特应性皮炎（AD）是一种与皮肤微生物群失调相关的慢性炎症性皮肤病，其特征为皮肤屏障功能受损、免疫失调和微生物组改变，受遗传和环境因素共同影响。临床特征包括瘙痒、干燥和湿疹样病变[1,2,3]。AD的发病机制复杂且多因素影响。许多患者存在FLG基因的遗传缺陷，该基因编码丝聚蛋白——一种对维持皮肤屏障完整性至关重要的蛋白质。屏障功能障碍促进过敏原和刺激物进入，触发过度的Th2免疫反应和炎症细胞因子过度产生，从而持续慢性炎症并加剧症状[1,2,4]。
根据WHO全球疾病负担倡议，估计AD影响全球2.3亿人，是皮肤疾病中非致命性疾病负担的主要原因。AD是全球最常见的慢性疾病之一，也是发达国家最常见的炎症性皮肤病，影响所有种族的儿童和成人、男性和女性，且常与其他特应性疾病家族史相关[5]。近几十年来，AD患病率在发达国家尤其增加，现已成为重大的全球健康挑战。AD与高医疗成本、显著发病率和生活质量下降相关[1,2,6]。其影响不仅限于身体症状，常导致睡眠障碍、焦虑、抑郁以及与可见皮肤病变和污名相关的社交困难[1,4]。
越来越多的证据强调皮肤微生物群在AD发病和进展中的作用[7,8]。在健康个体中，微生物群多样且稳定，有助于免疫功能并占据生态位，否则这些生态位可能被病原体定植[7,9]。相反，AD患者通常表现出皮肤微生物群失调，特征为微生物多样性显著降低和致病菌过度增殖，尤其在疾病发作期间[8,9]。其中，正常情况下在健康皮肤上少量存在的金黄色葡萄球菌（S. aureus）在AD患者中过度增殖，定植于病变和非病变区域。金黄色葡萄球菌产生毒力因子，破坏皮肤屏障并驱动炎症[9,10,11]。此外，金黄色葡萄球菌可形成生物膜——附着于表面的结构化细菌群落，抵抗免疫反应，从而加剧皮肤屏障功能障碍并维持炎症。金黄色葡萄球菌生物膜的形成直接与AD症状恶化相关[10,11]。
尽管金黄色葡萄球菌是AD的主要致病菌，但表皮葡萄球菌（S. epidermidis）——一种常见的共生细菌，也发挥着双重作用。在正常健康皮肤条件下，表皮葡萄球菌通过抑制金黄色葡萄球菌来帮助保护皮肤[7]。然而，在AD中，表皮葡萄球菌可能过度增殖。虽然它有时可以减少金黄色葡萄球菌的定植，但过量的表皮葡萄球菌可能通过过度产生酚溶性调节素促进炎症，类似于金黄色葡萄球菌驱动的作用[7]。在AD发作期间观察到的表皮葡萄球菌增加可能代表对金黄色葡萄球菌定植的代偿性反应，反映了复杂的微生物动态变化，其中平衡的转变导致疾病[7,8,10]。因此，恢复微生物平衡是AD管理的重要治疗目标[8]。
啤酒花（Humulus lupulus）是一种属于大麻科葎草属的多年生攀援植物，广泛用于酿酒以赋予啤酒苦味和平衡风味。除此之外，啤酒花长期以来在传统医学中因其抗炎、抗氧化和抗菌特性而受到重视[12,13,14,15,16]。啤酒花富含生物活性化合物，如忽木酮、蛇麻酮和黄腐酚。啤酒花提取物丰富的生物活性成分使其成为针对皮肤疾病的治疗和化妆品配方的有价值候选物[14]。
啤酒花广泛的生物活性源于其丰富的植物化学组成，特别是苦味酸和异戊二烯类黄酮，如忽木酮（α-酸）、蛇麻酮（β-酸）和黄腐酚[12,13,17,18]。黄腐酚因其强大的抗氧化、抗炎和抗菌特性而备受关注[13]。忽木酮、蛇麻酮和黄腐酚共同显示出对革兰氏阳性菌的有效抗菌活性，包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，主要通过破坏细菌细胞膜[15,16,18]。此外，这些啤酒花来源的化合物表现出显著的抗生物膜活性，抑制和减少葡萄球菌属（包括甲氧西林敏感和耐甲氧西林菌株）的生物膜形成[16,17]。
精酿啤酒酿造过程中产生大量残留物，包括废弃的酒花渣，这些通常未得到充分利用[19]。这些残留物保留了相当数量的有价值的生物活性化合物，如多酚（包括黄腐酚）、脂质和精油，在酿造过程中未被完全提取（即融入啤酒中）[14,19]。回收和评估这些化合物支持循环经济方法，特别是将工业副产品转化为高价值成分，用于化妆品和制药等细分领域[12,14,17,19]。该战略不仅解决了废物管理挑战，还为开发新的皮肤疾病治疗方法提供了经济高效且环保的天然成分来源[15,19]。评估这些被忽视的资源代表着向更可持续的工业实践以及创造创新、天然衍生的健康和福祉解决方案迈出的重要一步[20,21]。
本研究旨在体外评估从精酿啤酒工业干投酒花渣中获得的啤酒花提取物对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌（两者均与特应性皮炎相关）的抗菌潜力。总体目标是确定啤酒花提取物是否能调节皮肤微生物组并帮助恢复微生物平衡，从而为AD管理提供一种新颖、天然衍生且可持续的策略。
- 材料与方法
2.1. 啤酒花提取物的制备与表征
按照美国酿造化学家协会和欧洲酿造公约描述的程序，通过固液萃取使用有机溶剂或溶剂-水混合物进行"软"树脂的提取。所得的提取物随后使用各种分析技术进行分析。提取和表征按照Schindler等人（2019）和ASBC标准协议Hops-14（美国酿造化学家协会，2022）描述的方法进行[22,23]。
本研究中使用的样品于2024年4月22日在Cervejaria Letra（葡萄牙Vila Verde）收集。它们由印度淡色艾尔啤酒生产（Letra F，批次号L23/2024）的干投酒花阶段产生的酒花渣组成。该啤酒使用三种啤酒花品种酿造：Cascade（在旋流池阶段添加）、Mosaic和Citra（在干投阶段添加），均购自Yakima Chief Hops（美国华盛顿州Yakima）。酿酒厂仅提供每个阶段使用的啤酒花品种信息。由于商业保密，干投阶段使用的啤酒花比例未公开。
收集后，使用Gyrozen离心机以17168×g离心酒花渣（固体干投残留物）。回收的固体部分在-20°C下冷冻，直至进一步处理。对于固液萃取，将解冻的酒花渣与96%（v/v）乙醇水溶液以1:1湿固-溶剂比例混合，并在混合挤出机中处理以提高提取效率。选择96%（v/v）乙醇作为提取溶剂，因其对啤酒花α-和β-酸以及异戊二烯类黄酮（如黄腐酚）具有高溶解效率，同时保持食品级相容性、低毒性，并适用于潜在的制药或化妆品应用。少量的水部分（4%）不仅增强了溶剂极性，还促进了乙醇与湿生物质的混合，有助于提取中等极性化合物，同时不显著损害疏水性树脂的回收。
提取后，将液相与固体残留物分离，用于表征研究和后续的微生物学测定。
使用配备Waters UV-Vis检测器和C18柱的Waters高效液相色谱仪进行液相部分的色谱分析。整个分析过程中柱温保持在28°C。流动相流速为0.8 mL/min，进样量为10 µL，总运行时间为40分钟。检测波长为314 nm，适用于啤酒花来源的苦味酸和异戊二烯类黄酮。
流动相由（A）甲醇:0.17%甲酸水溶液（85:15，v/v）和（B）超纯水组成。梯度程序如下：100% A（0–7.99分钟）；90% A和10% B（8–12.99分钟）；100% A（13–40分钟）。所有提取物以1 mg/mL的浓度注入，用甲醇稀释制备。样品经涡旋并通过PTFE注射器过滤器过滤到琥珀色玻璃HPLC小瓶中。
每个提取物的表征研究进行两次重复，在提取重复的初始筛选之后进行。
2.2. 微生物质量评估
根据欧洲药典第10版2.6.12专论，使用倾注平板法评估提取物的微生物质量[24]，并适应样品体积。简言之，将1 mL用蛋白胨水制备的样品稀释液加入9 cm培养皿中，并混入液化了的胰酪大豆琼脂（适用于细菌培养）或沙氏葡萄糖琼脂（适用于真菌培养）中，温度≤45°C。对于每种培养基，制备两个培养皿。平板在30–35°C（细菌）和20–25°C（真菌）下培养五天。接受标准基于欧洲药典第10版5.1.4专论（非无菌剂型的微生物质量——皮肤使用）。
2.3. 最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定
采用肉汤微量稀释法并稍作修改，测定提取物对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度。在Mueller-Hinton肉汤中制备新鲜细菌培养物，并调整至0.5麦氏比浊标准。将细菌悬浮液在MHB中稀释，使96孔微孔板每孔终浓度约为5×10^5 CFU/mL。
将提取物溶于DMSO，并在无菌MHB中制备终浓度为0.033 mg/mL的储备液。在MHB中制备提取物的六个系列二倍稀释液。每孔加入100 µL细菌悬浮液和100 µL提取物稀释液。对照孔包括：（i）仅含培养基和细菌接种物的阳性生长对照，（ii）含培养基和提取物的阴性对照，以及（iii）含5% DMSO的培养基（无提取物）的溶剂对照。平板在37°C孵育24小时。
MIC定义为肉眼观察可见抑制细菌生长的最低提取物浓度。分析上，通过使用酶标仪测量光密度（600 nm吸光度）确认MIC。MIC对应吸光度与生长对照相比无显著增加的最低提取物浓度。
为测定最低杀菌浓度，从每孔取10 µL等分试样涂布于TSA平板上，在37°C孵育24小时。MLC定义为未见细菌生长的最低提取物浓度。
2.4. 生物膜形成与破坏实验
使用结晶紫染色法评估提取物对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜形成和破坏的影响。
在胰酪大豆肉汤中制备细菌悬浮液，并调整至0.5麦氏标准。将悬浮液接种到96孔微孔板中，在37°C孵育24小时以形成生物膜。
（a）预防实验：提取物与细菌悬浮液同时加入96孔微孔板，浓度为1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2× MIC和5× MIC。将平板在37°C孵育24小时，使生物膜在提取物存在下形成。
（b）破坏实验：首先将细菌悬浮液在37°C下孵育24小时建立生物膜。然后加入含有提取物（1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2× MIC、2.4. 生物膜形成与破坏实验
使用结晶紫染色法评估提取物对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜形成和破坏的影响。
在胰酪大豆肉汤中制备细菌悬浮液，并调整至0.5麦氏标准。将悬浮液接种到96孔微孔板中，在37°C孵育24小时以形成生物膜。
（a）预防实验：提取物与细菌悬浮液同时加入96孔微孔板，浓度为1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2× MIC和5× MIC。平板在37°C孵育24小时，使生物膜在提取物存在下形成。
（b）破坏实验：首先将细菌悬浮液在37°C下孵育24小时建立生物膜。然后加入含有提取物（1/4 MIC、½ MIC、MIC、2× MIC、5× MIC 或 10× MIC）的新鲜培养基，再继续孵育24小时。
孵育后，用磷酸盐缓冲盐水轻柔洗涤各孔两次，去除浮游细胞。将剩余生物膜在60°C下热固定1小时，用0.1%（w/v）结晶紫溶液在室温下染色15分钟，然后用PBS仔细冲洗以去除多余染料。将结合的结晶紫溶解在30%（v/v）乙酸中，使用酶标仪在570 nm处测量吸光度以定量总生物量。
2.5. 统计分析
采用单因素方差分析，随后进行Dunnett多重比较检验。p值<0.05被认为具有统计学显著性。
- 结果
3.1. 啤酒花提取物
啤酒主要由水组成（约90-95% w/w），这导致酿造过程中产生的生物质含水量高。就Letra F啤酒干投阶段产生的废弃啤酒花而言，初始含水量约为80% w/w。离心后，含水量降至34.82 ± 1.06% w/w（表1）。
使用96%乙醇并通过挤出机强化的固液萃取平均产率为11.54 ± 0.19% w/w。这相当于每公斤干酒花渣可提取115.40克提取物，或每公斤湿酒花渣可提取85.60克。从工业角度看，一个每次批次生产约10公斤干投酒花渣的酿酒厂，使用此方法预计可获得约856克啤酒花提取物。
提取物含有2.36 g/L总糖、30.32 g/L蛋白质和约21 mg/L总酚。HPLC分析表明，乙醇提取物特别富含啤酒花来源的生物活性化合物，即黄腐酚（约31.5%）、(阿)忽木酮（约16.2%）、伴蛇麻酮（约46.2%）和(阿)蛇麻酮（约6.2%）。化合物鉴定基于与文献数据的保留时间和紫外吸收光谱比较。修正后的手稿中，啤酒花提取物的HPLC色谱图复制品（包括黄腐酚、α-酸和β-酸的峰鉴定）现已作为图1呈现。
这些结果表明，乙醇提取是从IPA生产残留物中回收啤酒花来源α-和β-酸的简单而有效的策略。黄腐酚和伴蛇麻酮的高含量凸显了该方法在生成高价值提取物方面的潜力，这些提取物可用于治疗或化妆品配方，包括针对AD管理的配方。
3.2. 微生物质量
提取物表现出微生物质量，未检测到微生物生长，如表2所示。用于微生物质量评估的培养皿的代表性图像可在补充材料（图S1）中找到。
3.3. MIC和MLC
视觉MIC和MLC的结果汇总在表3中。
根据MLC/MIC比值标准（区分杀菌作用（≤4）和抑菌作用（>4）），啤酒花提取物对金黄色葡萄球菌表现出杀菌活性，对表皮葡萄球菌表现出抑菌活性[25]。
分析上，对于两种微生物，提取物浓度最低且与对照孔相比吸光度无显著增加的最小浓度被定义为能够抑制细菌生长的最低提取物浓度，为0.002%（w/v）。分析MIC的结果见图2。
3.4. 生物膜
当在生物膜形成前施用时，提取物在½ MIC浓度下对金黄色葡萄球菌生物膜表现出更显著的效果，而抑制表皮葡萄球菌以及金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌混合生物膜的形成则需要5× MIC浓度（图3）。
当在生物膜形成后施用时，提取物在2× MIC浓度下对金黄色葡萄球菌生物膜以及金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌混合生物膜的破坏也表现出更显著的效果。相反，破坏表皮葡萄球菌生物膜则需要5× MIC浓度（图4）。
- 讨论
AD是一种受遗传、免疫和环境因素影响的多因素慢性炎症性皮肤病[2,4]。AD的一个标志性特征是皮肤屏障功能障碍，这使患者易受病原微生物（特别是金黄色葡萄球菌）的定植。金黄色葡萄球菌的过度增殖加剧了皮肤炎症，并通过释放毒力因子（包括生物膜）进一步损害屏障，这些毒力因子与疾病严重程度密切相关[7,10]。鉴于金黄色葡萄球菌形成生物膜与症状严重程度相关，破坏这一过程代表了AD治疗的一个有前途的治疗策略[10]。此外，皮肤微生物群的平衡，特别是金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌之间的平衡，对AD的进展和调节至关重要。以金黄色葡萄球菌过度增殖为标志的失调破坏了这种微生物平衡，并促进了发病机制，这强调了旨在恢复微生物平衡的策略的重要性[9,10,11]。
本研究强调了从干投酒花渣（IPA酿造的主要副产品）中获得的啤酒花提取物作为解决AD微生物失调的有前途策略的潜力。在葡萄牙，酿造工业约占国民生产总值的1.5%[26]。该行业产生大量废物流，包括废水、废谷物、废酵母、废啤酒花和酒花渣[27,28,29]。仅Cervejaria Letra每周就产生150至200公斤酒花渣，突显了资源化策略的可行性。将此类残留物重新利用为副产品符合循环经济原则，并能够将未充分利用的工业副产品转化为用于化妆品和皮肤病学应用的高价值成分[14,20]。
使用96%乙醇提取非常有效，每公斤干酒花渣可获得高达115.40克提取物，并回收关键的生物活性化合物，如伴蛇麻酮（约46.15%）和黄腐酚（约31.5%）。两者均因其抗菌和抗炎特性而被广泛认可，使其与AD管理尤为相关[13]。提取物的成分与AD的治疗目标一致：减少金黄色葡萄球菌定植、抑制生物膜产生、恢复微生物平衡同时保留表皮葡萄球菌的活性。先前显示能抑制金黄色葡萄球菌的化合物（如黄腐酚和忽木酮）可能协同作用抑制致病菌株同时支持共生菌[13,15]。此外，符合欧洲药典[24]的微生物质量评估确认了提取物的安全性及其适用于进一步体外和体内应用，包括化妆品配方。
抗菌测试显示对表皮葡萄球菌有抑菌作用，对金黄色葡萄球菌有杀菌作用。两种菌株的视觉MIC均为0.129%（w/v）（即啤酒花提取物在相对低的浓度下就能有效抑制细菌生长），而对金黄色葡萄球菌的MLC为0.515%，对表皮葡萄球菌的MLC为1.030%。这些结果表明，对AD恶化主要病原体金黄色葡萄球菌[4,10]具有抑菌作用和更强的杀菌作用。抗菌活性可归因于已鉴定的啤酒花来源化合物，如忽木酮、蛇麻酮和黄腐酚，它们破坏细菌细胞膜并干扰必需的微生物过程[13,15,18]。这些疏水性化合物穿透细菌细胞壁，破坏细胞结构，并抑制必需营养物质（如糖和氨基酸）的主动运输[18]。α-和β-酸，包括忽木酮和蛇麻酮，已知通过干扰细菌细胞质膜来抑制革兰氏阳性菌（如葡萄球菌属）[15,17]。黄腐酚，一种异戊二烯基查尔酮，特别促进细胞膜渗透[17]。此外，这些化合物可影响细菌细胞表面的疏水性，并可能作为群体感应抑制剂[16]。α-和β-酸之间的结构差异，如侧链组成和异戊二烯化，直接影响其各自的抗菌活性[17]。抗菌剂的浓度也会导致细菌迟滞期延长，进一步抑制生长[18]。金黄色葡萄球菌通常对啤酒花提取物更敏感，这种差异敏感性是观察到的对金黄色葡萄球菌比表皮葡萄球菌具有更强杀菌作用的基础。
重要的是，提取物还表现出显著的抗生物膜活性，这是AD管理中的一个关键特性。当在生物膜形成前施用时，提取物在½ MIC浓度下显著抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成，而抑制表皮葡萄球菌和混合菌种生物膜则需要更高浓度（5× MIC）。这表明金黄色葡萄球菌对啤酒花来源化合物更敏感，与其侵袭性生物膜形成能力一致。这种敏感性可归因于不同细菌物种间细胞外基质的生化组成和理化性质的变化，这直接影响抗菌剂的渗透性和有效性[30]。金黄色葡萄球菌生物膜通常由宿主因子、多糖细胞间粘附素、蛋白质、胞外DNA和淀粉样纤维组成[10]。负责PIA生物合成的icaADBC基因座同时存在于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中[10]。然而，生物膜形成的遗传变异，例如ica操纵子基因的差异，可能导致观察到的表皮葡萄球菌生物膜对啤酒花化合物具有更高的抵抗力[16]。
当在生物膜形成后施用时，提取物也能减少已形成的生物膜，其中金黄色葡萄球菌和混合生物膜更容易被抑制，而表皮葡萄球菌生物膜则更顽固。这进一步表明表皮葡萄球菌生物膜基质的结构和组成细微差别可能使其更坚固或对啤酒花化合物的渗透性更低。啤酒花化合物，包括忽木酮和黄腐酚，通过破坏细菌细胞膜和细胞壁完整性发挥其作用[16]。黄腐酚似乎能够侵入已形成生物膜的深层，而忽木酮可能更局限于外层[16]。生物膜对抗菌剂的抵抗力通常比浮游细胞高数百倍，这主要是由于基质中药物扩散减慢以及保护性细胞外成分的存在[10]。这种预防和破坏的双重作用在AD中非常相关，因为生物膜相关细菌会导致持续炎症和对常规疗法的抵抗力。
总之，这些发现表明，从酿造废酒花渣中提取的啤酒花提取物作为AD管理的辅助手段具有重要前景。其选择性抑制金黄色葡萄球菌生长和生物膜形成的能力，同时对表皮葡萄球菌表现出抑菌作用，可能有助于恢复皮肤上的微生物平衡。通过靶向致病性金黄色葡萄球菌的过度增殖及其毒力机制，该提取物可能有助于减轻炎症、缓解AD症状，符合当前以微生物组为重点的治疗策略，旨在改善患者生活质量[8,9]。
尽管这些结果令人鼓舞，但需要注意的是，本研究完全在体外进行。尽管这些模型提供了生物活性和选择性的初步证据，但它们并未完全捕捉人类皮肤的复杂性。本研究未评估皮肤渗透性、与宿主细胞的相互作用以及耐受性等因素。
尽管存在这些局限性，这些发现强调了酿造残留物作为具有皮肤病学和化妆品相关性的生物活性化合物的未充分开发的潜力。未来的研究应侧重于先进的人类皮肤模型、皮肤耐受性评估以及配方开发，以确认其在化妆品应用中的功效和安全性。这些步骤将进一步验证啤酒花提取物作为可持续且有效的成分，用于恢复微生物平衡和促进AD皮肤健康。由于这些成分的化妆品应用范围，必须强调不能进行动物试验，因为根据欧洲化妆品法规（EC No 1223/2009），成分和最终产品禁止进行动物试验。
总的来说，本研究提供了啤酒花提取物内在价值的有力证据，牢固确立了其作为有前途的生物活性成分的相关性，并为化妆品领域的环境可持续战略开辟了道路。
- 结论
从精酿IPA啤酒生产副产品中获得的啤酒花提取物表现出显著的抗菌（抑菌）和抗生物膜活性，特别是针对特应性皮炎发病机制中的关键病原体金黄色葡萄球菌。其抑制细菌生长和破坏生物膜形成的双重能力，加上其可持续来源，支持其作为调节AD及其他皮肤疾病相关微生物群失衡的新型候选物的潜力。
本研究强调了酿造残留物作为具有皮肤病学相关性的生物活性化合物的未充分开发的潜力，为创新和环境可持续的战略开辟了道路。需要进一步研究以扩大皮肤病学应用范围、评估长期功效，并确认提取物在恢复微生物平衡和改善AD皮肤健康方面的作用。总体而言，这些发现证明了提取物本身作为有价值的生物活性成分的内在重要性，牢固确立了其相关性。
【全文结束】