创伤性脑损伤中TREC动态作为初始T细胞稳态生物标志物：一项纵向分析 - 健康研究

本研究为一项观察性研究，共纳入51名中重度创伤性脑损伤(TBI)患者，旨在探究T细胞受体切除环(TREC)和B细胞K-删除重组切除环(KREC)作为创伤性脑损伤患者免疫稳态潜在标志物的动态变化。通过实时聚合酶链反应(PCR)对系列外周血样本中的TREC和KREC水平进行定量分析。采用线性混合效应模型(LMM)分析纵向动态变化并识别临床预测因子，运用主成分分析(PCA)构建综合严重程度/炎症指数，并通过聚类自助法对最终模型进行验证。结果显示，大多数患者基线TREC水平接近或低于年龄匹配的正常值下限。TREC和KREC水平波动剧烈，呈现非单调变化和多倍变异。三名TREC动态下降的患者随后死于败血症。较低的TREC水平与年龄增长和较高的严重程度/炎症指数密切相关，而KREC动态则独立于所检查的临床和炎症参数。TREC水平的恢复与格拉斯哥昏迷评分(GCS)的提升及序贯器官衰竭评估(SOFA)评分的下降同步。通过提供观察患者易感性背后关键且潜在可调生物学机制的窗口，TREC分析为神经重症监护中的风险分层和未来免疫治疗策略的开发提供了一种有前景的新方法。

1 引言

创伤性脑损伤(TBI)仍是全球范围内死亡和长期残疾的主要原因，尤其在年轻和劳动年龄个体中。除了原发性神经损伤，继发性并发症也显著影响患者预后。其中，肺炎和败血症等感染尤为突出，其发展与创伤后免疫抑制密切相关——这是一种以免疫系统对病原体反应能力降低为特征的现象。现有的临床工具，如序贯器官衰竭评估(SOFA)量表，是评估危重症患者生理严重程度和器官功能障碍的标准。虽然SOFA提供了对患者状况的整体评估，但它并未包含对适应性免疫系统功能状态的直接测量。因此，识别和验证用于监测TBI患者免疫状态和恢复稳态的可靠生物标志物，是现代神经重症监护的关键目标。此类标志物的潜在候选物是淋巴细胞成熟过程中形成的环状DNA分子：T细胞受体切除环(TREC)和B细胞κ-删除重组切除环(KREC)。外周血中TREC水平反映了胸腺中新生T淋巴细胞（胸腺生成）的产生，而KREC水平则反映了骨髓中B淋巴细胞（B淋巴细胞生成）的产生。成人TREC和KREC水平的年龄和性别差异已被广泛讨论。TREC水平随年龄增长而持续下降，而KREC在成年人群中通常未观察到此类变化。一些研究报告女性TREC水平高于男性，但这并非普遍发现。TREC水平降低与一系列慢性疾病相关，特别是先天性和获得性免疫缺陷、自身免疫性疾病、心血管疾病和肾功能衰竭。此外，TREC水平在医院感染和社区获得性感染（尤其是COVID-19）中的预后价值也是一个活跃的研究领域。尽管TREC和KREC作为免疫功能标志物及其在多种疾病中的预后意义已得到确认，但其在TBI背景下的动态变化尚未被研究。本研究旨在检查中重度TBI患者在神经康复机构住院期间TREC和KREC水平的动态变化，寻找与这些指标变化相关的临床和实验室因素，并确定免疫恢复是否与临床稳定和神经系统恢复相一致。

2 材料和方法

2.1 研究设计和患者特征

本研究招募了51名年龄在18至60岁之间的患者（41名男性，10名女性）。所有参与者均患有中重度创伤性脑损伤(TBI)，并在联邦重症监护医学与康复学临床研究中心(FRCC ICMR)接受治疗和康复。该队列包括来自先前描述的队列的38名患者，以及使用相同纳入标准前瞻性招募的另外13名患者。从受伤到入住FRCC ICMR的中位时间为30天。排除标准包括：年龄小于18岁；有精神或神经系统疾病史（如中风、中枢神经系统肿瘤）可能影响康复结果；发育障碍；遗传性神经系统疾病；妊娠；不可治愈慢性疾病的终末期；在酒精或药物影响下受伤；以及军事损伤。研究方案获得了FRCC ICMR当地伦理委员会的批准。所有患者或其法定代表人均已签署书面知情同意书。

2.2 临床评估

入院时，使用序贯器官衰竭评估(SOFA)和格拉斯哥昏迷评分(GCS)评估患者病情严重程度。任何器官的SOFA评分≥3分定义为器官衰竭。GCS评分3-8分表示重度TBI，9-12分表示中度TBI。根据急性期的初始GCS评分，将患者分为中度TBI和重度TBI组。虽然我们认识到创伤后遗忘症(PTA)和意识丧失(LOC)是TBI分类的标准标准，但这些指标并非在所有转诊急性护理机构的回顾性记录中均一致可用。因此，GCS仍然是本队列中严重程度分类的主要指标，所有纳入患者均符合需要重症监护或专科康复的严重神经创伤标准。

2.3 TREC和KREC的定量评估

如前所述，使用多重实时聚合酶链反应(PCR-RT)测定全静脉血样本中的TREC和KREC水平。通过异丙醇沉淀从200μL血液中提取DNA。PCR-RT反应混合物（总体积25μL）含有200 ng基因组DNA。还包括针对8REC-Jα T细胞受体(TREC)片段、κ删除连接(KREC)区域和人白蛋白基因（作为参考基因）的特异性引物和探针。在CFX96仪器上进行扩增，程序如下：95°C 7分钟，然后45个循环的93°C 30秒和59°C 1分钟。对于绝对定量，使用含有TREC、KREC和白蛋白基因靶序列的质粒构建体的系列稀释液生成标准校准曲线。使用以下公式计算每100,000个有核细胞中的TREC和KREC拷贝数：拷贝数 = [TREC (KREC)平均拷贝数/(白蛋白基因平均拷贝数/2)] × 100,000。

2.4 数据收集与观察设计

所有患者均收集了TREC/KREC测量值。对于22名患者，因技术原因仅获得入院时的单次测量值。其余29名患者随时间获得了两次或多次测量值。研究设计主要比较入院时和出院前的TREC/KREC水平。然而，当患者临床状况发生显著变化（好转或恶化）时，会进行额外测量。恶化的体征尤其包括：出现感染性并发症，如发热、临床和实验室败血症或败血性休克体征、经X线证实的院内肺炎；SOFA量表上器官功能障碍加重；神经状态改变：意识水平突然下降，发生癫痫持续状态。关键的积极事件包括：成功脱离机械通气（拔管）、意识恢复、神经功能缺损显著消退、准备出院。在重复测量的患者中，测量次数中位数为3次，覆盖自入院起30天的典型观察窗口。

2.5 统计分析

使用Python (v3.13)以及statsmodels、pandas和scikit-learn库进行统计分析。对于多变量分析，三名患者因缺少临床评分而被排除，最终分析样本为48名患者（共112次观测）。为确保统计有效性，对TREC和KREC水平进行log10(x+1)转换，以实现正态分布并稳定方差。

2.5.1 分析策略概述

为确保严谨的模型选择和验证，我们的统计分析工作遵循结构化的四步方法：基础模型选择、降维、模型优化、稳健性验证。

2.5.2 线性混合效应模型(LMM)设定

为解释重复测量的非独立性，我们采用了线性混合效应模型(LMM)。在所有模型中，患者ID被指定为随机截距。主要因变量（结果）是经对数转换的TREC和KREC水平。候选固定效应包括人口统计学因素、时间尺度以及临床严重程度和炎症指标。

2.5.3 步骤1：时间尺度和基础模型选择

我们首先寻找模拟免疫恢复的最佳时间尺度。我们明确比较了两个尺度：生物学时间（受伤天数）和临床时间（住院天数）。我们还通过比较线性模型与包含二次项的模型来检验时间的非线性效应。基于AICc和对数似然比较，临床时间被确定为TREC的优拟合，而生物学时间则更适合KREC。由于“受伤到住院延迟”项不显著，临床时间被保留作为最终多变量分析的主要时间预测因子。来自健康人群的参考标准被用作外部基准，以判别免疫耗竭的程度。

2.5.4 步骤2：降维（综合指数）

为了解决临床标志物之间的多重共线性问题，我们使用主成分分析(PCA)作为先验数据降维技术。第一个主成分(PC1)解释了总方差的66.4%，且对所有三个标志物均显示一致的正载荷，因此作为综合“严重程度/炎症指数”被保留。

2.5.5 步骤3：层次回归和交互作用检验

使用层次回归方法进行最终变量选择。我们使用校正后阿凯克信息准则(AICc)独立比较了复杂度递增的嵌套模型，以分别确定TREC和KREC的最简约模型。在选择之后，我们明确检验了时间与系统性炎症之间的交互作用，以确定恢复率是否受到炎症反应严重程度的调节。

2.5.6 步骤4：稳健性和验证

使用非参数聚类自助法程序验证最终多变量模型的稳定性。在患者层面进行重采样，以保留纵向相关性。通过参数偏差分析和参数相关矩阵研究进一步评估模型质量。p值<0.05被认为具有统计学显著性。

3 结果

3.1 样本特征

研究队列包含51名中重度TBI患者。图表总结了研究设计并提供了患者数据分布。入院时SOFA评分中位数为3，GCS评分中位数为10。合并颅外损伤非常普遍，仅25.5%的患者为孤立性TBI。其余74.5%的患者至少有一处颅外损伤，54.9%符合多发伤标准。胸部创伤和四肢损伤各占37.3%。脊柱损伤占19.6%。腹部和盆腔损伤占15.7%。面部骨折占31.4%。颅外创伤的高患病率可能放大了全身炎症反应和继发感染风险。与损伤严重程度和长期制动一致，该队列表现出显著的病原体负担。院内肺炎是主要的感染性并发症(72.6%)，三名患者死亡败血症。此高感染率与广泛的侵入性医疗设备使用相对应：78.4%的患者接受了气管切开术，37.3%使用了中心静脉导管。仅21.6%的患者在住院期间未使用侵入性设备。继发性发病率几乎是普遍的，68.6%的患者被诊断患有由脑损伤继发的精神障碍。反映慢性危重症的系统性并发症，如缺铁性贫血(43.1%)和蛋白质-能量营养不良(27.5%)，也很普遍。总之，这些特征描述了一个具有高代谢需求、显著生命支持干预需求以及对院内并发症高度易感性的队列。

3.2 入院时TREC和KREC水平

由于之前未研究中重度TBI患者的TREC水平，我们首先将队列中的基线TREC水平与已发表的健康人群数据进行了比较。我们的大多数患者，在所有年龄段，其TREC水平均处于或低于年龄特异性正常范围的下限。

3.3 TBI患者TREC和KREC水平的动态变化

在29名具有重复测量的患者中分析的纵向动态表现出显著变异性。对于TREC，18名患者随时间呈上升趋势，而11名呈下降趋势。值得注意的是，TREC动态下降的三名患者正是发生致命性败血症的患者。KREC动态同样多变：14名患者呈上升趋势，15名患者呈下降趋势。基于基线水平的分层显示，TREC四分位数组间年龄存在显著差异，而KREC则未观察到这种模式。所有四分位数组的一个标志性特征是存在高度波动、非单调的变化，一些个体在数周内经历了多倍变异。

3.4 基础模型选择与特征(步骤1)

3.4.1 时间尺度比较与非线性评估

我们试图确定免疫恢复与生物学时间还是临床时间的关联更密切。时间动态因标志物而异。对于TREC，建模生物学时间揭示了显著的凹形（二次）轨迹，表明初始快速增加后趋于稳定。相反，对于KREC，临床时间提供了更好的拟合，并表现出显著的二次模式，与在生物学时间尺度上观察到的线性轨迹形成对比。结合临床时间和受伤到住院延迟的综合模型显示出略微改善的拟合，但延迟项本身并非显著预测因子。这证实了在受控康复环境内度过的时间是观察到的恢复模式的主要驱动因素。

3.4.2 基础效应与方差分解

基础LMM确定年龄和性别是基线TREC水平的主要决定因素，男性和老年患者计数较低。住院天数显示出积极趋势，但在此阶段未达到统计学显著性。相比之下，KREC基础模型显示与年龄、性别或住院天数无显著关联。方差分解显示TREC的组内相关系数(ICC)为64.2%，KREC为66.0%。这表明，虽然个体间差异是主导因素，但约34-36%的总方差由个体内随时间变化驱动，这证明寻找纵向临床预测因子的合理性。此外，我们通过纳入交互项来研究年龄对TREC的影响是否因性别而异。年龄×性别的交互项不显著，因此支持使用加性模型。

3.5 共线性检验与综合指数创建(步骤2)

对主要临床预测因子进行的评估显示它们之间存在强相关性。为缓解多重共线性，我们使用主成分分析(PCA)创建了一个单一的综合“严重程度/炎症指数”。载荷均为正且幅度相似，证实PC1是全身炎症和器官系统压力的代表性代理指标。

3.6 层次模型选择(步骤3)

层次模型比较表明，TREC动态受到系统性因素的强烈调节，因为纳入严重程度/炎症指数显著改善了模型拟合。相反，对于KREC，基础人口统计学模型仍是最简约的，因为临床指数未提供额外的解释力。值得注意的是，绝对淋巴细胞计数对于任一标志物都不是最佳预测因子，表明TREC/KREC密度提供了超出总细胞数量的独特生物学信息。

3.6.1 TREC恢复的驱动因素

最终的TREC多变量模型将严重程度/炎症指数确定为强大的负向预测因子。至关重要的是，添加该指数将患者内残差方差减少了26.6%。调整炎症后也揭示了时间效应：住院天数成为一个显著的正向预测因子，表明随着急性生理应激的缓解，T细胞稳态稳步恢复。除了主要效应，我们还探索了住院天数和严重程度/炎症指数之间潜在的交互作用，但结果不显著。对预测恢复轨迹的可视化检查表明，虽然全身炎症水平较低的患者在康复期间表现出TREC水平的强劲恢复，但较高的基线炎症可能会抑制幼稚T细胞稳态恢复的速率。

3.6.2 KREC动态的预测因子

KREC模型证实，B细胞动态不能由所检查的临床参数稳健解释。使用层次模型比较，基础人口统计学模型仍是最简约的，添加临床指数并未能提供TREC水平的恢复与格拉斯哥昏迷评分(GCS)的提升及序贯器官衰竭评估(SOFA)评分的下降同步。通过提供观察患者易感性背后关键且潜在可调生物学机制的窗口，TREC分析为神经重症监护中的风险分层和未来免疫治疗策略的开发提供了一种有前景的新方法。

1 引言

2 材料和方法

2.1 研究设计和患者特征

2.2 临床评估

2.3 TREC和KREC的定量评估

2.4 数据收集与观察设计

2.5 统计分析

2.5.1 分析策略概述

为确保严谨的模型选择和验证，我们的统计分析工作遵循结构化的四步方法：基础模型选择、降维、模型优化、稳健性验证。

2.5.2 线性混合效应模型(LMM)设定

2.5.3 步骤1：时间尺度和基础模型选择

2.5.4 步骤2：降维（综合指数）

2.5.5 步骤3：层次回归和交互作用检验

2.5.6 步骤4：稳健性和验证

3 结果

3.1 样本特征

3.2 入院时TREC和KREC水平

3.3 TBI患者TREC和KREC水平的动态变化

3.4 基础模型选择与特征

3.4.1 时间尺度比较与非线性评估

3.4.2 基础效应与方差分解

3.5 共线性检验与综合指数创建

3.6 层次模型选择

3.6.1 TREC恢复的驱动因素

3.6.2 KREC动态的预测因子

KREC模型证实，B细胞动态不能由所检查的临床参数稳健解释。使用层次模型比较，基础人口统计学模型仍是最简约的(AICc=149.71)，添加临床指数未显著改善拟合。这表明，虽然KREC水平表现出显著的个体间变异性，但其轨迹仍然独立于初始损伤的严重程度或全身炎症的程度。

3.7 非参数自助法稳健性

通过非参数聚类自助法获得的模型估计值是稳定的，年龄、性别和严重程度/炎症指数的95%自助法置信区间均不包含零。偏差分析证实了模型的高质量，所有预测因子的参数偏差均很小。渐近和自助法置信区间宽度的比较显示，自助法置信区间与原始估计值大致相当，反映了高度的模型稳定性，正如严重程度/炎症指数和相关矩阵所证明的那样，该模型有效地划分了患者间方差。

3.8 同步的免疫、临床和神经系统恢复

为了阐明TREC恢复的生物学意义，我们将康复前60天内的纵向免疫轨迹与临床和功能恢复标志物进行了比较。如图所示，队列表现出一种同步恢复模式，其特征是TREC水平逐渐升高，同时器官功能障碍缓解和神经系统状态改善。虽然个体轨迹仍具有随机性，但这些总体趋势突显了幼稚T细胞稳态的稳定是中重度TBI更广泛恢复过程的一个基本生物学组成部分。

4 讨论

在这项研究中，我们调查了TBI后康复患者TREC和KREC的水平及纵向动态，并描述了它们与免疫状态和全身恢复的关联。我们的主要发现表明，与年龄匹配的健康标准相比，大多数TBI患者表现出显著耗竭的TREC水平，反映出在亚急性期受损的幼稚T细胞稳态能力。虽然纵向轨迹的特点是显著的个体间变异性和非单调波动，但多变量分析确定了年龄、性别和全身炎症是TREC恢复的主要驱动因素。TREC水平的恢复与神经系统改善和器官功能障碍缓解同时发生。相比之下，KREC水平与所考虑的参数显著无关。

观察到基线TREC水平低，突显了年龄匹配参考区间的必要性；对老年人来说正常的数值可能意味着年轻患者的深度免疫耗竭。这种受损的幼稚T细胞稳态状态与“慢性危重症”的概念一致，在慢性危重症中，存活过重度TBI急性期的患者会经历持续的炎症、免疫抑制和分解代谢。从生物学上讲，TREC水平由胸腺输出和稳态增殖之间的相互作用决定。虽然胸腺贡献随着年龄增长自然减少——从25岁时的20%下降到55岁后的仅5%——但外周池通过现有细胞的分裂来维持。这种稳态增殖“稀释”了群体中的TREC，而经历广泛分裂的细胞往往形成记忆或偏向亚群极化的能力较差。因此，我们队列中观察到的TREC耗竭可能作为与慢性危重症相关的耗竭再生能力的分子标志。

解释数周内观察到的TREC水平快速、多倍波动，需要超越胸腺输出本身。这些动态可能反映了免疫系统的反应状态，受外周因素驱动，如增殖的稀释效应、血液和淋巴组织之间快速的淋巴细胞运输以及体液状态的变化。TREC的短暂下降本质上并非有害；它可能意味着强烈的增殖反应或免疫监视增强。然而，当与整体临床情况一起考虑时，持续的下降趋势意味着稳态恢复力的失败和再生储备的耗竭。

我们的分析揭示了幼稚T细胞稳态恢复与临床恢复之间存在显著同步性，表现为神经系统状态和多器官功能障碍的并行改善。这种一致性表明，TREC水平可以作为全身恢复的客观生物学指标。虽然GCS等临床评分可能受到镇静或观察者变异性的干扰...GCS等临床评分可能受到镇静或观察者变异性的干扰，而TREC的逐渐升高则提供了从分解代谢的、损伤驱动的状态向合成代谢的、允许恢复的环境转变的直接读数。在此背景下，“临床时间”作为生理稳定的代理指标。强化营养支持以及纠正铁和蛋白质-能量缺乏可能减轻初始应激诱导的扰动，通过代谢补充促进T细胞维持，即使在面对持续的院内挑战时也是如此。

值得注意的是，TREC分析提供了传统标志物未能捕捉到的精细见解。例如，入院时的GCS评分并不是TREC水平的显著预测因子，这可能是因为入院GCS反映的是急性神经损伤，而TREC水平则代表累积的、不断演变的全身免疫健康状态。同样，总淋巴细胞计数与TREC水平无关。总计数是粗略的测量指标，汇总了不同的功能亚群；患者可能拥有数值上正常的淋巴细胞计数，但功能上存在缺陷，其特征是新生的“高质量”幼稚T细胞池耗竭。

TREC分析的价值在于它能够超越简单的相关性，揭示潜在的生物学表型。虽然实际年龄是固定的，但TREC水平提供了“免疫年龄”的定量测量，这或许可以解释为什么同龄患者会经历截然不同的轨迹。通过将炎症、代谢应激和器官功能障碍的影响整合到单一读数中，TREC监测将范式转向“免疫康复”。这与最近提出的NIH-NINDS TBI分类和命名倡议一致，该倡议倡导多维“支柱”方法来捕捉损伤异质性。我们发现的同步免疫和临床恢复支持进行动态、重复评估以确定生物学支柱在亚急性和慢性阶段如何演变的需求。

在KREC水平中观察到的非同步波动与TREC动态或全身炎症无关，表明在TBI后环境中，B细胞和T细胞稳态受不同驱动因素支配。这种差异性影响值得单独研究，以了解神经创伤后体液免疫臂的特定脆弱性。

从临床角度来看，TREC定量为实时风险分层提供了工具。一个“灵活”的免疫系统——其中TREC随着炎症消退而迅速恢复——预示着良好的恢复力。相反，尽管临床改善，但“刚性”或持续低水平的TREC谱可能表明T细胞被隔离在组织中、处于无反应状态或通过凋亡而耗竭，使患者易发生继发感染。

4.1 局限性和未来方向

本研究受限于样本量小、单中心设计以及损伤机制方面的临床异质性。入组时间点的可变性（伤后16-69天）已通过比较生物和临床时间尺度进行了解决，但初始损伤复合体的长期影响仍有待完全阐明。未来的研究应同时测量细胞增殖标志物（如Ki-67）和运输标志物（如CCR7和CD62L），以解构危重症中TREC波动的复杂信号。这种多标志物方法将阐明快速变化是由稳态扩增还是淋巴细胞再分布驱动的。

虽然当前研究的重点是幼稚T细胞和B细胞恢复的决定因素，但TREC和KREC作为预后生物标志物（临床结果的独立预测因子）的潜力仍然是未来研究的关键领域。我们关于年龄和全身炎症影响的发现为在更大的多中心队列中解释此类预后模型提供了必要的框架。

5 结论

总之，TBI患者的TREC水平与年龄和全身炎症的消退密切相关。这些动态反映了幼稚T细胞稳态的稳定性和反应性，而不仅仅是胸腺输出，将TREC定位为神经重症监护和其他形式的慢性危重症中恢复的有前景的生物学指标。

声明

数据可用性声明

支持本文结论的原始数据将由作者提供，无保留。

伦理声明

涉及人类的研究已获得俄罗斯莫斯科联邦重症监护医学与康复学临床研究中心伦理委员会的批准。研究按照当地立法和机构要求进行。本研究参与者的书面知情同意书由其法定监护人/近亲提供。

作者贡献

DK：研究调查、概念构思、软件、撰写初稿、撰写及编辑、验证。AG：数据管理、撰写初稿、撰写及编辑、资源、概念构思、调查。EK：资源、调查、撰写初稿、数据管理、方法论、撰写及编辑。VZ：撰写及编辑、调查、数据管理、撰写初稿。TK：资源、撰写初稿、数据管理、撰写及编辑。MK：撰写初稿、资源、撰写及编辑、数据管理。SL：方法论、撰写及编辑、调查、撰写初稿。AK：资源、项目管理、撰写及编辑、撰写初稿、资金获取。LS：调查、资源、概念构思、撰写初稿、软件、可视化、验证、方法论、撰写及编辑。