丁酸通过抑制I类组蛋白去乙酰化酶挽救毒死蜱诱导的社交缺陷 - 健康研究

摘要

毒死蜱（CPF）是一种广泛使用的有机磷农药，通过抑制乙酰胆碱酯酶发挥效力，导致乙酰胆碱积累和持续的神经刺激。除已知的急性毒性外，接触CPF还与自闭症谱系障碍（ASD）风险增加以及对肠道健康的不良影响（包括肠道微生物组和代谢紊乱）有关。然而，CPF促发ASD的潜在机制尚不清楚，肠道微生物组和肠道代谢物在CPF诱导的神经发育毒性中的作用仍不明确。利用高通量社会行为检测，我们发现在斑马鱼中，胚胎期接触CPF会导致持久的社会行为缺陷。通过对常见肠道微生物组有益代谢物的小规模筛选，我们发现丁酸能有效挽救CPF诱导的社会行为缺陷。对斑马鱼脑组织的RNA测序显示，早期接触CPF会持久抑制神经元基因（包括许多ASD风险基因）的表达，并增加昼夜节律基因的表达。丁酸部分逆转了关键神经元基因的抑制。丁酸是一种组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的非选择性抑制剂。通过一系列利用CRISPR-Cas9诱导的敲除和选择性化学抑制剂的失功能实验，我们发现I类HDAC中的HDAC1最可能介导了丁酸的挽救效应。代谢组学分析检测到CPF暴露后斑马鱼肠道中几种氮代谢相关通路发生了变化。宏基因组学分析显示，在CPF暴露的斑马鱼肠道微生物组中，反硝化细菌假单胞菌（Pseudomonas）的丰度增加，而对一氧化氮敏感的气单胞菌（Aeromonas）减少。我们的结果将CPF暴露与肠道微生物组、代谢组、表观遗传学、基因表达和行为的变化联系起来，为CPF诱导的神经发育毒性的潜在分子机制提出了一项新假说。长远来看，我们的发现可能有助于阐明CPF暴露如何增加自闭症风险，并激发治疗方法的开发。

引言

毒死蜱（CPF）是一种对农业害虫管理至关重要的有机磷农药，每年在大约100个国家的850万英亩作物上使用。其主要作用机制是抑制乙酰胆碱酯酶，导致乙酰胆碱积累和持续的神经刺激，从而产生急性毒性。除了直接的生理效应外，CPF因其在土壤和水生态系统中的持久性而构成重大环境风险，可能危害非目标物种，包括有益昆虫、鸟类、水生生物和哺乳动物。认识到这些重大的健康和环境问题，美国环境保护署（EPA）已开始逐步淘汰CPF在食品生产中的使用，这突显了关于其潜在危害的科学共识日益增强。然而，CPF仍被持续应用于非食用农业、工业和家庭用途。除CPF外，大约还有其他40种有机磷农药被广泛使用但未受到监管。

虽然CPF作为乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂的急性毒性已得到充分表征，但慢性CPF暴露的长期健康影响尚不完全清楚。慢性CPF暴露与显著的发育和神经挑战有关，尤其是在儿童中。流行病学研究记录了CPF暴露与认知功能下降（包括智商分数降低和发育迟缓）之间的潜在联系。特别值得关注的是，越来越多的证据表明CPF暴露与自闭症谱系障碍（ASD）风险增加相关。这可能导致估计中约40%被认为由环境因素引起的ASD风险。

这种关系背后的潜在机制可能与CPF对肠道微生物组的影响有关。已有研究表明，接触CPF会导致胃肠道菌群失调或微生物失衡。农药诱导的肠道菌群失调越来越被认为是神经发育障碍（包括ASD）的潜在促成因素。微生物组的破坏可以改变代谢物的产生，这些代谢物随后可能通过各种机制影响神经发育。例如，肠道微生物组代谢物丁酸是一种组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂。像丙戊酸这样的HDAC抑制剂可以通过阻止组蛋白乙酰基的去除来调节基因表达，从而影响神经发育过程。这一机制在ASD的背景下尤其引人关注，因为表观遗传失调越来越被认为是ASD的一个关键因素。例如，组蛋白乙酰化这一关键表观遗传过程已被牵涉到ASD的发病机制中。HDAC抑制剂在挽救某些自闭症相关表型方面显示出希望，提示了一种潜在的治疗方法。

尽管有这些新见解，但重大的知识空白仍然存在。CPF导致ASD的确切机制仍不清楚，肠道微生物组代谢物和表观遗传学在CPF诱导的神经发育毒性中的作用仍知之甚少。我们的研究旨在通过一种全面的、多维度的方法来解决这些关键问题。利用斑马鱼的高通量社会行为检测，我们研究了胚胎期CPF暴露的影响。通过对主要肠道微生物组代谢物的系统筛选，我们发现丁酸能有效挽救CPF诱导的社会行为缺陷。机制研究表明，I类HDAC中的HDAC1可能介导了丁酸的挽救效应。我们进一步利用多组学分析（包括宏基因组学、代谢组学和RNA测序）探究了CPF神经发育毒性背后的分子机制。RNA测序结果显示神经元基因显著下调，其中许多基因先前已与ASD相关联。丁酸部分逆转了这种下调。代谢组学和宏基因组学分析结果均揭示了与氮代谢和一氧化氮（NO）产生相关的变化。这些结果启发我们提出一项假说：CPF首先通过改变肠道微生物组组成来增强NO产生，随后NO诱导对I类HDAC的选择性抑制，最终导致组蛋白乙酰化失衡和神经元基因表达失调，从而引发社会行为缺陷。

结果

丁酸挽救了毒死蜱诱导的斑马鱼社会行为缺陷

社会行为缺陷是ASD的一个典型特征。由于CPF与ASD的关联，我们利用高通量行为平台Fishbook检测了CPF是否能在斑马鱼中诱导社会行为缺陷。我们发现，在0-3天受精后（dpf）的胚胎期接触CPF，会在幼年阶段（25 dpf）以剂量依赖性方式诱导社会行为缺陷。15 µM的CPF能稳定地诱导显著的社会行为缺陷，并用于所有后续的挽救实验。已知接触CPF会导致肠道微生物组失调并改变有益肠道微生物组代谢物的产生。为了检验CPF诱导的社会行为缺陷是否可以通过有益肠道微生物组或肝脏代谢物来缓解的假说，我们进行了7种代谢物的小规模筛选，包括丁酸（以丁酸钠的形式）、乙酸、鹅去氧胆酸（CDCA）、胆酸、3-吲哚丙酸（IPA）、琥珀酸和熊去氧胆酸（UDCA），均以10 µM的浓度应用。只有丁酸成功挽救了CPF诱导的社会行为缺陷。为了确认这一发现，我们以2倍递增的浓度（1.25 µM至40 µM）应用丁酸钠，观察到了一条在10 µM处达到峰值的钟形挽救曲线，验证了10 µM丁酸钠能最有效地挽救CPF诱导的社会行为缺陷。

抑制I类组蛋白去乙酰化酶再现了丁酸的挽救效应

组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一个酶家族，可以去除组蛋白上赖氨酸残基的乙酰基，从而改变染色质结构和基因表达。根据序列同源性和功能特性，HDAC被分为五个主要类别，包括I类、IIa类、IIb类、III类（去乙酰化酶）和IV类。丁酸是一种泛HDAC抑制剂。为了确定参与丁酸挽救效应的HDAC，我们测试了几种类特异性HDAC抑制剂，包括丙戊酸（VPA；I类和IIa类抑制剂）、曲古抑菌素A（TSA；I类、II类和IV类抑制剂）和烟酰胺（NAM；III类/去乙酰化酶抑制剂）。在Fishbook检测前一晚将这些化合物应用于幼年斑马鱼；受试对象在0-3 dpf预先暴露于CPF。我们发现，只有I类和IIa类抑制剂VPA挽救了CPF诱导的社会行为缺陷。

为了进一步聚焦于丁酸和VPA挽救效应背后的生物学通路，我们尝试分别同时敲低斑马鱼中所有的I类HDAC或所有IIa类HDAC，并评估它们在有无CPF预暴露情况下对社会性的影响。在人类中，I类HDAC包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8。斑马鱼基因组拥有人类HDAC1（hdac1）、HDAC3（hdac3）和HDAC8（hadc8）的同源基因，但没有HDAC2的同源基因。HDAC1、HDAC3和HDAC8均在大脑中表达。人类IIa类HDAC包括HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9。HDAC7不在大脑中表达，因此在后续研究中被排除。斑马鱼基因组也拥有人类HDAC4（hdac4）、HDAC5（hdac5）和HDAC9（hdac9）的同源基因。为了利用CRISPR-Cas9敲除每个类别中的所有基因，我们将同一类别中每个基因的3个引导RNA混合（I类为HDAC1/3/8，IIa类为HDAC4/5/9），并分别将每个引导RNA混合物与Cas9蛋白共同注射到1-2细胞期的斑马鱼胚胎中以诱导敲除。我们发现，I类HDAC的F0敲除通过强力挽救CPF诱导的社会行为缺陷，再现了丁酸和VPA的效果，而IIa类敲除未能挽救CPF诱导的社会行为缺陷，反而与野生型DMSO对照组相比抑制了社会行为。总之，这些结果表明I类HDAC参与了斑马鱼中CPF诱导的社会行为缺陷的调控。

单独抑制HDAC1即可有效挽救毒死蜱诱导的社会行为缺陷

为了确定在CPF预暴露后具体参与社会行为调控的HDAC酶，我们使用CRISPR-Cas9单独敲除了每个I类HDAC基因的斑马鱼同源物。我们发现，敲除hdac1可强力上调溶剂对照组鱼以及CPF暴露鱼的社会行为。敲除hdac3或hdac8均能适度挽救CPF暴露鱼的社会行为，但并未提升对照组鱼的社会性。事实上，与野生型DMSO对照组相比，敲除hdac8会降低社会得分。我们还尝试通过过夜暴露于特异性靶向HDAC1（BRD-6929）、HDAC3（RGFP966）和HDAC8（PCI-34051）的选择性HDAC抑制剂来挽救CPF诱导的社会行为缺陷。我们发现，HDAC1选择性抑制剂BRD-6929以剂量依赖性方式强力挽救了CPF诱导的社会行为缺陷，其中50 µM的BRD-6929最为强力地提升了社会行为。HDAC3选择性抑制剂RGFP966在CPF暴露鱼中适度改善了社会行为，尤其是在50 µM时，但在测试的更高剂量下并未一致地将平均社会得分提升至0以上：社会得分低于0表示社交回避，得分为0表示无社交偏好，得分高于0表示社交兴趣。HDAC8选择性抑制剂PCI-34051在测试剂量下未能挽救CPF诱导的社会行为缺陷。这些结果表明，HDAC1（以及较小程度上的HDAC3）很可能介导了丁酸和VPA的挽救效应，并且单独靶向抑制HDAC1足以强力挽救CPF暴露诱导的社会行为缺陷。

丁酸部分挽救了毒死蜱对神经元基因的选择性抑制

为了探究CPF诱导社会行为缺陷以及丁酸挽救效应背后的分子机制，我们对四个实验处理组的25 dpf斑马鱼进行了全脑RNA测序（RNA-seq），包括DMSO对照处理（DMSO）、丁酸钠处理（SB）、CPF处理（CPF）以及丁酸钠挽救CPF暴露鱼（CPF+SB）。CPF和DMSO在胚胎和幼鱼早期（0-3 dpf）暴露。丁酸在样本采集前一天应用并过夜处理。斑马鱼基因名称被转换为其人类同源基因的名称以进行通路分析。使用基因本体论（GO）的生物学过程（BP）术语进行的基因集富集分析（GSEA）发现，与DMSO对照相比，胚胎期接触CPF显著抑制了与神经元突起（轴突和树突）、突触形成（突触前和突触后）和学习相关的神经元基因的表达。在显著下调的20个GO通路中，有13个与神经元过程的调控有关。与对照组鱼相比，CPF处理组斑马鱼中与丁酸代谢相关的基因呈现负富集，尽管该通路未进入按照标准化富集得分（NES）排序的前20个下调通路。属于这13个通路的显著下调的神经元基因形成了一个紧凑的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。在该网络中，通过网络拓扑分析识别出前30个枢纽基因，并按节点度值（网络中直接相互作用的数量）排序。这些枢纽基因再次形成一个紧凑的PPI网络。虽然CPF抑制了这些神经元枢纽基因的表达，但丁酸在CPF暴露鱼中恢复了它们的表达，如基因表达热图和这些基因平均标准化表达水平的统计分析所示。大约一半（30个中的14个）的枢纽基因是西蒙斯基金会自闭症研究计划（SFARI）在其SFARI基因列表中识别的高置信度或可疑ASD风险基因，包括BRAF（SFARI基因评分[SGS]：1S）、CAMK2B（SGS：S）、CDH2（SGS：3S）、DRD2（SGS：2）、GRIA2（SGS：1）、GRIA3（SGS：S）、GRIN1（SGS：1）、GRIN2B（SGS：1）、GRM5（SGS：2）、MAPK3（SGS：2）、NLGN1（SGS：2）、PAX6（SGS：S）、SNAP25（SGS：2）和SYP（SGS：3）。基因GRIA2（校正后p值[padj]=0.00098）、GRIA3（padj=0.0011）和GRIN1（padj=0.013）被丁酸显著上调。这些结果表明，与ASD风险相关的神经元基因网络在CPF暴露的斑马鱼中被选择性下调，而这种下调可通过丁酸处理部分挽救。

胚胎期接触毒死蜱诱导了关键昼夜节律基因的持续过表达

使用GO-BP术语进行的GSEA发现，在20个正富集通路中，有5个与昼夜节律调节相关。RNA-seq数据表明，幼年斑马鱼大脑中的昼夜节律基因显著过表达：在前21个显著上调的基因中，有11个是昼夜节律基因，包括per1a、per1b、per2、cry1a、cry1b、cry2、cry5、nr1d1、ciarta、bhlhe41和si:ch211-132b12。由于昼夜节律基因表达在一天中会波动，为了防止RNA-seq样本采集时间影响基因表达水平并造成结果偏差，我们重复了相同的实验处理，并由两名经验丰富的研究人员同时进行脑解剖，在一天中的完全相同的时间点收集了CPF处理鱼和对照鱼的脑样本。使用这些样本进行的定量PCR分析证实了CPF处理鱼相比对照鱼。定量PCR分析使用这些样本证实了CPF处理鱼相比对照鱼昼夜节律基因上调。值得注意的是，几个已识别出的昼夜节律基因的人类同源物是SFARI基因列表中的已知ASD风险基因，包括PER1（SGS: 2）、PER2（SGS: 2）和NR1D1（SGS: 2）。

显著上调的、属于五个已识别昼夜节律通路的昼夜节律基因形成了一个紧凑的PPI网络。使用RNA-seq数据绘制这些昼夜节律枢纽基因的表达热图显示，CPF暴露后进行丁酸处理（CPF+SB）与CPF处理样本相比，进一步提升了这些关键昼夜节律基因的表达。对昼夜节律枢纽基因的平均标准化基因表达水平的统计分析证实了CPF+SB样本与CPF样本相比基因表达有所升高。这一观察结果也通过分析CPF+SB与CPF样本之间的差异基因表达数据并使用GSEA得到验证，该分析发现10个上调通路中有6个与昼夜节律调节相关。这些结果表明，丁酸并未逆转CPF诱导的昼夜节律基因表达上调，反而进一步促进了它们的表达。因此，我们推断丁酸的社会行为挽救效应不太可能由昼夜节律通路介导。

毒死蜱诱导了肠道中氮代谢通路的持久改变

为了检验CPF暴露可能改变肠道微生物组有益代谢物产生的假说，我们再次将斑马鱼暴露于三种处理条件：DMSO、CPF和CPF+SB。CPF和DMSO在斑马鱼0-3 dpf时暴露。丁酸在样本采集前一天应用并过夜处理。通过解剖收集幼年斑马鱼（25 dpf）的整个胃肠道，包括肠道内容物。进行非靶向代谢组学以确定每个样本的代谢物谱。使用MetaboAnalyst 6.0针对人类代谢组数据库（HMDB）中的“粪便”数据集进行的富集分析检测到，CPF处理样本中的代谢物谱变化模式与从患有炎症性肠病（IBD，包括克罗恩病和结肠炎）、肠易激综合征（IBS）和自闭症个体收集的粪便样本相似。我们还在代谢组学通路关系数据库（RaMP-DB）、小分子通路数据库（SMPDB）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）中进行了几项富集分析，以检测CPF样本与DMSO对照相比发生改变的代谢组学通路。我们一致地发现尿素循环、精氨酸代谢和天冬氨酸代谢是排名靠前的富集通路。精氨酸和天冬氨酸都是尿素循环的中间代谢物。有趣的是，通过调查RaMP-DB，检测到了一氧化氮（NO）通路和一氧化氮合酶（NOS）活性的变化。L-精氨酸是通过NOS内源性产生NO的前体，从而将尿素循环、精氨酸代谢和天冬氨酸代谢与NO/NOS通路联系起来。使用SMPDB进行的富集分析检测到CPF+SB和CPF样本之间尿素循环、精氨酸代谢和天冬氨酸代谢的显著变化，表明丁酸处理也改变了这些通路。然而，在调查CPF+SB和CPF样本之间代谢变化的KEGG和RaMP-DB数据库时，这三个通路均未通过显著性阈值，表明丁酸在这些通路中诱导的变化可能较为轻微。

毒死蜱增加了斑马鱼肠道微生物组中反硝化细菌的丰度

然后我们进行了宏基因组学分析，以检查斑马鱼肠道微生物组的变化是否在其CPF暴露后的代谢组学改变中起作用。CPF和DMSO在斑马鱼0-3 dpf时暴露。经过约3周的育苗生长后，从幼年斑马鱼（25 dpf）收集粪便进行DNA提取和鸟枪法宏基因组测序。生成了桑基图以分别显示DMSO对照和CPF样本中发现的物种的综合分类学。我们在从种到界的每个分类水平上，对两个处理组之间的丰度（即给定分类水平的观察计数）和流行度（即给定分类水平上细菌的存在/不存在）进行了差异分析。我们仅识别出差异丰度的分类群，未发现差异流行度的分类群的证据。每个水平上显著分类群的数量如图所示。有两个差异丰度的门，放线菌门（Actinomycetota）和蓝菌门（Cyanobacteriota），其丰度在CPF暴露后分别增加了2到2.5倍，如其β系数值所示。在纲水平上，放线菌纲（Actinomycetes）和蓝藻纲（Cyanophyceae）在CPF样本中表现出类似的2到2.5倍丰度增加。目水平的微球菌目（Micrococcales）和科水平的微杆菌科（Microbacteriaceae）在CPF暴露后丰度均增加了约2.5倍。尽管在属水平上未检测到显著丰度变化，但发现了139个差异丰度的物种，其中86个物种属于微杆菌属（Microbacterium）。所有差异丰度的微杆菌属物种在CPF处理样本中的丰度均高于DMSO对照。比较显著和非显著微杆菌属物种的标准化丰度测量值的箱线图发现，非显著物种在CPF和DMSO样本中具有相似但低得多的丰度，这可能解释了为什么即使如此多的微杆菌属物种存在差异丰度，但在属水平上合并时差异不再显著。微杆菌属属于微杆菌科、微球菌目、放线菌纲和放线菌门。

除了86种微杆菌属物种外，还发现11种气单胞菌属（Aeromonas）物种、6种假单胞菌属（Pseudomonas）物种、2种假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）物种和2种弧菌属（Vibrio）物种在CPF和DMSO样本中差异丰度。在绘制具有10个最高和10个最低β系数值的物种时，未发现微杆菌属物种。相反，我们发现2种假交替单胞菌属物种、2种弧菌属物种和6种假单胞菌属物种中的4种位于丰度增加最多的前10个物种之列。在CPF样本的桑基图中，与假交替单胞菌属（未显示）和弧菌属相比，假单胞菌属显示出最高的读数计数，表明假单胞菌属是CPF暴露后丰度增加的主要物种中的一个优势属。许多假单胞菌属物种是兼性厌氧菌，能进行完全的反硝化作用——即硝酸盐（NO₃⁻）逐步还原为亚硝酸盐（NO₂⁻）、一氧化氮（NO）、一氧化二氮（N₂O），最后是氮气（N₂）。对活性污泥和生物膜反应器的研究表明，在反硝化细菌中，假单胞菌属通常是优势属。这种独特的代谢能力将假单胞菌属丰度的变化与CPF样本中观察到的氮代谢变化联系起来。据报道，假交替单胞菌属和弧菌属中的某些成员也能进行至少部分反硝化作用。微杆菌属通常不被认为具有反硝化活性。与上述属相反，所有11种气单胞菌属物种在CPF暴露后丰度均下降。在CPF样本中与对照组相比丰度减少最多的前10个物种中，有9个是气单胞菌属。这可能是由于气单胞菌属对一氧化氮（NO）的抗菌作用敏感，而NO是由CPF处理鱼中增加的反硝化肠道细菌产生的一种代谢物，其产量可能更高。实际上，使用格里斯试剂检测法，我们检测到在0-3 dpf预暴露于CPF的6 dpf斑马鱼幼体中的亚硝酸盐水平显著升高。作为NO的稳定氧化产物，亚硝酸盐水平通常被用作NO的间接测量指标。因此，升高的亚硝酸盐水平表明CPF暴露后斑马鱼体内NO水平升高。这一结果与通过代谢组学分析识别出NO/NOS相关通路紊乱相一致。CPF暴露与检测到NO升高之间的延迟表明CPF对NO产生具有持久效应，这很可能部分是由肠道微生物组组成的变化介导的。

关于CPF诱导社会行为缺陷的NO-HDAC假说

这些发现促使我们提出一个工作假说，即CPF通过过量的NO产生以及由此导致的I类HDAC活性失衡来诱导ASD相关的神经发育缺陷。我们在此将其称为CPF神经发育毒性的NO-HDAC假说。简而言之，我们提出CPF暴露首先通过三种（可能独立的）机制的组合增加NO产生：（1）我们的结果显示，通过一种未知机制，CPF暴露增加了肠道微生物组中反硝化细菌的丰度，尤其是假单胞菌属，这可以通过反硝化途径增强NO产生；（2）已发现CPF暴露能在各种实验系统中触发诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，导致NO产生增加；（3）CPF通过作为乙酰胆碱酯酶（AChE）的不可逆抑制剂，阻止神经递质乙酰胆碱（ACh）的分解，这反过来可以激活内皮型一氧化氮合酶（eNOS），从而促进NO产生。已知NO通过S-亚硝基化两个在所有I类HDAC中保守的半胱氨酸残基来抑制HDAC2（斑马鱼中不存在）和HDAC8，然而通过一种未知机制，尽管拥有相同的保守半胱氨酸残基，HDAC1和HDAC3在很大程度上对S-亚硝基化免疫。因此，我们推断CPF暴露诱导的异常高水平的NO将导致通过S-亚硝基化对HDAC8产生过度的（相较于生理水平）抑制，而由于对S-亚硝基化的抗性，HDAC1和HDAC3的活性将保持相对完整。这种对HDAC2/8而非HDAC1/3的选择性抑制会偏斜大脑中I类HDAC活性的正常生理平衡，以一种抑制对社交行为发育至关重要的神经元基因表达的方式改变组蛋白乙酰化模式，从而导致社交行为缺陷表型。

该模型有助于解释丁酸的挽救效应：基于NO-HDAC假说，我们提出丁酸通过同时抑制所有I类HDAC成员，包括斑马鱼的hdac1、hdac3和hdac8，从而通过“重置”和重新平衡全局组蛋白乙酰化状态，特别是在I类HDAC靶向的基因位点，来纠正全基因组范围的组蛋白乙酰化失衡，从而挽救CPF诱导的社会行为缺陷。这种再平衡理论也解释了为什么敲除或药物抑制斑马鱼的hdac1和hdac3能成功挽救CPF诱导的社会行为缺陷表型，而化学抑制hdac8则未能挽救缺陷。敲除hdac8确实挽救了CPF诱导的社会行为缺陷，但我们推断这可能是由于失去了NO的S-亚硝基化靶标。与野生型对照相比，敲除hdac8显著抑制了社会行为，而相比之下，敲除hdac1则强力提升了社会行为。相比之下，与野生型对照相比，敲除hdac3并未显著影响社会行为，表明hdac1和hdac8可能是维持假想的组蛋白乙酰化平衡状态的两个关键I类HDAC成员。最后，我们NO-HDAC模型中升高的NO也解释了在CPF暴露后，NO敏感细菌属气单胞菌的减少以及昼夜节律基因（特别是Per和Cry家族基因）的上调。关于NO-HDAC假说的更深入分析可在讨论部分找到。

作为对该假说的初步测试，我们将斑马鱼胚胎暴露于NO供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）。Fishbook检测发现，胚胎期暴露于SNAP后，幼鱼期存在持久的社会行为缺陷，表明NO在社会行为发展中发挥作用，这与我们模型的预测一致。NO的一个主要生物学效应是促进环磷酸鸟苷（cGMP）的产生，这种效应可以通过抑制降解cGMP的磷酸二酯酶（PDE）在药理学上模拟。胚胎期暴露于广谱PDE抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）并未在斑马鱼中诱导社会行为缺陷，表明NO可能通过不依赖cGMP的机制调节社会行为，这再次与我们的模型一致。

讨论

我们的研究揭示了一种多层次机制，通过这种机制，胚胎期暴露于常用有机磷农药CPF会在斑马鱼中诱导持久的社会行为缺陷——这是与ASD相关的核心表型。利用高通量行为筛选、转录组学、代谢组学和宏基因组学，我们发现CPF通过改变肠道微生物组和肠道来源的代谢物来破坏社会行为，导致大脑中神经元基因表达的抑制。值得注意的是，我们发现丁酸——一种肠道微生物组代谢物和HDAC抑制剂——能挽救CPF诱导的社会行为缺陷和神经元基因抑制。机制解析确定了HDAC1是这种挽救效应的关键介导者。此外，我们观察到昼夜节律基因的持续过表达以及氮相关代谢通路的显著改变，包括反硝化细菌如假单胞菌属的上调和一氧化氮（NO）敏感的气单胞菌属物种的耗竭。

基于这些发现提出的NO-HDAC假说得到了我们数据的强力支持，并有助于解释我们研究中的观察结果。首先，CPF处理的斑马鱼显示假单胞菌属丰度显著增加，这是一个公认的反硝化细菌属，能够在厌氧和微需氧条件下产生NO。其次，与假单胞菌属物种的增加同时发生，我们观察到与氮代谢相关的通路显著富集，包括精氨酸、天冬氨酸和尿素循环代谢，这些与NO合成密切相关，可能代表了由假单胞菌属介导的增强的反硝化作用和NO产生的次级效应。第三，CPF暴露导致气单胞菌属物种减少，这些物种是已知对NO敏感的兼性厌氧菌，提示肠道环境中NO水平升高。第四，脑转录组分析揭示神经元基因显著下调，其中许多是高置信度ASD风险基因。丁酸挽救了CPF诱导的神经元基因下调和社会行为缺陷。更为选择性地，抑制HDAC1足以强力挽救行为表型，表明HDAC1是这一通路的关键组成部分。最后，我们在研究中观察到的昼夜节律基因表达升高，特别是Per和Cry家族基因，与NO通过CREB磷酸化和Bmal1的S-亚硝基化诱导这些基因的已知能力一致。丁酸未能逆转CPF诱导的昼夜节律基因上调，表明昼夜节律基因表达的变化可能并非行为缺陷的原因，而更可能是NO信号传导的次级效应。

我们的假说也得到了广泛文献的支持。CPF已被证明在体内多个动物模型中提高大脑中的NO水平。啮齿动物和鱼类研究一致证明，CPF暴露后NO代谢物和iNOS活性增加。此外，其他有机磷农药如马拉硫磷、对硫磷、二嗪磷和敌敌畏也表现出类似效应，指出了这类化学物质诱导NO升高的一个保守机制。NO通过S-亚硝基化两个在所有I类HDAC成员中高度保守的半胱氨酸残基来抑制HDAC2和HDAC8。然而，尽管拥有相同的保守半胱氨酸残基，HDAC1和HDAC3并不受NO介导的S-亚硝基化影响。HDAC2在斑马鱼基因组中不存在，使得HDAC8成为I类HDAC成员中NO的唯一靶标。I类HDAC在中枢神经系统发育中发挥重要的调节作用。特别是，HDAC8是一个SFARI基因（SGS：S），被发现与科妮莉亚·德·朗格综合征、自闭症、雷特相关疾病和智力障碍相关。我们的假说提出，NO介导的HDAC8的S-亚硝基化导致特定基因位点组蛋白乙酰化增加和基因激活，破坏了通常由所有I类HDAC协调维持的关键神经元基因之间的组蛋白乙酰化和基因表达平衡水平。丁酸和VPA可能通过同时抑制所有I类HDAC来挽救这种失衡状态，从而重置基因组中所有I类HDAC靶向区域的组蛋白乙酰化。这一理论框架也解释了抑制HDAC1和HDAC3的挽救效应。敲除hdac8的挽救效应可能是由于NO失去了其靶分子，因此无法再通过HDAC8的S-亚硝基化调节基因表达。我们通过表观遗传重编程来挽救神经发育缺陷的方法，与先前使用类似策略纠正由组蛋白甲基化失衡诱导的社会行为缺陷的成功经验相呼应。关于NO对I类HDAC差异抑制的假说也与I类HDAC存在翻译后修饰密码的概念高度契合。

重要的是，升高的一氧化氮水平和亚硝化应激与ASD的发病机制有关。研究发现，被诊断为ASD的儿童的血液和唾液中一氧化氮及其稳定代谢产物（如亚硝酸盐和硝酸盐）以及亚硝化应激生物标志物的浓度升高。在ASD动物模型中也观察到了同样的现象，包括Shank3缺陷小鼠和Cntnap2突变小鼠。Shank3缺陷小鼠表现出广泛的S-亚硝基蛋白质组变化，特别是关键突触蛋白、参与谷氨酸传递的蛋白以及高风险SFARI基因产物的S-亚硝基化。通过神经元型一氧化氮合酶（nNOS）抑制剂抑制NO产生，可恢复Shank3突变小鼠中减少的突触蛋白表达和降低的树突棘密度。在Cntnap2突变小鼠中，nNOS抑制同样逆转了NO代谢物和亚硝化应激标志物的增加，并挽救了突触蛋白表达和树突棘密度的缺陷。这些发现表明，失调的一氧化氮信号可能是自闭症的一个共同特征，为我们模型中CPF诱导的NO升高与神经发育和行为改变之间的联系提供了额外支持。

需要进一步的研究来检验我们的假说。首先，直接量化CPF暴露斑马鱼大脑和肠道中的NO及其代谢物（如亚硝酸盐/硝酸盐）将验证所提出的亚硝化应激增加。其次，在CPF暴露后通过实验检测斑马鱼HDAC1、HDAC3和HDAC8酶中的S-亚硝基化，将验证所提出的NO对I类HDAC的差异调控。第三，全基因组范围的组蛋白乙酰化分析，特别是在神经元基因位点，可以确认CPF诱导的表观遗传失调以及丁酸介导的讨论（续）

此外，对NO产生的药理学或遗传学抑制（例如使用NOS抑制剂）应测试其逆转CPF暴露动物社交缺陷的能力。如果成功，这将确立NO作为微生物组改变与神经发育结果之间的功能性介质。

总之，我们的研究结果通过一个涉及反硝化细菌和选择性HDAC调控的新型机制轴，将CPF诱导的微生物组失调、NO产生、表观遗传修饰与ASD相关行为联系起来。这一整合框架不仅揭示了CPF对神经发育风险的贡献，还为探索NO信号和HDAC1作为环境触发性神经发育障碍的治疗靶点提供了令人信服的理由。

材料与方法

斑马鱼饲养

斑马鱼饲养于26°C–27°C，光照周期为14小时光照、10小时黑暗。所有实验均使用野生型AB品系。所有斑马鱼实验均经华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准。

化学暴露

受精卵经分选后转移至直径100毫米、深15毫米的培养皿中，每个培养皿100枚胚胎。每个培养皿中加入25 mL HEPES缓冲的E3培养基。化合物储备液溶解于DMSO中，储存于-20°C。对照组接受与相应化合物处理等体积的DMSO。对于胚胎期化合物处理，胚胎在0-3 dpf期间暴露于化合物。在1 dpf和2 dpf时清除死亡胚胎以防污染。在3 dpf时，用E3培养基冲洗所有存活幼体，并转移至装有新鲜E3培养基的干净培养皿中。在5 dpf时，将每个培养皿中的幼体转移至单独的育苗缸中，饲养至25 dpf进行Fishbook检测。对于过夜化合物处理，将24 dpf的鱼转移至直径100毫米、深15毫米的培养皿中，每皿15条鱼，并过夜（约15小时）暴露于化学物质。过夜暴露后，冲洗鱼并进行Fishbook检测。

以下化合物也购自Cayman Chemical（美国密歇根州安娜堡）：DMSO（CAS # 67-71-0，产品编号20131）、毒死蜱（CAS # 2921-88-2，产品编号21412）、丁酸钠（CAS #156-54-7，产品编号13121）、3-吲哚丙酸（IPA，CAS #830-96-6，产品编号28821）、胆酸（CAS #81-25-4，产品编号20250）、鹅去氧胆酸（CDCA，CAS #2646-38-0，产品编号35346）、熊去氧胆酸（UDCA，CAS #31687-65-7，产品编号15121）、丙戊酸（VPA，CAS #1069-66-5，产品编号13033）、烟酰胺（CAS #98-92-0，产品编号11127）、曲古抑菌素A（TSA，CAS #58880-19-6，产品编号89730）、SNAP（CAS # 67776-06-1，产品编号82250）和IBMX（CAS # 28822-58-4，产品编号13347）。乙酸（CAS #64-19-7，产品编号45754）和琥珀酸（CAS #110-15-6，产品编号S9512）购自Sigma-Aldrich。以下HDAC抑制剂购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯章克申）：BRD-6929（CAS #849234-64-6，目录号：HY-100719）、RGFP966（CAS #1357389-11-7，目录号：HY-13909）和PCI-34051（CAS #950762-95-5，目录号：HY-15224）。

Fishbook检测

Fishbook检测按先前描述进行。简言之，测试场地由总计44个3D打印的、深10毫米、宽8.5毫米、长80毫米的矩形腔室平行排列组成。每个腔室由两个透明的亚克力窗片（厚1.5毫米）分为三个隔间：一个60毫米长的中央测试隔间用于放置受试鱼，以及两个8.5毫米长的末端隔间分别用于放置社交刺激鱼或保持空置。使用塑料移液管（剪掉尖端以扩大开口）将每条受试鱼放入单独的测试腔室内。在社交刺激隔间前放置一个3D打印的白色梳状结构，以防止在测试开始前受试鱼看到社交刺激鱼。将受试鱼放入腔室后，将场地置于成像站内，移走梳状结构以让受试鱼在视觉上暴露于社交刺激鱼。经过短暂的适应期后，录制10分钟的测试过程。

视频通过Bonsai软件进行流式处理。在录制期间实时分析视频，并将每条鱼相对于其自身测试隔间的逐帧x和y坐标导出为CSV文件。使用自定义Python脚本分析数据以计算社交得分并生成轨迹图。社交得分定义为鱼在平均y轴位置上的帧数。每个测试腔室的中心被指定为y轴原点，赋值为0。社交刺激鱼所在腔室末端赋值为1，空对照隔间所在腔室末端赋值为-1。在此坐标系中，所有社交得分介于-1和1之间。较高的社交得分表明测试期间受试鱼与社交刺激鱼之间的平均距离较短，这表示更强的社交偏好。

使用GraphPad Prism分析和绘制Fishbook结果。对于多组分析，使用Shapiro-Wilk检验检查数据集的正态分布，以确认半数以上的数据呈正态分布并且标准差落在方差比内。为了比较具有一个自变量的多组，执行假设高斯分布和等标准差的双向方差分析（ANOVA），并使用Dunnett检验进行多重比较校正。为了比较具有两个自变量的组，执行双向ANOVA，随后进行Fisher最小显著差异（LSD）检验进行事后分析。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。

CRISPR-Cas9基因敲除

我们设计了3组靶向每个HDAC同源物的sgRNA，以最大化F0敲除效率。使用CHOPCHOP进行sgRNA设计。选择靶向早期编码外显子的sgRNA，以尽可能早地引入无义突变，增加功能丧失突变的可能性。所有gRNA序列见补充表S2。

根据已发表的方案，在靶标RNA序列前添加SP6启动子序列，随后连接一个重叠接头，该接头与一个80 bp恒定寡核苷酸的5'端互补。寡核苷酸由Eurofins Scientific合成。使用Phusion Hot-Start Flex DNA聚合酶（新英格兰生物实验室）和基因特异性寡核苷酸及恒定寡核苷酸生成双链DNA。使用Zymo Clean and Concentrator-5试剂盒（Zymo Research）纯化双链DNA。使用MEGAscript SP6转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行体外sgRNA转录，并使用Zymo RNA Clean and Concentrator-5试剂盒（Zymo Research）纯化。

为了进行斑马鱼胚胎显微注射，将一对雄性和雌性成年斑马鱼在交配笼中过夜饲养，中间用隔板隔开。第二天清晨在注射前立即通过拉开隔板允许交配来收集1细胞期胚胎。通过将sgRNA与2 µM Spy Cas9 NLS和1X NEBuffer（新英格兰生物实验室）混合制备注射溶液。

斑马鱼脑和肠道解剖

在受精后25天，通过将斑马鱼在培养皿中的冰水中浸泡15分钟进行安乐死。对于脑解剖，将鱼垂直放置，背侧朝上，置于解剖蜡中预先刻好的槽内。使用Gorilla Glue固定下半身以确保稳定性。在培养皿中充满冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）以防止操作过程中干燥。使用尖锐注射针头的尖端从颅骨中心取出大脑。每个重复收集5个大脑，每个条件准备4个重复。对于肠道解剖，将鱼水平放置于干净培养皿上，使用胶水固定头部和尾部。添加冰冷的PBS以保持湿润，使用解剖刀片轻轻分离肠道。每个重复收集24个肠道，每个条件准备4个重复。采集后立即将大脑和肠道在液氮中速冻，并储存在-80°C。

RNA测序

使用Quick-RNA Miniprep Kit（Zymo Research，加利福尼亚州尔湾市）从冷冻的25 dpf斑马鱼脑中分离总RNA，按照制造商说明进行操作。使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）在260 nm处定量RNA浓度。使用Agilent 4150生物分析仪进行样品质量控制，以识别RIN>7的样品。每个样品取200 ng合格RNA进行文库制备。简言之，使用带oligo（dT）的磁珠从总RNA中进行mRNA富集。使用片段化缓冲液将富集的含poly（A）尾的mRNA片段化，然后使用随机N6引物进行逆转录以合成cDNA双链。将合成的双链DNA进行末端修复和5'磷酸化，并在3'端形成一个突出的'A'，形成平末端，然后连接一个3'端带有突出'T'的泡状接头。使用特异性引物对连接产物进行PCR扩增。将PCR产物变性为单链，然后使用桥接引物生成单链环状DNA文库。对构建的文库进行质量检查，通过质量控制后进行测序。使用phi29扩增文库以形成DNA纳米球（DNB），每个DNB包含超过300个分子拷贝。将DNB加载到图案化纳米阵列上，通过合成测序的方式生成150 bp双端读段。测序在MGI T7平台上进行。

FASTQ格式的原始测序读段首先使用FastQC（v0.11.9）进行质量控制，然后使用Clumpify（BBMap，v38.90）、Trimmomatic（v0.39）和fastp（v0.23.2）在Ubuntu 20.04 LTS上进行处理，以获得干净读段。使用R Studio（v4.4.1）对干净读段进行分析。首先将干净读段比对到参考基因组（斑马鱼Danio rerio，GCF_000002035.6_GRCz11_genomic）。使用R Studio中Rsubread（v2.18.0）包的featureCounts创建基因表达矩阵。使用Limma R包（v3.60.6）进行差异表达分析。以p值<0.05且|log2FoldChange|≥1的基因为显著差异表达基因（DEGs）。使用EnhancedVolcano（v1.22.0）、pheatmap（v1.0.12）和ggplot2（v3.5.1）包绘制火山图和热图。

基因集富集分析（GSEA）

使用clusterProfiler R包（v4.12.6）对DEGs进行功能富集分析。分别使用gseGO()和gseKEGG()函数进行GO和KEGG富集的GSEA。使用biomaRt（v2.60.1）转换基因ID以确保跨数据库的兼容性。以校正后p值<0.05且标准化富集得分（NES）>1的通路为显著。

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析

为了探索DEGs之间的蛋白质相互作用关系，使用STRING数据库（v12.0）构建PPI网络。然后将PPI相互作用数据导入R Studio进行进一步网络分析。使用igraph（v2.3.0）包进行网络拓扑分析以识别枢纽基因。计算每个基因的节点度（直接相互作用数量），具有最高节点度值的基因被视为枢纽基因。

定量PCR

使用SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System根据制造商方案将从斑马鱼脑中提取的总RNA样本逆转录为cDNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix（GlpBio Technology Inc，加利福尼亚州蒙克莱尔）在Bio-Rad CFX Connect实时系统（Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯）中扩增所得cDNA产物。数据以持家基因Beta-actin进行标准化。使用国家生物技术信息中心（NCBI）Primer-BLAST设计引物，并由Eurofins Genomics（肯塔基州路易斯维尔）合成。引物序列见补充表S3。

通过LC-MS进行非靶向代谢组学

乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）、乙酸铵和乙酸（均为LC-MS级）购自Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）。氢氧化铵购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。去离子水由EMD Millipore（马萨诸塞州比勒里卡）的水纯化系统提供。PBS购自GE Healthcare Life Sciences（犹他州洛根）。对应于所测代谢物的标准化合物购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）和Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）。

斑马鱼肠道组织样本（每样本约10-12 mg）在Eppendorf管中使用Bullet Blender匀浆器（Next Advance，纽约州阿弗利尔帕克）在200 µL MeOH:PBS（4:1，v:v，含有1,810.5 μM 13C3-乳酸和142 μM 13C5-谷氨酸）中匀浆。然后加入800 µL MeOH:PBS（4:1，v:v，含有1,810.5 μM 13C3-乳酸和142 μM 13C5-谷氨酸），涡旋10秒后，将样品在-20°C下储存30分钟。然后将样品在冰浴中超声处理30分钟。在14,000 RPM下离心10分钟（4°C），将800 µL上清液转移至新Eppendorf管中。然后使用CentriVap浓缩器（Labconco，堪萨斯州斯科特堡）在真空下干燥样品。在MS分析前，将所得残留物复溶于150 μL 40% PBS/60% ACN中。从所有研究样品中汇集一个质量控制（QC）样品。

此处使用的非靶向LC-MS代谢组学方法基于多项研究报道的方案。简而言之，所有LC-MS实验均在Thermo Vanquish UPLC-Exploris 240 Orbitrap MS仪器（马萨诸塞州沃尔瑟姆）上进行。每个样品注射两次，10 µL用于负电离模式分析，4 µL用于正电离模式分析。两种色谱分离均在亲水作用色谱（HILIC）模式下于Waters XBridge BEH Amide色谱柱（150 x 2.1 mm，2.5 µm粒径，Waters Corporation，马萨诸塞州米尔福德）上进行。流速为0.3 mL/min，自动进样器温度保持在4°C，柱温箱设置为40°C。流动相由溶剂A（10 mM乙酸铵，10 mM氢氧化铵于95% H2O/5% ACN中）和B（10 mM乙酸铵，10 mM氢氧化铵于95% ACN/5% H2O中）组成。初始1分钟等度洗脱（90% B）后，溶剂B的比例在t=11分钟时降至40%。溶剂B的比例在40%下维持4分钟（t=15分钟），然后B的比例逐渐恢复到90%，为下一次进样做准备。使用配备电喷雾电离（ESI）源的质谱仪，收集70至1050 m/z的非靶向数据。

为了从MS谱图中识别峰，我们广泛使用了内部的化学标准品（约600种水性代谢物），此外，还将所得MS谱图与HMDB库、Lipidmap数据库、METLIN数据库以及包括mzCloud、Metabolika和ChemSpider在内的商业数据库进行比对。MS数据提取的绝对强度阈值为1,000，质量精度限制设为5 ppm。鉴定和注释使用了保留时间（RT）、精确质量（MS）、MS/MS碎片图谱和同位素图谱的可用数据。我们使用Thermo Compound Discoverer 3.3软件进行水性代谢组学数据处理。使用该软件对非靶向数据进行峰拾取、对齐和归一化处理。为了提高严谨性，仅将QC池中CV < 20%且出现在>80%样品中的信号/峰纳入进一步分析。

代谢组学数据分析

使用在线平台MetaboAnalyst 6.0进行代谢组学数据预处理和分析。在MetaboAnalyst中使用富集分析模块进行通路富集分析，以识别显著的代谢通路。对于可视化，使用R Studio中的ComplexHeatmap（v2.20.0）包生成选定代谢物的热图。

粪便收集

在25 dpf时，在早晨喂食后，将斑马鱼从育苗缸转移到装有系统水的培养皿中，密度为每皿50条鱼。三小时后，将鱼从培养皿中取出。收集含有粪便的水并离心。弃去上清液，将粪便沉淀立即在液氮中速冻，并储存在-80°C。

宏基因组学

使用Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Microprep Kit（Zymo Research，加利福尼亚州尔湾市）根据制造商说明从冷冻宏基因组学

使用Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Microprep Kit（Zymo Research，加利福尼亚州尔湾市）根据制造商说明从冷冻的斑马鱼粪便中分离微生物DNA。使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）在260 nm处定量DNA浓度。使用微孔板读数仪进行浓度QC，并使用琼脂糖凝胶电泳进行完整性QC。使用Covaris仪器通过超声将DNA样品片段化。通过调整破碎参数获得符合目标长度要求（300-400碱基对）的短DNA片段。使用Agencourt AMPure XP-Medium试剂盒对片段化样品进行筛选，并将样品条带浓缩至约300-400 bp。使用Qubit dsDNA HS Assay Kit 500 assays试剂盒定量纯化后的DNA样品。修复双链DNA末端，并在3'端添加“A”碱基。连接接头至DNA。通过PCR扩增连接产物。使用Agencourt AMPure XP-Medium对扩增产物进行片段筛选。使用Agilent 2100生物分析仪检测PCR产物。将PCR产物变性为单链DNA后，进行环化反应以获得单链环状产物。通过酶切去除未环化的线性DNA分子后获得最终文库。使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent DNA 1000 Reagents）检测文库的片段大小和浓度。通过滚环扩增复制单链环状DNA分子，获得每个包含超过300个分子拷贝的DNB。将DNB加载到图案化纳米阵列上，以获得150 bp双端读段。测序在MGI T7平台上进行。

宏基因组学数据分析

我们获得了每个样品的150 bp双端测序数据。使用FastQC进行初始质量控制以评估读段质量，所有样品均被视为高质量。为了去除宿主来源的序列，使用Bowtie 2（默认参数）将原始FASTQ文件比对到斑马鱼（Danio rerio）参考基因组（GRCz11）。仅保留未比对上的读段——即未比对到斑马鱼基因组的读段——用于下游微生物分类分析。每个样品平均保留了约2000万个非斑马鱼读段。我们使用Kraken 2（v2.1.3）和标准Kraken数据库来推断剩余读段的微生物来源。Kraken在默认设置下运行，但修改了分类阈值，要求至少三个重叠k-mer才能将读段分配给一个分类群，这比默认设置（两个k-mer）略为保守。此修改旨在提高分类特异性，同时保持灵敏度。在所有样品中，至少40%的非宿主读段被分类为细菌。为了估计不同分类水平的读段计数，我们使用Bracken（贝叶斯重新估计丰度）从Kraken输出文件中重新估计种、属及更高水平的丰度。

对于处理组（CPF vs. DMSO）之间的差异丰度和流行度分析，我们使用了MaAsLin 3（微生物组多变量关联线性模型）R包，该包旨在同时建模丰度和流行度，同时考虑微生物组数据的成分性质。在建模前，使用总和归一化（TSS）对丰度数据进行归一化，将每个特征计数除以每个样品的总计数，以说明文库大小的差异。将归一化数据集拆分为两个矩阵：一个二元流行度矩阵（存在/不存在）和一个用于定量分析的非零丰度矩阵。所有宏基因组学数据分析均在R版本4.4.0（2024-04-24）上于CentOS Linux 7 (Core)平台（x86_64-pc-linux-gnu）进行。

格里斯试剂检测法

为了测量CPF暴露后的亚硝酸盐水平，将85枚胚胎从0到3 dpf暴露于15 µM CPF或DMSO对照中，并在6 dpf时收集。称重后，清洗幼体，在100 µL水中匀浆，离心收集上清液。使用格里斯试剂亚硝酸盐测量试剂盒（Cell Signaling Technology，产品编号#13547）根据制造商说明进行格里斯试剂检测。每组进行三次重复分析。

数据可用性

评估本文结论所需的所有数据均包含在论文和/或补充材料中。

致谢

我们感谢华盛顿大学比较医学办公室提供斑马鱼饲养支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）国家环境健康科学研究所（NIEHS）资助，资助号R00ES031050、R01ES030197、R01ES031098、R25ES025503和P30ES007033，以及华盛顿大学环境健康与微生物组研究中心（EHMBRACE）。内容仅由作者负责，并不一定代表NIH的官方观点。

补充信息

作者贡献

L.D.、A.X.K.和P.Z. 设计并进行了实验，分析了数据。J.C.和H.G.进行了代谢组学分析。K.P.、M.J.、A.E.、I.D.和Y.M.协助进行实验和数据分析。J.W.M和T.B.分析了宏基因组学数据。J.Y.C.、H.G.、T.B.和Y.G.规划了多组学分析。Y.G.构思了本研究，解释了数据并撰写了手稿。

资助

HHS | NIH | 国家环境健康科学研究所（DEHS）（R00ES031050）