摘要（略，见上文）
- 引言（略，见上文）
- 结果（略，见上文）
- 讨论（略，见上文）
- 材料与方法
4.1. 实验动物与伦理批准（略，见上文）
4.2. 大鼠胚胎成纤维细胞培养（略，见上文）
4.3. 大鼠新生成纤维细胞培养（略，见上文）
4.4. 人心房成纤维细胞培养（略，见上文）
4.5. 转分化方案（略，见上文）
4.6. 免疫荧光染色（略，见上文）
4.7. 膜片钳（略，见上文）
4.8. 梗死模型（略，见上文）
4.9. 心内注射
注射采用心肌内或静脉内方式，使用30G胰岛素注射器，总体积50-100微升。心肌内注射仅在对照大鼠中进行，在全身异氟烷麻醉下进行，不超过一次，注射混合物（CHIR99021–10 μM, Activin A — 9 ng/ml, BMP 4–5 ng/ml, IWP2–2 μM, bFGF — 8 ng/ml, TGFβ — 1 ng/ml，每20毫升循环血量）或无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS, Gibco）。对于IM模型动物，尾静脉内注射在术后第14天开始，持续28天，每周不超过2次注射。
4.10. 灌注心脏实验方案
Langendorff灌注方案和灌注方案基于先前发表的方案。取出心脏并插管主动脉的方案始于麻醉实验大鼠并通过脊柱断裂处死。接下来，通过以下步骤小心取出心脏：（1）从剑突切至肋骨侧端，（2）沿左右腋前线通过肋骨进行肋部开胸术，（3）将胸部向上偏移。这些步骤提供了进入心脏的完整通道。切除腔静脉和主动脉段完成心脏提取程序，之后用含肝素的Tyrode盐溶液（Sigma-Aldrich Co.）洗涤器官，并转移到含有相同溶液的培养皿中进行进一步操作。
通过主动脉将心脏连接到插管（带有软聚合物护套的针头）的过程需用手术线缠绕数圈。从心脏离体到开始灌注的时间不超过10分钟。
根据Langendorff方法，使用特殊装置进行心脏灌注。该装置由两个主要部分组成：一个灌注回路和一个基于高速成像装置（Olympus MVX-10 Macro-View荧光显微镜（Olympus Co., Tokyo, Japan），配备高速Andor iXon-3 Camera 897-U（Andor Technology Ltd., Belfast, UK））的记录光学系统。灌注回路准备用于恒定循环（Masterflex L/S Digital Drive, 600 rpm; 115/230 VAC, Masterflex L/S Easy-Load® II Pump Head, SS Rotor; 2-Channel (Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL, USA)）固定体积的液体，维持整个系统中灌流液的温度（Cole-Parmer Polystat Standard 6.5 L Heated Bath, 150 C, 115 V AC/60 Hz (Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL, USA)），包括心脏室，并对溶液进行氧合（Cole-Parmer Bubble trap, Water Jacketed Reservoir, Oxygenating Bubbler (Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL, USA)）。装置中循环的液体总体积通过使用紧凑型PDMS聚合物心脏室进行了优化。允许用含氧、加热溶液灌注心脏的最小体积减少至30 mL。
4.11. 光学映射方案
对于细胞培养，使用Fluo4-AM（Lumiprobe, 1892−500ug）和Di-8-ANEPPS（Thermo Fisher Scientific, D3167）在Tyrode盐溶液（pH 7.25–7.4）中根据先前描述的方案进行光学映射。信号以128×128像素分辨率和130帧/秒的采样频率记录（Olympus MVX-10 Macro-View荧光显微镜（Olympus Co., Tokyo, Japan），配备高速Andor iXon-3 EMCCD Camera (Andor Technology Ltd., Belfast, UK)）。
通常，全心脏的映射方案与细胞方案类似。使用Fluo4-AM（Lumiprobe, 1892−500ug）和Di-8-ANEPPS（Thermo Fisher Scientific, D3167）的光学映射也在Tyrode盐溶液（pH 7.25至7.4）中进行。信号以128×128像素分辨率和130帧/秒的采样频率，使用相同设置记录。光学映射的唯一区别在于，当心脏染色用于Fluo4-AM（Lumiprobe, 1892−500ug）（浓度2.8 ug/ml）和Di-8-ANEPPS（Thermo Fisher Scientific, D3167）（浓度15 ug/ml）的荧光时，通过向溶液中添加BDM（Sigma）以10 mM浓度去除心跳。
所有实验均在37°C下进行观察。实验使用电极刺激。电刺激持续时间设定为20 ms，振幅根据组织培养物或心脏兴奋阈值在5–8 V范围内调整。刺激间隔在200至1000 ms之间变化。使用发生器（2MHz USB PC Function Generator, PCGU100 (Velleman, Gavere, Belgium)）设定刺激。工作中使用铂电极。
使用ImageJ程序及相关插件进行数据处理。使用ImageJ插件（time-lapse color-coder）构建伪3D图像和激活图。在Wolfram Mathematica 12中进行主成分分析。
4.12. 数据处理与统计分析
光学映射数据的初步处理使用ImageJ（v1.54p）进行。为了构建激活图，对视频进行了背景扣除，然后使用卡尔曼滤波算法进行噪声去除和高斯模糊。激活图生成算法使用Python（v3.11.13）实现，使用了以下库：Matplotlib（v3.10.0）、NumPy（v2.0.2）、SciPy（v1.15.3）和Pandas（v2.2.2）。该算法基于每个单独像素的发光强度相对于其平均强度增加一定百分比。这种方法与对所有像素应用统一绝对阈值的标准技术相比，提高了方法的灵敏度。
为了分析钙波传播、动作电位传播和NADH光漂白，使用ImageJ进行初步处理（通过卡尔曼滤波算法进行噪声减少），然后在Microsoft Excel中进行数据处理，最后在Python（v3.11.13）中使用相同的库进行绘图和统计分析。使用Anderson-Darling检验进行统计分析，显著性水平为5%。
为了分析细胞中α-肌动蛋白表达的百分比，拍摄了免疫荧光染色后细胞的照片。基于照片中的表达数据，使用ImageJ标准函数计算表达α-肌动蛋白的细胞所占面积与所有细胞（f-肌动蛋白）所占面积的百分比。
- 结论
机电波传播对于心脏功能至关重要；心肌梗死后纤维化瘢痕对其的破坏会导致心律失常。本研究开发了用于成纤维细胞直接向心肌细胞转分化（TdCM）的最小化化学混合物。优化的四组分方案从大鼠和人类成纤维细胞生成了功能性诱导心肌细胞（iCMs），其中56–83%的细胞表达α-肌动蛋白。电生理学分析证实了心肌细胞样电特性的获得：人类iCMs表现出动作电位（-80 mV静息电位）和强大的钠电流（约4000 pA）。至关重要的是，部分重编程足以建立超过渗流阈值（20–30%）的传导通路，从而实现电传播。体内测试显示无血液学毒性，而光学映射显示治疗组梗死灶的传导面积为84%（对照组为71%）。我们的研究结果表明，最小化混合物可以在无需完全细胞转化的前提下恢复瘢痕传导性，推进了可转化的再生策略。综上所述，我们的研究结果表明，最小化混合物可以通过将瘢痕传导性恢复到接近渗流阈值的水平，从而在瘢痕中建立部分电连续性。这一结果是在无需完全细胞转化或完全结构/收缩成熟的情况下实现的，突出了一种主要针对电传导修复的可转化再生策略。
致谢
作者特别感谢Khalimat Murtazalieva和Yulia Medvedeva的启发和激励，使我们开始了这项研究。作者感谢Anastasia Dubrovskaya对实验的陪伴。我们要特别感谢MIPT、M.F. Vladimirsky莫斯科地区临床研究所和E. Meshalkin国家医学研究中心（俄罗斯联邦卫生部）的管理层。
参考文献（略）
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