NF-κB动态失调损害蛋白质稳态并导致衰老B细胞发育过早分化 - 健康研究

引言

衰老和炎症与适应性免疫反应减弱相关，包括疫苗效力降低。事实上，这些条件与骨髓中B细胞产量减少相关，从而限制了可参与体液免疫反应的B细胞供应。现有文献广泛记录了多能造血祖细胞的髓系偏移是B细胞供应减少的一个原因，并描述了多种潜在的分子机制。然而，B细胞供应的减少往往比T细胞更为明显，这提示炎症可能导致B淋巴细胞生成途径下游B系祖细胞的发育异常。

B淋巴细胞生成是一个严格调控的过程，包括一系列发育转变、增殖阶段和检查点，以确保产生足够数量的功能性免疫球蛋白成熟的B细胞。Hardy通过流式细胞术鉴定了骨髓中的六个发育阶段，它们可通过细胞表面标志物区分：前前B细胞（fraction A）、前B细胞（fractions B和C）、前B细胞（fractions C′和D）以及未成熟B细胞（fraction E）。沿着这一发育途径的分化转变必须与增殖阶段协调，以确保成年骨髓每天产生1-2×10^7个功能性未成熟B细胞，这些细胞能够定植于次级淋巴组织。

在这一转变中的关键质量控制步骤是前B细胞受体（BCR）检查点，位于fraction C，其中新重排的免疫球蛋白重链（IgH）被确认适合与替代轻链匹配，然后才允许进入前B细胞（fraction C′）的增殖阶段，以及后续在fraction D中免疫球蛋白κ轻链（Igκ）的重排。

转录因子NF-κB是一个二聚体家族，其最有效的转录激活因子是RelA和cRel，对B淋巴细胞前体通过上述发育阶段的进展至关重要，这一点已在多种NF-κB和IκB激酶（IKK）敲除或显性负突变株中得到证实。然而，NF-κB活性如何在淋巴细胞生成过程中被调控，以及NF-κB活性的不同水平或失调如何影响发育过程或祖细胞的命运决定，仍不清楚。这很重要，因为NF-κB活性对广泛刺激物有响应，包括发育和炎症细胞因子以及损伤或病原体相关分子模式（DAMPs或PAMPs）。

有趣的是，虽然NF-κB对B淋巴细胞生成是必需的，但由持续感染、组织损伤或衰老引起的炎症条件导致的NF-κB活性增加并不会增加B细胞产量。相反，这些条件与B细胞产量和库减少相关，因此导致对疫苗的反应性降低、对感染的易感性增加以及更高的死亡率。这表明NF-κB与B淋巴细胞生成之间存在复杂的非单调关系，值得进一步研究以了解衰老和慢性炎症条件如何影响B细胞发育。

NF-κB活性和激活动力学受三种"经典"IκB蛋白（IκBα、-β和-ε）控制，这些蛋白结合NF-κB二聚体并阻断其DNA结合活性；它们的丰度被IKK降低，IKK活性对PAMPs、组织DAMPs或炎症细胞因子有响应。因此，IκB蛋白的遗传缺陷模拟了NF-κB信号通路中的慢性炎症条件。有趣的是，NF-κB活性大幅增加会终止B淋巴细胞生成。IκBε和IκBα的缺失（导致胚胎致死）阻止胎儿肝细胞在过继移植嵌合体或体外分化成B或T系，而Nfkb2突变中升高的非经典NF-κB RelB:p52活性通过抑制Pax5表达，阻碍了从多能前前B细胞（fraction A）向早期前B细胞（fraction B）的转变，这是B细胞系的入口点。然而，NF-κB活性如何在B细胞分化途径中实际调控，以及其失调（可能由炎症条件引起）如何影响B细胞分化转变，尚未报道。

在此，我们利用荧光NF-κB cRel和RelA报告小鼠品系，揭示了健康小鼠早期B淋巴细胞生成过程中NF-κB的动态调控。有趣的是，在老年人群中，我们发现那些NF-κB动态控制减弱的个体比维持NF-κB动态的个体表现出更严重的B淋巴细胞减少症。一种新开发的可行至成年的复合IκB突变体证明了NF-κB的适当动态控制对B淋巴细胞生成是必需的。我们的分析表明，NF-κB动态确保了蛋白质稳态控制的正确性，使增殖和分化决策的阶段协调。当NF-κB动态失调时，不匹配的蛋白质稳态能量需求和线粒体能量供应导致过早的细胞状态转变和加速分化，跳过了增殖阶段和前BCR检查点。我们进一步表明，使用mTOR抑制剂雷帕霉素减少蛋白质产生可部分挽救NF-κB动态失调小鼠中B细胞发育缺陷。总之，这些结果确定了NF-κB的动态控制是淋巴细胞生成有序发育节奏的关键，以确保骨髓B细胞输出的健康数量和质量。

结果

NF-κB报告器揭示B淋巴细胞生成中的表达动态

为了表征早期B淋巴细胞生成过程中主要NF-κB转录激活蛋白RelA和cRel的表达，我们利用了最近生成的敲入mVenus-RelA和mTFP1-cRel小鼠品系和Hardy对特定B细胞发育祖细胞的分级（图S1）。在年轻健康小鼠中，我们发现fraction A阶段（前前B细胞）RelA表达高，然后在fractions B和C（前B细胞）显著下调；在fraction C′（大型前B细胞）细胞中表达增加，然后在fraction D（小型前B细胞）中再次下调；并在fraction E（未成熟B细胞）中第二次温和增加（图1A）。这种动态表达控制也适用于cRel，在fraction A到B的过程中表现出主要下调，在fraction C开始表达增加，然后在fraction C′达到峰值。

我们随后询问NF-κB表达是否在骨髓微环境中含有更高水平炎症细胞因子的老年小鼠中发生改变。我们使用双样本Kolmogorov-Smirnov检验的统计D值比较了年轻（12周）和老年（112周）小鼠中RelA蛋白动态（图1B）。由于长期衰老过程导致结果异质性，我们寻求区分RelA动态特别失调的个体和维持年轻小鼠中观察到动态的个体。为此，我们将老年个体分组以最小化双因素ANOVA结果在D值序列上的p值（图1B）。这种数据驱动、无偏见的分类确定了一些老年小鼠的RelA动态与年轻个体相似，而另一组显示出异常的RelA动态（图1C）。例如，在fractions B和C中，RelA表达在RelA动态失调的老年组中显著高于RelA动态正常的老年组（D = 0.18和0.32）。

我们随后检查了两组老年小鼠的早期B淋巴细胞生成输出。RelA动态正常的老年小鼠显示fractions D（1.98% ± 0.48%）和E（未成熟B细胞，1.21% ± 0.32%）细胞比例低于年轻小鼠（8.62% ± 0.66%和4.26% ± 0.31%）。然而，在RelA动态失调的老年小鼠中，这些细胞群体进一步减少（fraction D：0.26% ± 0.18%；fraction E：0.07% ± 0.04%）（图1D）。这些结果表明，失调的RelA表达动态与衰老过程中早期B淋巴细胞生成减弱相关。

NF-κB动态的遗传失调导致严重B淋巴细胞减少症

为了确定失调的RelA表达动态是否对B淋巴细胞生成减少负有因果责任，我们开发了一个NF-κB动态扰动的小鼠模型。三种IκB蛋白控制NF-κB活性的动态，从而通过自调控环控制RelA的表达；虽然纯合IκBα敲除是围产期致死的，但我们发现IκBα杂合性，即使与IκBβ和IκBε的纯合缺陷结合，也会产生可行、健康的小鼠。为了确定RelA表达动态是否在这种复合IκB突变体中受损，我们将它与mVenus-RelA报告小鼠杂交，产生Rela^V/+ IκB^-品系。免疫表型分析显示突变体中RelA动态控制丧失，我们在fraction B中发现RelA未能下调（图2A），在fraction C′中上调，在fraction D中再次下调。我们试图通过去除一个等位基因的Rela来恢复动态调控的部分方面，从而减弱自调控环。由此产生的RelA^V/- IκB^-小鼠品系确实恢复了fraction B中RelA的下调，并部分恢复了fraction C′中RelA的上调（图2A）。

为了表征NF-κB RelA动态失调对早期B淋巴细胞生成的生理后果，我们量化了每个fraction中的细胞频率（图2B）。我们发现Rela^V/+ IκB^-小鼠中fraction C和C′群体的比例严重减少（fraction C：0.014% ± 0.002%对0.36% ± 0.06%；fraction C′：0.004% ± 0.001%对0.33% ± 0.03%），后续fraction D前B细胞频率也显著降低（0.63% ± 0.11%对10.2% ± 0.7%），连同fraction E（0.19% ± 0.02%对3.8% ± 0.3%），而fraction A和B群体基本保持完整，与对照组无显著差异。Rela的杂合性提供了这些表型的部分恢复。

总体而言，突变Rela^V/+ IκB^-小鼠骨髓中的B系群体组成1.87 ± 0.31×10^6个细胞，而对照Rela^V/+小鼠为12.5 ± 1.1×10^6个细胞。在突变体中，早期B细胞祖细胞（B220^+IgM^-IgD^-，91.1% ± 1.5%）的比例与对照（62.0% ± 1.8%）相比增加，而晚期B细胞前体显著减少（B220^+IgM^+，6.82% ± 1.33%对Rela^V/+中的31.5% ± 1.6%）（图2C）。Rela的杂合性部分恢复了B系群体数量（6.05 ± 0.62×10^6个细胞）和晚期前体及早期祖细胞的比例（45.2% ± 8.0%和50.2% ± 8.5%，分别）。

我们还生成了IκB^- cRel^-突变小鼠系，发现这些小鼠恢复了它们的晚期B细胞前体（B220^+IgM^+，28.47% ± 1.76%对IκB^-中的5.55% ± 3.63%），以及它们的fraction C（0.27% ± 0.12%对0.01% ± 0.01%）和C′（0.45% ± 0.10%对0.003% ± 0.001%）细胞（图S2A和S2B）。这些结果表明，IκB^- NF-κB动态控制突变体在前B细胞阶段后具有发育缺陷，与在NF-κB动态失调的老年小鼠队列中观察到的类似，但更为严重。

调查外周血（图2D）和脾脏（图2E）中的B细胞群体显示出NF-κB动态突变体中显著缺陷。虽然B系群体（B220^+CD19^+）在Rela^V/+对照小鼠外周血白细胞中占64.4% ± 0.7%，但在Rela^V/+ IκB^-小鼠中仅占0.11% ± 0.05%，而在Rela^V/- IκB^-小鼠中占8.04% ± 3.32%（图2D），在IκB^- cRel^-小鼠中为25.94% ± 8.07%（图S2C）。同样，在脾脏中，Rela^V/+对照小鼠脾细胞中44.3% ± 1.3%为B系（B220^+CD19^+），但Rela^V/+ IκB^-小鼠中仅为0.51% ± 0.24%，而Rela^V/- IκB^-小鼠中为37.2% ± 5.0%。脾脏的组织学切片和免疫组织化学（IHC）染色显示Rela^V/+和Rela^V/+ IκB^-小鼠脾脏结构破坏，滤泡结构数量减少，红髓增加（图2F，H&E染色，左）。此外，Rela^V/+ IκB^-脾脏中的单个滤泡显示出大型生发中心细胞和小型淋巴细胞的正常分布中断，且B细胞耗竭的滤泡结构主要由T细胞组成（图2F，IHC染色，中和右）。我们更详细地检查了脾脏中的少数B细胞，发现基本上没有IgD阳性（图S2D），IgM表达降低（图S2E）。这两种现象已被描述为人类衰老中B细胞的特征。

由于NF-κB动态失调导致脾脏和循环B细胞的减少比骨髓输出更为显著，我们还调查了过渡性B细胞池。NF-κB对脾脏中过渡性B细胞的存活和成熟至关重要，然而在这个NF-κB超活化突变体中，我们发现过渡性B细胞的总数量大幅减少（图S2F），这在T1（CD93^+CD23^-IgM^+）和T2（CD93^+CD23^+IgM^+）群体中均很明显（图S2G）。然而，更仔细的观察显示T1与T2 B细胞的相对比例颠倒了（图S2H和S2I）。这很有趣，因为逃避骨髓阴性选择的自身反应性B细胞在脾脏耐受监测机制中于T1阶段通过克隆删除。

总之，这些数据表明NF-κB动态失调导致两个可能不同的缺陷：骨髓未成熟B细胞输出减少20倍（Rela^V/+ IκB^-小鼠中0.17% ± 0.05%对Rela^V/+小鼠中的3.61% ± 0.41%），以及骨髓外进一步减少，由脾脏和循环B细胞的>100倍减少所证明。

NF-κB动态内在造血前体控制早期B淋巴细胞生成

先前研究表明，老年小鼠中B细胞发育缺陷是由于微环境变化，这可能会损害前体中的NF-κB动态。因此，我们询问NF-κB失调状态中B淋巴细胞减少症表型是否是造血细胞内在的。为此，我们将具有失调NF-κB的供体骨髓细胞（IκB^-）移植到对照受体小鼠（野生型[WT]）中，反之亦然，并监测外周血中主要白细胞系在移植后6、8、12和15周的情况。我们发现造血"细胞内在"实验组（IκB^-到WT）在所有时间点上B淋巴系比例降低（1.44% ± 0.30%、0.76% ± 0.17%、1.40% ± 0.14%和0.63% ± 0.09%），与对照组（WT到WT，65.1% ± 3.7%、62.1% ± 1.8%、56.8% ± 9.7%和49.4% ± 3.0%）相比，但T淋巴系无显著差异（图S3A）。相比之下，造血"细胞外在"实验组（WT到IκB^-）中外周血系比例与对照相比仅有轻微变化（图S3B）。因此，IκB^-小鼠中观察到的严重B淋巴细胞减少症是由细胞内在NF-κB失调驱动的。

我们随后调查了这些嵌合小鼠骨髓中B细胞前体群体（图S3C）。细胞内在组中B细胞前体的相对和绝对量化显示fractions C（0.021% ± 0.007%对对照中0.064% ± 0.007%）、C′（0.012% ± 0.004%对0.13% ± 0.02%）、D（0.73% ± 0.28%对3.63% ± 0.03%）和E（0.40% ± 0.18%对1.69% ± 0.08%）减少，但fractions A和B未减少（图S3D）。绝对细胞数量的量化证实了缺陷（图S3E）。这些前体群体的变化与原生IκB^-小鼠骨髓表型相似。另一方面，造血细胞外在实验组（WT到IκB^-）中骨髓B细胞前体比例（图S3F）、百分比（图S3G）和细胞数量（图S3H）并未重现IκB^-小鼠的原生表型。

总之，这些结果支持以下结论：造血细胞内NF-κB动态的失调，这可能由与衰老相关的骨髓微环境变化驱动，破坏了B淋巴细胞生成，导致（1）造血B细胞输出减少和（2）脾脏和循环B细胞数量的进一步减少。

模型辅助分析体内前体群体动力学

我们随后询问哪种失调的细胞命运决定导致骨髓B细胞输出减少。通常考虑发育缺陷的三个原因：分化阻滞、祖细胞存活损失或细胞分裂率降低。在IκB^-小鼠骨髓中，我们未观察到fraction B中细胞累积（图2B），这表明fraction C和C′群体减少并非由于分化阻滞。此外，Annexin V染色表明fraction C中凋亡细胞百分比未增加（1.2% ± 0.3%对比WT小鼠中1.6% ± 0.2%），而在fraction C′中，凋亡细胞比例实际上降低（1.1% ± 0.4%对比WT小鼠中4.6% ± 0.6%；图S4A和S4B），反对细胞存活机制损失。为了确定B细胞前体和前体群体的增殖率是否受NF-κB失调影响，我们使用了体内溴脱氧尿苷（BrdU）标记，该标记识别含有新复制DNA的细胞。这些实验证实了预期的在fractions B和特别是C′中的高增殖活性，但显示它们在NF-κB动态突变体中的增殖活性未降低；事实上，fraction C中BrdU阳性细胞比例与对照相比增加（图S4C和S4D）。这些结果表明，这些常见的细胞生物学解释均无法解释IκB^-骨髓中的B淋巴系发育表型。

我们随后转向无偏见方法来解释表型，通过数学建模B细胞发育途径并定量拟合前体群体数据。为此，我们制定了一个描述早期B淋巴系祖细胞通过五个分化转变发育进展的区室模型（图3A）。为了拟合模型，我们测量了WT和IκB^-小鼠骨髓中每个前体细胞群体的绝对数量（图3B）。值得注意的是，绝对细胞计数显示WT和IκB^-小鼠在fraction C上相差31倍，在fraction C′上相差100倍，在fraction D上相差18倍。

假设分化途径处于稳态，我们拟合了给定定量群体数据和基于BrdU细胞增殖和Annexin V细胞死亡测量的群体增长率的分化转变率（表S1）。当fraction C到C′和fraction C′到D的分化率在WT中为11.0 ± 3.9和11.6 ± 0.8，在IκB^-中为227.5 ± 59.5和556.6 ± 64.8时，这些数据可用模型解释，表明IκB^-小鼠中fraction C到D的转变显著加速。Rela杂合性可部分恢复正常速率（图3C）。使用从WT和IκB^-数据推导的参数，我们计算了每个前体阶段的相对细胞输出流。我们发现IκB^-小鼠预计从fractions D和E输出的细胞流显著减少（图3D）。当模型拟合到NF-κB动态失调但不正常的衰老小鼠数据时，也出现了相同的结论（图3E）。考虑到BrdU和Annexin V测量仅提供相对群体增长率的半定量评估，我们检查了建模结果是否依赖于这些速率。当将增长率设为较少细胞阶段特异性或甚至均匀值时，模型拟合一致地导致更高的fraction-C到C′到D转变率和突变体中减少的输出细胞流（图S5）。

淋巴细胞生成途径定量群体测量的模型辅助解释表明，IκB^-小鼠中B细胞输出减少的最佳解释是加速的分化率，导致跳过发育途径中的关键增殖阶段（fraction C/C′）。

体外分化证实加速分化表型

为了检验模型对分化率的推断，我们转向体外分化实验系统，该系统具有纯化的共同淋巴系祖细胞（CLPs）定义的分化起点（图4A）。当接种500个CLPs时，5天后可测量超过10,000个细胞，允许进行流式细胞术分析；我们发现fraction C/C′细胞在IκB^-培养物中占B系细胞的26.2% ± 4.8%，在WT培养物中占64.2% ± 4.4%，类似于IκB^-原生骨髓中fraction C/C′群体的减少（图4B与图2B比较）。然而，在这一早期时间点，我们发现IκB^-培养物中fraction D细胞比例显著高于WT培养物（8.5% ± 1.7%对1.5% ± 0.6%）。然而，在培养第7天，IκB^-细胞中fraction D细胞比例低于WT对照（4.8% ± 0.4%对7.7% ± 1.1%；图4C和4D）。这些数据表明IκB^-突变培养物比对照更快地生成fraction D细胞，如第5天所见，对照在第7天赶上。这一发现表明NF-κB动态失调导致从fraction B到D的加速分化转变，证实了数学模型对体内B细胞发育数据的解释。然而，表型的定量程度显著低于体内观察到的，反映了体外分化系统的低效率。

单细胞RNA测序分析揭示转录组状态的过早进展

为了寻找加速分化表型的分子证据，我们对B细胞前体（通过流式细胞术分选的CD49b^-Ter119^-CD3^-F4/80^-Gr-1^-B220^+IgD^-IgM^-群体）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。在通过Scrublet和DoubletDetection排除潜在双胞胎后，我们使用Cell Ranger流程分析数据。k-均值聚类WT和IκB^-转录组数据确定了五个相关细胞簇和一个离群簇，可能包含残留双胞胎。我们基于标识基因的相对表达水平，将五个簇映射到WT中可能的发育B细胞Hardy fractions A-D（图S6A），使用Gene Expression Commons的参考数据。使用ICGS v.2软件独立分析验证了这些相同细胞群体（DoubletDecon后）。

通过在高维转录组状态的前两个主成分中可视化细胞，我们可以追踪发育阶段从fractions A到D的预期序列（图5A）。IκB^-单细胞数据在主成分空间中类似定位，但我们发现fraction B中的细胞不仅占据WT fraction B细胞的区域，还延伸到WT fraction C和C′细胞所在区域。虽然在WT中，通过流式细胞术定义的B细胞前体频率与通过转录组状态定义的簇大小一致，但在IκB^-样品中我们发现显著差异。尽管在IκB^-中，Hardy fraction B构成超过50%的前体（鉴于fraction C、C′和D细胞稀缺），但转录组簇B中的细胞数量减少，有利于簇C和C′中的细胞；簇D的大小与fraction D相似（图5B）。这些结果通过第二种生物信息学工具cellHarmony（ICGS工作流程）得到确认。不同调控基因的Z评分表达值的热图表明，IκB^-小鼠中的fraction B包括与WT簇C/C′相关的转录组特征（图5C）。这些结果表明，在IκB^-小鼠中，通过细胞表面标志物定义为fraction B的前体已过早进入后续发育阶段的转录组状态。

接下来，我们询问在老年WT小鼠中是否可以识别出类似的分化异常。为此，我们生成了100周龄小鼠B前体的scRNA-seq数据。检查标记基因的表达，我们还在这里发现fraction C标记基因开始出现在fraction B中（图S6B）。为了比较分化，我们训练了随机森林机器学习分类器，该分类器在k-均值聚类WT数据集上定义了与健康发育转变相关的转录组状态。我们发现，无论SGD模型是在"标记基因"还是"所有基因"数据上训练的，Cell Ranger分析中细胞分类频率的结果都相似（图5B）。然后，我们使用这些WT数据集训练的模型来调查差异是否不仅在IκB^-数据集中导致细胞分类错误，而且在老年WT（100周龄）数据集中也是如此。我们发现，"所有基因"和"标记基因"模型预测都将更多簇C细胞在IκB^-中而不是WT中分类错误，将它们放置到簇C′和D中（图5D）。值得注意的是，老年WT数据集的分类显示出类似但较不严重的混淆。例如，簇C′细胞在IκB^-和老年WT数据集中经常被错误分类为簇B。作为替代，我们应用了轨迹分析，并发现虽然分化轨迹确实未改变（图S6C），但RNA速度计算表明老年WT和IκB^-突变体中的分化高于年轻WT（图S6D）。这些结果支持IκB^-突变体是inflammaged WT小鼠的严重模型系统，且B前体的加速分化转变导致与年龄相关的B淋巴细胞生成缺陷。

NF-κB在fraction B中未能下调破坏蛋白质稳态

为了研究过早分化转变的潜在分子机制，我们对每个簇中的WT和IκB^-细胞进行了差异基因表达分析。我们发现簇B、C和C′在IκB^-中显示出大量基因上调（图6A），其中许多在调控区域含有NF-κB/RelA和下游IRF结合基序（图6B）。同样，我们发现一组NF-κB靶基因在老年小鼠scRNA-seq数据中更可能增加而非减少（图S6E），如B2m、Cd69和Tap1所示（图S6F）。然而，scRNA-seq提供相对于文库大小的基因表达值，如IκB^-细胞中下调基因数量几乎同样大所示。为了确定fraction B中未能下调NF-κB是否导致每个细胞更多基因转录，我们将约204,000个WT和IκB^- fraction A-B细胞分选，并在添加10 ng酵母RNA每100,000个细胞作为内部对照后进行批量RNA-seq。这允许我们量化每个细胞的总转录本，揭示IκB^-前体的RNA含量比WT对照高2.3倍（图6C）。mRNA含量增加涉及绝大多数基因（图6D），虽然前5%上调的转录本编码淋巴细胞激活和细胞应激反应的标志（由NF-κB驱动），但中等5%区段编码细胞代谢过程的基因（图6E）。mRNA含量的大幅增加促使我们更仔细地检查fraction B前体的细胞大小。前向散射面积（FSC-A）显示整体增加，IκB^-小鼠中大细胞（定义为>10^5 FSC单位）频率更高（图6F）。

与蛋白质合成相关的上调基因燃料更高速率的蛋白质合成，这是细胞最耗能的过程。我们使用嘌呤霉素掺入测定量化了翻译速率，首先表征了WT B细胞前体发育中蛋白质合成如何调控。我们发现翻译速率从fraction A到B到C下调，然后在fraction C′中大幅上调（图6G）。这与fraction C′细胞是增殖性和代谢高度活跃一致。然后，我们将嘌呤霉素掺入测定应用于测量IκB^-的翻译，重点关注fractions A和B。我们发现IκB^- fraction A中翻译速率略有增加，fraction B中大幅增加（图6H），这在统计学上显著（图6I），并在IκB^- cRel^-救援突变体中完全逆转（图S6G-S6I）。

鉴于与蛋白质合成相关的能量消耗增加，我们随后测试了IκB^- B前体细胞的代谢活性。有趣的是，我们发现IκB^- fraction A-C′富集的前体B细胞具有增加的氧气消耗率（OCRs）（图6J），包括基础和最大OCR的显著增加（图6K）。这种能量产生的增加并非由于线粒体质量的整体增加，如通过用MitoTracker Green（MTG）染色WT和IκB^-前体B细胞所揭示（图6L）。

为了测试我们对这些结果的解释，我们推断如果减少蛋白质产生率，我们可能会恢复部分加速分化表型。为此，我们使用了mTOR抑制剂雷帕霉素，它可以降低翻译速率。在饮用水中提供雷帕霉素7天导致fraction C/C′细胞数量统计学显著增加（图6M和6N）。它还导致脾脏B细胞小幅增加（图6O和6P），表明局部在脾脏的第二个表型未被拯救。

总之，这些结果表明，fraction B前体中未能动态控制和下调NF-κB导致不适当的基因表达和翻译速率增加。反过来，细胞通过提升线粒体活性而无增加线粒体质量来响应增加的能量需求。值得注意的是，骨髓中fraction C/C′缺陷可以通过雷帕霉素给药得到改善。我们得出结论，NF-κB动态控制对于确保蛋白质稳态与其后续能量需求和供应的协调至关重要，使前体能够响应促增殖线索并在增殖C′阶段保持足够长时间，以产生健康的骨髓B细胞输出。

RelA失调绕过前BCR发育检查点

接下来，我们解决了第二个表型：尽管IκB^-小鼠仍产生约5%的未成熟B细胞（与WT相比），但它们在外周显示<1%的B细胞含量。已知IgH重排检查点对于通过要求前BCR信号活性实现从fraction C′到D的转变至关重要，以确保功能性BCR的生成。为了评估免疫球蛋白重排和表达，我们使用scRNA-seq分析进行免疫组库分析。为了定量评估免疫球蛋白表达的差异，我们在主成分分析（PCA）空间中绘制了每个细胞的IgH和免疫球蛋白轻链表达（图7A）。我们发现，虽然在健康WT对照中fraction B后大多数B前体为IgH阳性，但在IκB^-突变体中很少有，尽管许多为轻链阳性（图7B）。

我们对老年小鼠（100周）的scRNA-seq数据重复了分析，并量化了每个簇中表达IgH或免疫球蛋白轻链的细胞百分比。值得注意的是，我们发现在老年相比年轻WT小鼠的任何簇中表达IgH的细胞更少（簇B，68%对80%；簇C，25%对36%；和簇D：53%对65%）（图7C），但在簇D中表达仅Igκ而无IgH的细胞更多（4.7%对1.8%）。因此，我们对老年WT小鼠的分析表明缺陷类似于在IκB^-突变体中严重的缺陷。我们随后通过门控CD19^+B220^+细胞到IgM^-、IgM^lo和IgM^hi区室来评估脾脏B细胞中的轻链表达，因为轻链表面表达需要重链。如预期，IgM^-细胞在WT或IκB^-小鼠中均不表达λ轻链（图S7A和S7B）。然而，在IgM^lo和IgM^hi群体中，IκB^-突变体显示λ表达增加（图S7A和S7B）。然后，我们使用相同的IgM基于CD19^+B220^+细胞的门控评估脾脏B细胞中的κ轻链表达。在IκB^-突变体中，κ表达仅在IgM表达细胞中检测到，而在WT小鼠中，它可以与其他类别转换的IgH配对（图S7C和S7D）。

为了了解fraction C′细胞如何绕过前BCR检查点，我们检查了scRNA-seq数据集中的存活相关基因表达。来自fraction C/C′的细胞显示抗凋亡基因（包括Birc3和Mcl1）表达升高，但Rag1和Rag2表达差异最小（图S7E），表明细胞能够重排但未被选择进行重排。在老年小鼠scRNA-seq数据中观察到类似的表达模式（图S7F）。

总之，这些结果表明，与年龄和炎症相关的NF-κB动态失调导致簇B中NF-κB/RelA活性升高，从而绕过前BCR检查点，允许前体在成功完成IgH重排前进行Igκ重排和分化。因此，NF-κB动态失调不仅减少了骨髓B细胞输出的数量，还降低了产生的少数小型前B细胞的质量；事实上，大多数不含功能性BCR，这解释了为什么如此少的B细胞能够定植外周。

讨论

鉴于与年龄相关的炎症和骨髓B细胞输出下降之间的联系，我们在此研究了NF-κB调控在B细胞淋巴细胞生成中的作用。使用敲入报告小鼠，我们揭示了年轻小鼠B淋巴细胞生成途径中NF-κB控制的动态性质，并观察到它在老年小鼠中如何失调。NF-κB动态的实验遗传失调在许多方面模拟了inflammaged小鼠的造血失调（表S1）。总之，它导致严重淋巴细胞减少症，有两个潜在原因。首先，前B细胞阶段中不适当的基因表达增加破坏了蛋白质稳态，导致前体细胞放弃增殖程序而转向下一发育阶段，从而减少前B细胞的总体产生。其次，过量的NF-κB活性使前BCR检查点失效，允许B细胞在没有功能性BCR的情况下发育，尽管已知这些B细胞在外周具有显著受损的存活和功能。重要的是，这两种表型在老年小鼠中均被观察到，表明这两种机制有助于与inflammaging相关的B细胞体液免疫受损。

我们的数据显示，骨髓B细胞输出的定量减少并非由于存活缺陷、分化阻滞或实际细胞增殖率的缺陷。相反，更少的细胞处于fraction C′的增殖阶段，因为进入该阶段的细胞停留时间较短，降低了它们扩增群体的能力。事实上，scRNA-seq分析显示加速转变从fraction B开始，细胞获得RNA转录组特征C、C′和D，而蛋白质细胞表面标志物跟不上。虽然这可能是发育缺陷由于分化高功能的第一个报告，相反的情况已在各种恶性肿瘤中描述：例如，从前B细胞（fraction B）的分化途径进展失败导致前B急性淋巴细胞白血病（pro-B ALL），或共同髓系祖细胞（CMP）或粒细胞单核细胞祖细胞（GMP）中停留时间增加会导致骨髓增生异常综合征（MDSs），并可能导致恶性转化。事实上，正在开发旨在恢复分化转变至较少增殖发育阶段的治疗策略。

鉴于停留时间的重要性，特别是在增殖阶段，什么可能决定阶段之间的转变率，为什么它们在IκB突变体中加速？我们的研究表明，蛋白质稳态和相关能量平衡是B淋巴细胞生成途径内阶段转变的关键决定因素。事实上，从fraction C′（大型前BII细胞）到D（小型前BII细胞）的转变涉及代谢状态从可维持细胞增殖的活跃能量产生转变为由AMP活化激酶（AMPK）信号感知的更静止状态。AMPK信号激活导致糖酵解和氧化磷酸化减少以及mTORC1信号抑制。在NF-κB动态突变体中，我们不仅在fraction A和B细胞中观察到增加的蛋白质翻译速率，还发现有氧和无氧代谢活性均增加。这留下很少的剩余能量容量，也可能导致有毒代谢副产物阻碍在fraction C′中维持特征性增殖程序。另一方面，通常由c-Myc或mTOR突变体的功能获得驱动的代谢活性丰富，可能会阻碍癌变中进入后续增殖阶段的分化转变。在这里，我们通过使用mTOR抑制剂和抗衰老预防剂雷帕霉素减少翻译速率来部分拯救加速分化过程，以恢复蛋白质稳态。

受损的未成熟B细胞质量也似乎归因于免疫球蛋白重链和轻链的不协调重排。我们的scRNA-seq免疫球蛋白谱分析显示，NF-κB动态突变体中的许多细胞在成功重排IgH前表达Igκ。在正常B淋巴细胞生成中，κ轻链基因重排受前BCR信号调控，需要适当重排和表达IgH基因，与其他介质如PU.1和IRFs合作。由于PU.1和IRFs基序在IκB^-小鼠发育簇中前簇C′上调的基因调控区域富集，且PU.1可及性在IκB^-造血干细胞（HSCs）中显著增加，这些转录因子活性与NF-κB一起，可能为κ轻链基因片段提供过早重排酶活性的可及性。有趣的是，胎儿B-1细胞发育同样不遵循经典的重链然后κ轻链重排序列，在前B细胞阶段κ轻链的重排可以绕过前BCR检查点。由于B-1细胞上的BCR以其自身反应性而闻名，我们在NF-κB动态突变体中发现的不协调重排可能为为什么衰老与自身反应性抗体产生在自身免疫疾病中相关提供潜在解释。至少，通过NF-κB动态失调绕过前BCR检查点降低了骨髓B细胞输出的质量，并阻碍了外周淋巴组织中进一步的B细胞成熟，这依赖于功能性BCR。

我们的研究揭示了NF-κB的动态调控是健康、适当分期B淋巴细胞生成的标志。与在巨噬细胞和成纤维细胞中在小时尺度上控制刺激响应基因表达并在健康个体之间区分刺激的同时保持表观基因组完整性的NF-κB RelA由IκBα的动态控制不同，B前体中RelA和cRel的动态控制发生在日尺度上，通过所有经典IκBs的综合功能实现，并在细胞通过前体阶段转变时保持蛋白质稳态的完整性。虽然新揭示的与年龄和炎症相关的B淋巴细胞减少症的潜在机制具有切实的临床意义，但这些发现还表明，单一细胞类型中信号调节因子的快照测定可能不足以识别有风险个体，但连续前体阶段的比较在诊断上是有信息的。

研究局限性

本研究的关键发现是（1）主要NF-κB转录激活蛋白RelA和cRel在健康B淋巴细胞生成过程中动态表达；（2）显示动态表达丧失（因此fraction B中不适当高的表达）的老年小鼠比具有更多NF-κB动态的年龄匹配小鼠表现出更严重的B淋巴细胞生成缺陷；以及（3）NF-κB动态控制的遗传扰动导致年轻小鼠中严重的B淋巴细胞生成缺陷。虽然NF-κB动态突变小鼠似乎在许多不同的细胞和分子测定中模拟了老年WT小鼠，但我们尚未能够在受影响的老年小鼠中恢复NF-κB动态以确定它是否恢复表型。换句话说，我们已经证明NF-κB动态失调足以在年轻小鼠中导致严重的B淋巴细胞生成缺陷，但我们尚未证明NF-κB动态失调对老年小鼠中严重B淋巴细胞生成缺陷是必需的。此外，虽然我们已经确定加速分化导致B细胞输出数量和质量减少，并且这与更高蛋白质产生的相关，但我们尚未证明蛋白质产生的减少抑制表型。雷帕霉素mTOR抑制剂治疗仅产生部分拯救。最后，这些发现是否适用于显示慢性炎症迹象的老年人类B淋巴细胞生成，仍有待在未来研究中确定。