归模型中，粪便采样前1年内使用抗生素与物种多样性最大程度降低相关，但1-4年和4-8年前的使用也存在显著关联。克林霉素、氟喹诺酮类和氟氯西林与大部分单个物种丰度的关联有关。在采样前4-8年使用这些抗生素与所研究物种中10-15%的丰度改变相关；青霉素V、广谱青霉素和呋喃妥因仅与少数物种相关。将采样前4-8年使用过一次抗生素与过去8年内未使用者进行比较，也得到了类似的结果。这些发现表明，抗生素可能对肠道微生物组产生持久的影响。
引言
在观察性研究中，长期和反复使用抗生素与肥胖、2型糖尿病、心血管疾病、结直肠息肉和癌症的风险增加有关，这可能是由于对肠道微生物组的破坏造成的。这一假设得到了将肠道微生物组与人类健康（包括肥胖、心脏代谢紊乱、自身免疫性疾病和结直肠癌）联系起来的证据支持。
在健康志愿者中进行的较小规模干预研究报告了口服抗生素疗程后几天内肠道微生物组的剧烈改变，特别是物种多样性和微生物基因丰富度的降低。其他短期改变包括潜在病原体（如大肠杆菌）丰度增加；Dialister、Veillonella和Eubacterium属丰度减少；抗菌素耐药基因富集；以及艰难梭菌感染风险增加。
尽管抗生素的短期抗菌作用已得到充分认识，但尚未大规模开展基于人群的研究来考察其对肠道微生物组的长期后果。本研究评估了粪便采样前8年内口服抗生素的使用与肠道微生物组组成之间的关联，同时控制了与高抗生素使用相关的因素，如非抗生素药物的使用和合并症。来自瑞典国家处方药物登记处的信息（该登记处记录了瑞典所有门诊患者配发的抗生素和其他处方药）与来自三个瑞典基于人群的队列的粪便深度鸟枪法宏基因组学获得的肠道微生物组数据相结合。本研究发现有证据表明，采样前1-4年和4-8年的抗生素使用与采样时肠道微生物组的组成有关。即使是在4-8年前仅使用过单一抗生素疗程的个体中也观察到了这种联系。
结果
- 研究人群与抗生素使用
我们利用来自三个瑞典基于人群的队列的粪便宏基因组学数据，研究了过去8年内口服抗生素使用与肠道微生物组组成之间的关联：瑞典心肺生物影像研究（SCAPIS，n=8,488）、瑞典医学人群生命全程与环境研究基础设施（SIMPLER，n=4,784）和马尔默后代研究（MOS，n=1,707）。14,979人的描述性特征见表1。关于招募、粪便样本收集与储存、DNA提取与测序以及宏基因组分析的信息在方法部分描述。
- 近期和过去的抗生素使用与较低的肠道微生物组物种多样性相关
我们首先估计了在三个时间段内，每增加一个抗生素疗程，肠道微生物组物种多样性（α多样性）的边际均值：采样前<1年、≥1年至<4年（1-4年）和≥4年至<8年（4-8年）。抗生素暴露被建模为三个连续变量，代表每个时间段内的处方数量，这些变量被纳入同一个使用限制立方样条的线性回归模型中，并调整了协变量（完整模型）。我们观察到，在三个时间段内，每增加一个抗生素疗程，肠道微生物组物种的估计多样性都会下降。对于前两个疗程，估计的下降幅度大于第三和第四个疗程（图1a，b）。
由于口服抗生素对肠道微生物组的影响因作用机制和药代动力学而异，我们将分析细分为11个抗生素类别。分析分别针对每个队列进行，然后使用逆方差加权固定效应荟萃分析合并回归系数。基本模型和完整模型的回归系数高度一致，且各队列之间也是一致的。除非另有说明，结果均指完整模型。我们发现，在多重检验校正（错误发现率FDR<5%）后，在粪便采样前<1年使用的11个抗生素类别中，有6个与至少一个多样性指标的物种多样性降低相关（图1c及补充表1）。克林霉素、氟喹诺酮类和氟氯西林具有最大的效应估计值。在物种丰富度结果中，粪便采样前<1年每使用一个克林霉素疗程，平均检测到的物种减少47个。每使用一个氟喹诺酮类或氟氯西林疗程，平均分别检测到20个和21个物种减少。粪便采样前1-4年和4-8年使用的氟喹诺酮类、氟氯西林和四环素也与较低的多样性相关，而克林霉素和大环内酯类在1-4年前使用也与较低的多样性相关，但在4-8年前则不然。粪便采样前<1年使用呋喃妥因与物种多样性呈正相关，但鉴于未在后续单一抗生素疗程分析中得到确认，应谨慎解读此关联，可能由偶然或碰撞偏倚导致。未检测到广谱青霉素（即匹美西林和阿莫西林）、阿莫西林-克拉维酸或磺胺甲恶唑-甲氧苄啶的关联（补充表1）。
在按性别和年龄分层的分析中观察到了与主要分析相似的结果。
- 使用功能回归模型研究抗生素使用与肠道微生物组多样性随时间的关系
为了探索抗生素使用后微生物组多样性的恢复情况，我们实施了一个功能回归模型。结果显示，肠道微生物组多样性在抗生素暴露后的最初2年内恢复最快，随后几年恢复明显减慢。克林霉素、氟喹诺酮类和四环素使用后的物种丰富度恢复模式尤为明显。此外，分析表明，抗生素使用后恢复期的恢复速度与初始多样性降低的幅度成正比（图2），这与另一项研究的结果一致。
- 过去8年内单一抗生素疗程与较低的肠道物种多样性相关
在另一项分析中，我们将样本限制在采样前8年内仅使用过一个抗生素疗程或未使用过抗生素的参与者中。一个疗程的四环素、氟氯西林、氟喹诺酮类、克林霉素、磺胺甲恶唑-甲氧苄啶、头孢菌素或大环内酯类，无论是在采样前<4年还是4-8年使用，都与较低的微生物组物种多样性相关（扩展数据图3及补充表8）。
- 克林霉素、氟氯西林和氟喹诺酮类与肠道微生物组物种丰度的关联数量最多
我们接下来研究了11个抗生素类别与存在于超过2%参与者中的1,340个物种丰度之间的关联。基本模型和完整模型的回归系数高度一致，因此我们引用完整模型的结果。克林霉素、氟氯西林和氟喹诺酮类占了抗生素使用与单个物种丰度之间大部分关联：分别占FDR<5%关联的37.9%、25.8%和17.9%（图3及补充表9）。尽管粪便采样前<1年使用抗生素的关联在效应估计值和P值方面最强，但在采样前1-4年和4-8年使用抗生素也观察到许多关联（图3及补充表9）。采样前<1年使用克林霉素与分析到的1,340个物种中的296个相关，氟氯西林与203个物种相关，氟喹诺酮类与172个物种相关。相比之下，处方量最大的青霉素V仅与29个物种相关。大多数关联为负相关（即物种相对丰度降低），但也观察到正相关。
在限制过去8年内仅使用过一次或未使用过抗生素的参与者的分析中，克林霉素、氟氯西林和氟喹诺酮类再次成为与物种关联数量最多的抗生素（扩展数据图4及补充表11）。
- 抗生素-物种关联中的年龄和性别差异
总体而言，跨年龄和性别分层的关联模式是一致的，克林霉素、氟氯西林和氟喹诺酮类占大多数关联（补充图11、12及补充表12、13）。检测到抗生素使用与性别之间存在74个物种相互作用的证据，大多数显著相互作用表明女性中的关联更强。对于抗生素使用与年龄之间的相互作用，我们确定了97个物种关联中相互作用的证据。
- 抗生素相关物种与宿主健康之间的联系
本研究中，使用克林霉素、氟喹诺酮类和氟氯西林与Enterocloster bolteae、E. citroniae、Flavonifractor plautii、Ruminococcus B gnavus和Eggerthella lenta的丰度增加相关。这些物种以前与较高的BMI、血清甘油三酯和2型糖尿病风险相关。我们的结果与先前的假设一致，即抗生素诱导的肠道微生物组改变可能有助于心脏代谢疾病的发展。
为了检查SCAPIS中与抗生素使用相关的物种与心脏代谢标志物之间的联系，我们重点关注了在任何时期与所有三种抗生素都相关的101个物种。在对抗生素使用呈正相关的物种中，Sellimonas intestinalis、R. B gnavus、E. clostridioformis、E. aldenensis和Thomasclavelia ramosa与较高的BMI、腰臀比、血清甘油三酯水平和C反应蛋白水平相关（图4及补充表14）。总体而言，对抗生素使用呈负相关的物种与较低的BMI、WHR、TG和CRP水平相关。其中包括Alistipes communis和Odoribacter splanchnicus。
除了心脏代谢健康外，抗生素使用还与结直肠癌和炎症性肠病风险增加有关。我们利用抗生素-物种关联结果来考察抗生素使用与先前与这些疾病相关的物种之间的关系。在结直肠癌中富集的物种与抗生素使用既有正相关也有负相关。对于炎症性肠病，我们观察到更一致的模式，即在炎症性肠病中耗竭的物种与抗生素使用呈负相关，尤其是克林霉素。
讨论
在这项包含14,979名参与者的基于人群的研究中，我们调查了粪便采样前8年内抗生素使用与肠道微生物组组成之间的关联。三项发现尤为突出。首先，尽管采样前<1年使用的抗生素关联最强，但采样前1-4年和4-8年使用的抗生素也与较低的多样性和物种丰度的差异相关。其次，这些关联主要与三类抗生素有关：克林霉素、氟氯西林和氟喹诺酮类。第三，在采样前4-8年使用单一抗生素疗程与肠道微生物组多样性和某些物种的丰度相关。这些发现支持了抗生素对肠道微生物组的影响可能持续数年的观点。
微生物组恢复力尚不完全清楚。通常在数周内会发生部分恢复，但完全恢复可能需要数年。干预研究表明，物种多样性降低的持续时间因抗生素类别而异。观察性研究描述了多年抗生素使用与肠道微生物组之间的关联，但此前均未区分近期和过去的使用或按类别进行分析。
不同抗生素类别在肠道微生物组关联上的差异可能由其抗菌谱和药代动力学的差异解释。氟氯西林的强烈关联值得关注。四环素是与物种水平关联数量第四多的抗生素类别。大环内酯类尽管作用机制与克林霉素相似，但显示的物种丰度关联较少。
经常使用抗生素的个体也使用其他可能影响肠道微生物组的药物。因此，我们的完整模型针对几种先前与肠道微生物组组成相关的药物以及多重用药进行了调整。
国家处方药物登记处记录了瑞典所有门诊患者配发的抗生素和处方药。由于在国外或住院期间提供的抗生素未被记录，抗生素使用的低估可能影响了结果。然而，排除采样前8年内住院的参与者的敏感性分析提供了与完整模型相似的结果。另一个局限性是我们的登记处提取不包含治疗适应症，这阻碍了区分抗生素和治疗感染效应。然而，由于门诊患者使用抗生素主要用于呼吸道、泌尿道、皮肤和软组织感染，这些感染对肠道微生物组的可能影响可能小于抗生素本身。更强的因果证据需要纵向研究或随机试验。SCAPIS目前正在进行8-10年随访，将允许采用更强有力的重复采样研究设计。
一项包括36,429名女性的前瞻性研究表明，成年期抗生素使用时间更长的女性发生心血管事件的风险更高。一项丹麦全国性研究发现，抗生素使用后，尤其是在1-2年内，发生炎症性肠病的风险呈剂量依赖性增加。2型糖尿病和结直肠癌也与既往抗生素使用有关。所有这些关联是否由肠道微生物组破坏导致尚待确定。我们的研究扩展了这一研究方向，表明过去的抗生素使用与与心脏代谢状态、结直肠癌和炎症性肠病相关的物种的丰度有关。限制使用抗生素的主要原因是耐药性发展的风险。尽管如此，我们的研究为减少抗生素使用增加了另一个理由：即可能持续多年的肠道微生物组改变。
本研究的主要优势包括大样本量、对混杂因素（如相关药物和合并症）的全面调整，以及来自三个基于人群的队列的粪便宏基因组数据，这些数据使用相同方法进行分析，从而允许物种注释的协调统一和荟萃分析。我们的研究存在局限性。粪便样本收集的确切日期未被系统记录，而是使用了参与者访问测试中心的日期。然而，这不应影响已确定的长期关联。尽管分析是按队列分别进行然后进行荟萃分析，但不能完全排除DNA提取和测序方法学差异的影响。然而，没有明确证据表明存在这种重大影响，因为大多数回归系数的异质性较低。未能检测到某个队列中的某些物种可能会稀释这些物种的信号并使估计值偏向零。此外，研究结果的可推广性可能仅限于具有类似抗生素处方实践和肠道微生物组特征的国家。瑞典的抗生素使用尤为保守。某些抗生素，如青霉素与β-内酰胺酶抑制剂的复方制剂，很少被处方。我们对这些抗生素的统计功效有限，未发现关联不应解释为无效应。此外，在某些人群中观察到的高度抗菌素耐药性可能使微生物组对抗生素诱导的扰动更具恢复力。抗生素剂量和治疗持续时间的差异可能影响肠道微生物组，但未在本研究中调查。其他局限性包括从医院记录中得出的查尔森合并症指数可能无法涵盖主要在初级保健中管理的疾病。此外，非抗生素药物使用信息缺乏剂量细节，且仅限于采样前12个月。因此，我们未能考虑在此阶段之前已停用药物可能产生的残留效应，尽管非抗生素药物对肠道微生物组的残留长期影响在很大程度上仍未得到充分探索。此外，微生物组物种的丰度是作为相对丰度测量的，这在大规模基于人群的研究中最常见。相对丰度可能不能反映绝对丰度的变化。食物中的抗生素残留，尤其是食用肉类，可能是本研究中未考虑的抗生素暴露来源。然而，瑞典以其对牲畜使用抗生素的严格政策而闻名。
总之，我们发现有证据支持某些口服抗生素类别可能影响肠道微生物组组成超过4年。克林霉素、氟喹诺酮类和氟氯西林的影响最大。我们的结果可能为未来的门诊抗菌药物管理干预措施和实践指南提供信息，这些措施和实践应尽可能优先考虑对肠道微生物组影响较小的抗生素。
【全文结束】