Highlights（亮点）
- EPA暴露后TBI揭示了一种潜在的脑血管脆弱性
- EPA重编程内皮细胞代谢，损害血管修复和重塑
- EPA驱动的神经血管不稳定性促进tau蛋白病和认知衰退
- 研究结果揭示了代谢环境是ω-3脂肪酸在脑损伤中作用的关键因素
摘要
重复性轻度创伤性脑损伤(rmTBI)先于慢性创伤性脑病(CTE)发生，涉及神经血管功能障碍。ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)被宣传具有神经保护作用，但它们在脑损伤后对长期影响仍不确定。我们发现了一种与大脑中二十碳五烯酸(EPA)积累相关的代谢脆弱性，EPA是鱼油衍生的主要PUFA。在鱼油饮食模型中，EPA在基础状态下积累，但在rmTBI后特异性耗尽，表明在损伤相关代谢重塑过程中被动员。这一模式与基质重塑、内皮变性和神经血管功能受损同时发生。皮层转录组学表明血管生成程序减少，脂肪酸代谢增加，脂质组学将EPA与适应不良的脂质参与联系起来。使用代谢适应的内皮细胞进行的机制研究表明，EPA特异性损害修复功能。对死后CTE脑组织的分析揭示了血管和代谢基因表达变化的平行证据，加强了转化相关性。这些发现挑战了脑损伤后ω-3普遍神经保护作用的假设。
图形摘要
图1，常被称为"隐形流行病"，仍然是全球死亡和长期残疾的主要原因，对年轻人和老年人群影响尤为严重。尽管重复性轻度TBI(rmTBI)通常被认为无害，但越来越多的证据表明，即使是亚临床损伤也可能引发持续数十年的慢性神经血管损伤级联反应，显著增加患慢性创伤性脑病(CTE)和痴呆的风险。尽管其普遍性和长期影响，目前尚无有效策略来阻止或逆转rmTBI相关的脑血管退化，使受影响个体面临数十年的渐进性认知衰退。
大脑的血管网络，总长度超过600公里，是大脑代谢、氧气输送和废物清除的关键基础设施。TBI后，这一脑血管系统特别容易受损，高达50%的长期幸存者表现出持续的脑血管病理。血管生成，即从现有毛细血管形成新血管的过程，是支持组织修复和维持神经血管单元(NVU)完整性的关键再生反应。这一过程受到脑微血管内皮细胞(BMVECs)、细胞外基质(ECM)重塑和局部代谢线索之间动态相互作用的严格调控。然而，内皮能量代谢或信号通路的破坏可能会干扰血管再生，并可能导致长期功能障碍和神经退行性过程。了解这些细胞和代谢因素如何塑造再生反应，对于开发针对脑损伤的靶向干预措施至关重要。
鱼油(FO)衍生的n-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)，特别是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，是支持全身和大脑健康的最广泛使用的膳食补充剂之一。与DHA不同，DHA是神经元膜的主要结构成分，EPA表现出有限的膜结合，并在特定条件下（如饮食不平衡或辅因子缺乏）被报道影响认知结果。虽然n-3 PUFAs普遍被认为具有神经保护作用，但一些研究表明，它们的影响可能取决于脂质种类的平衡、暴露持续时间和生理环境，特别是在炎症或损伤的情况下。尽管多项研究报道ω-3 PUFAs可能在某些情况下支持血管稳定性，但其他研究表明，包括EPA及其衍生物在内的特定脂质介质，可能会以剂量和环境依赖的方式调节血管生成反应。然而，长期ω-3摄入与脑损伤后脑血管适应之间的关系尚未完全理解，特别是随着膳食补充剂在具有神经学脆弱性的个体中越来越普遍。
为了解决这一知识空白，我们实施了一种循环FO补充饮食方案，旨在模拟间歇性ω-3摄入模式，结合重复性轻于轻度TBI(rlmTBI)模型，该模型在维持纯化对照饮食的动物中不会产生长期缺陷。这种敏感的实验框架使我们能够检测出脑血管弹性中可能被掩盖的细微变化。通过整合体内、体外和人体组织分析，我们证明了持续的EPA富集发生在不改变全身代谢参数的情况下，且这种大脑储存库在rlmTBI后被特异性耗尽，表明在损伤反应过程中EPA的优先参与。在此背景下，慢性EPA富集与血管修复受损、神经血管单元重塑和认知恢复延迟相关。在旨在模拟损伤后底物利用转变的代谢许可性脑微血管内皮细胞培养条件下，EPA（而非DHA）降低了血管生成和伤口修复能力，削弱了内皮凝聚力，并以与皮层转录组数据一致的方式激活了脂质感应通路。最后，死后CTE组织显示PUFA失衡、血管不稳定以及脂肪酸代谢改变和血管生成抑制的转录特征平行证据。总之，这些发现表明，持续的EPA暴露代表了一种情境依赖性代谢脆弱性，可能损害脑损伤后的脑血管弹性。
结果
长期FO补充驱动异常EPA积累，揭示TBI后潜在的代谢脆弱性
长链n-3 PUFAs，特别是EPA和DHA，被广泛认为是神经血管健康和代谢稳态的关键调节因子。然而，尽管它们具有广泛的治疗吸引力，但持续膳食n-3 PUFA富集对大脑脂质代谢的长期后果仍未解决。在我们的模型中，长期FO衍生的n-3 PUFA摄入导致基础条件下大脑中游离EPA的显著积累，而这种池在重复性轻度损伤后被选择性减少，揭示了一种先前未被认识的脂质响应形式。虽然这一转变在长期认为大脑脂肪酸代谢相对有限的观点下最初看似矛盾，但最近的研究表明，健康大脑，特别是星形胶质细胞，在特定条件下可以氧化脂肪酸。这些见解表明，我们观察到的动员反映了脂质储备的情境依赖性参与，而不是对基础代谢原则的矛盾。因为长链PUFAs如EPA和DHA主要从饮食中获取，内源性生产通过α亚麻酸的低效转化有限，我们接下来检查了FO补充如何塑造基础和损伤后条件下的循环和大脑游离脂肪酸池。
为在生理相关条件下模拟慢性n-3 PUFA暴露，我们在两个月大的野生型C57BL/6J小鼠中实施了循环FO补充高脂饮食(FO-Suppl. HFD)方案。该饮食在纯化对照饮食中交替一天FO-Suppl. HFD和两天，模拟人类补充模式的波动。对照动物维持连续纯化饮食。饮食一个月后，小鼠接受重复性轻于轻度闭合性头部损伤(rlmTBI)或假手术，随后继续饮食暴露6个月以评估慢性损伤后后果（图1A和1B）。重要的是，FO-Suppl. HFD不影响总热量摄入、体重、空腹血糖或身体脂肪（图1A-1F），确认在整个研究期间系统代谢稳态保持完整。
然而，通过高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)对游离脂肪酸的定量分析揭示了惊人的脑脂质特征：在假手术小鼠中，EPA选择性且显著地在FO-Suppl. HFD喂养的小鼠大脑中积累（图1G和1H），表明在非损伤条件下对PUFA周转的相对抵抗。这种积累是EPA特有的，DHA并未复制，表明n-3 PUFAs在大脑中具有不同的代谢命运。值得注意的是，这种储存库不是静态的：在rlmTBI小鼠中，大脑EPA水平随时间显著下降（图1I），而DHA水平保持不变，表明损伤扰动了选择性PUFA保留。在损伤后6个月，FO喂养的TBI动物与FO假手术相比表现出显著降低的大脑EPA水平，伴随着循环EPA的下降；然而，FO喂养的TBI小鼠中的血浆EPA水平仍高于对照饮食组。在六个月时间点，FO喂养的小鼠也显示出循环DHA的轻微增加，而皮层DHA水平保持不变，这与DHA在大脑中的严格调控和相对缓慢的调整相比，EPA池更具动态响应性。相比之下，DHA在血液和大脑中都保持显著稳定，强化了EPA对损伤驱动的代谢转变具有独特响应性的观点。
总之，这些发现表明，长期FO补充导致EPA在基础条件下积累，但在rlmTBI后，大脑EPA水平下降，表明损伤相关的代谢条件下对EPA的动态、损伤相关变化。EPA而非DHA在循环和皮层中显示出与膳食和损伤相关的协调变化，而DHA保持稳定，支持EPA而非DHA作为我们模型中损伤相关脂质重编程的主要介导者。
EPA驱动的神经血管不稳定触发TBI后的血管周围tau蛋白病和认知衰退
重复性轻度TBI(rmTBI)是CTE的已知前兆，但早期神经血管破坏如何导致长期认知衰退的机制仍未完全理解。这种退化是仅反映累积损伤负担，还是源于延迟的、适应不良的代谢转变重塑脑血管功能，仍有待确定。鉴于脂质代谢在NVU维持中的关键作用，我们假设长期n-3 PUFA暴露，特别是EPA，可能代谢性地使NVU，特别是其内皮部分，为损伤后的功能障碍做准备。
使用我们建立的rlmTBI范式结合循环FO补充HFD，我们接下来检查了饮食背景是否影响损伤引起的急性神经抑制。恢复直立反射——一种衡量短暂损伤后神经抑制的指标，而非永久性功能丧失——在rlmTBI小鼠中比假对照组显著延长，无论是在纯化对照饮食（图2A和2B；p < 0.0001）还是FO补充HFD组（图2C和2D；p < 0.0001）。重要的是，直立反射潜伏期在纯化对照饮食维持的rlmTBI小鼠与FO补充HFD组之间没有差异，表明初始损伤严重程度在饮食条件下相当。然而，长期结果在饮食组之间存在分歧。维持纯化对照饮食的小鼠表现出稳定的神经学评分和完整的空间学习，没有慢性缺陷的证据（图2E-2G，S1A和S1C）。相比之下，FO Suppl. HFD + rlmTBI小鼠在损伤后6个月出现延迟的行为异常。双因素重复测量方差分析显示神经学严重程度评分存在显著的组×时间交互作用，Dunnett事后检验发现FO Suppl. HFD + rlmTBI动物在6个月时的评分高于所有其他组，而在基线或1个月时未检测到差异（图2E）。空间学习性能的Morris水迷宫评估显示，FO Suppl. HFD + rlmTBI小鼠在获取第3-5天表现出比所有其他组长的逃逸潜伏期（p < 0.05-0.001），表明在持续FO补充条件下存在受损的空间学习（图2F，S1B和S1D）。与受损获取一致，第5天热图显示对照组精确、目标导向的游泳，而FO-Suppl. HFD + rlmTBI小鼠继续依赖周界搜索，表明无法形成平台位置的有效空间记忆（图2G）。总之，这些发现表明，慢性FO补充高脂喂养揭示了rlmTBI后延迟的、饮食依赖性神经行为功能脆弱性，而纯化对照饮食上的动物保持长期行为弹性。
组织病理学分析将这些行为障碍与血管周围tau蛋白病理的出现联系起来，这是早期CTE的标志（图3A）。高磷酸化tau(AT8)的免疫染色显示，在FO-Suppl. HFD喂养的rlmTBI小鼠的损伤皮层中，神经元和血管周围区域都有大量积累（图3B-3D）。值得注意的是，AT8阳性信号显示与凝集素标记的微血管的显著空间关联，表明血管相关区域是tau聚集的关键部位。与此一致，互补的NeuN共免疫染色确认了同一区域神经元AT8积累增加（图S2A），表明tau病理扩展到血管外，同时仍与微血管域紧密耦合。为进一
【全文结束】