摘要
表观遗传"时钟"在估计生物年龄方面现已超越实际年龄的准确性。在本研究中，我们使用四种此类年龄估计器证明人类的表观遗传衰老可以被逆转。采用旨在再生胸腺的治疗方案，我们观察到保护性免疫学变化、多种与年龄相关疾病的改善风险指标，以及治疗1年后表观遗传年龄平均比基线低约1.5年（与研究结束时未接受治疗相比变化-2.5年）。表观遗传年龄逆转相对于实际年龄的速率从0-9个月的-1.6年/年加速到9-12个月的-6.5年/年。预测人类发病率和死亡率的GrimAge显示，停止治疗六个月后，表观遗传年龄与实际年龄相比仍有2年的减少。据我们所知，这是首次通过目前可获取的抗衰老干预手段，基于表观遗传年龄估计器报告人类预测寿命的增加。
1 引言
人口老龄化在发达国家日益成为一个重要问题，带来一系列医疗、社会、经济、政治和心理问题（Rae等，2010）。近年来，许多生物医学改善衰老的方法已在动物模型中进行了研究，其中一些似乎能够基于多种生理测量结果逆转成年哺乳动物的普遍衰老特征（Das等，2018；Ocampo等，2016；Zhang等，2017）。然而，迄今为止，系统性衰老的逆转尚未通过表观遗传年龄测定得到证实，而表观遗传年龄现在可以提供一种简单但有说服力的生物年龄而非实际年龄的指标（Horvath & Raj, 2018；Jylhava等，2017）。此外，特别需要解决由胸腺退化引起的免疫衰老问题（Bodey等，1997）。胸腺退化导致关键免疫细胞群的耗竭（Arnold等，2011），在人类中导致T细胞受体（TCR）库在约63岁后崩溃（Naylor等，2005），并与年龄相关癌症发病率增加（Falci等，2013）、传染病（Ventevogel & Sempowski, 2013）、自身免疫疾病（Goronzy & Weyand, 2003）、全身炎症（Goronzy & Weyand, 2003）、动脉粥样硬化（Dai等，2018）以及全因死亡率（Fernando-Martinez等，2013；Roberts-Thomson等，1974；Strindhall等，2007）相关联。相比之下，百岁老人则表现出持续的免疫功能（Strindhall等，2007）。尽管衰老中的胸腺功能也取决于骨髓提供的T细胞前体，随着年龄增长，骨髓髓系造血干细胞（HSCs）输出会下降（Akunuru & Geiger, 2016），但淋巴样前体细胞的净数量并不随年龄变化（Montecino-Rodriguez等，2019），T细胞前体从骨髓迁移也似乎依赖于胸腺功能（Haar等，1989）。
基于这些原因，我们在2015-2017年进行了可能是首个旨在逆转人类衰老方面的临床试验——TRIIM（胸腺再生、免疫恢复和胰岛素减轻）试验。TRIIM试验的目的是调查使用重组人生长激素（rhGH）来预防或逆转51-65岁假定健康男性人群中免疫衰老迹象的可能性，这一年龄段正好在TCR库崩溃之前。rhGH的使用基于先前证据，表明生长激素（GH）在动物（Kelley等，1986）和人类HIV患者中具有胸腺营养和免疫重建作用（Napolitano等，2008；Plana等，2011）。由于GH引起的高胰岛素血症（Marcus等，1990）是不希望出现的，并且可能影响胸腺再生和免疫重建，我们尝试将rhGH与脱氢表雄酮（DHEA）和二甲双胍联合使用，以限制GH的"致糖尿病"效应（Fahy, 2003, 2010；Weiss等，2011）。DHEA在男性和女性中具有多种对抗正常衰老有害影响的作用（Cappola等，2009；Forti等，2012；Shufelt等，2010；Weiss等，2011）。二甲双胍在衰老小鼠中是一种强大的卡路里限制模拟物（Dhahbi等，2005），并被提议作为减缓人类衰老的候选药物（Barzilai等，2016）。已知DHEA（Riley等，1990）和二甲双胍本身均不具有任何胸腺营养作用。
2 结果
2.1 治疗安全性与副作用
本研究中的主要关注点之一是促有丝分裂原（IGF-1）水平升高是否可能加剧前列腺中的癌变或癌前病灶。这两种变化都应可通过测量PSA或游离PSA百分比来检测。然而，PSA、游离PSA百分比以及作为前列腺癌风险总体指标的PSA与游离PSA比率在治疗第15天显著改善，并一直保持到12个月结束（图1a-c）。两名志愿者在6个月时PSA短暂激增，但迅速逆转，经与志愿者协商后，解释为PSA检测前接近性活动时间。未观察到睾酮水平变化。
另一个重大关注点是增强免疫活性是否可能加剧年龄相关炎症。然而，C反应蛋白（CRP）随治疗而下降，到9-12个月时下降达到统计学显著性（图1d）。促炎细胞因子IL-6没有变化（图1e）。
在血清白蛋白、脂质、血红蛋白、血细胞比容、血小板计数、电解质和肝酶方面未发现显著变化（图1f）。胰岛素水平通常通过DHEA和二甲双胍的共同给药得到充分控制（图1g）（尽管一名异常值在12个月时增加了平均胰岛素），血糖水平没有变化（图1h）。最后，估计肾小球滤过率（eGFR），与二甲双胍潜在的乳酸酸中毒风险以及治疗效果相关，在9-12个月后显示出统计学显著改善（18个月时也有改善趋势）（图1i）。副作用轻微，典型为rhGH给药反应，除两例外无需调整剂量。副作用包括关节痛（2例）、焦虑（1例）、腕管综合征（1例）、液体潴留（1例）、轻度男子乳腺发育（1例）和肌肉酸痛（1例）。一名试验志愿者因自我报告的窦性心动过缓（先于试验发生）以及晚期承认强烈家族癌症史，大约一个月后被移出研究。
2.2 胸腺和骨髓再生反应
观察到胸腺MRI密度的明显定性改善，如图2所示。从定量上看，基于线性混合模型分析，胸腺无脂肪分数（TFFF）的整体增加在p=8.57×10^-17水平上显著，表明胸腺功能性质量的恢复。改善在9名志愿者中的7名中显著（图3a-c）。两名志愿者基线时胸腺脂肪水平异常低（TFFF高），其TFFF在治疗中未显著改善（峰值相对变化为+9.6%（p>0.3）和+12.4%（p>0.2）；图3b）。他们的无响应与年龄无关。相反，TFFF的改善取决于基线TFFF，而与基线年龄无关（图3c）。
相比之下，胸骨骨髓无脂肪分数（BMFFF）增加程度要小得多，但由于一致性如此高（图3d），达到高度统计学显著性（图3e；单点比较p<0.001，或正式线性混合模型分析p=9.5×10^-12）。骨髓与胸腺类似，显示出随着基线脂肪含量增加而BMFFF增加的模式，但模式细节不同（图3f）。这种差异加上胸腺相比骨髓脂肪更显著的替代，既与特异性逆转胸腺退化而非GH给药引起的全身脂肪回归一致，也与GH可能刺激骨髓T细胞前体产生的观点一致（French等，2002；Hanley等，2005）。
2.3 免疫细胞亚群和细胞因子变化
通过CyTOF定义的免疫细胞群体分析显示，最显著的变化是总单核细胞和CD38阳性单核细胞的减少（图4a、b）以及由此导致的淋巴细胞与单核细胞比率（LMR）的增加（图4c）。线性混合模型相关分析还显示，在治疗9个月和12个月后，TFFF与CD38+单核细胞百分比降低之间存在显著相关性（r²=0.59，p=0.01），以及TFFF与淋巴细胞与CD38+单核细胞比率之间的相关性（r²=0.55，p=0.018）。当在所有治疗时间点（0、9和12个月）进行相关分析时，总单核细胞与TFFF以及整体LMR与TFFF之间也观察到类似趋势（分别为r²=0.40，p=0.039和r²=0.45，p=0.019）。平均单核细胞群体的变化在停药6个月后仍然持续（标准化CD38+单核细胞p=0.012，标准化总单核细胞p=0.022：表S1），LMR的增加在18个月时仍高度显著。
PD-1阳性CD8 T细胞随治疗显著下降（图4d）。通过门控幼稚T细胞，我们能够检测到幼稚CD4和幼稚CD8 T细胞的显著增加（图4e-f）以及CD31+CD45RA+CD4+细胞（CD4近期胸腺移植物，RTEs）百分比的显著（p=0.017）增加（线性相关，图S1）。我们未检测到以CD57+细胞或CD28-细胞测量的衰老T细胞的一致变化。然而，我们确实检测到血清FGF-21水平显著增加（图S2）。
2.4 表观遗传年龄回归
尽管平均而言，试验志愿者的表观遗传年龄（EA）在基线时低于实际年龄（As）[（EA-A）0<0，表1]，但基于所有四个表观遗传时钟的结果，治疗仍显著降低了表观遗传年龄（图5a-d），12个月后EA-A的平均变化约为2.5年（图5e）。治疗对12个月时表观遗传年龄回归的影响不依赖于治疗开始时的年龄或（EA-A）0（表1）。线性混合模型分析（LMMA）显示，各个时钟在0-12个月的显著性水平从p=0.0009-0.012到0-18个月的p=0.0016-0.028（图5图例）。在调整血液细胞组成变化（淋巴细胞计数、CD8 T细胞中衰老CD8 T细胞百分比以及LMR）后，Horvath时钟LMMA结果保持不变（p=0.018）。尽管在停药6个月后，EA-A总体上倾向于向（EA-A）0回归，但这种趋势是不完整的，在试验第18个月平均仍改善超过1.5年（图5e，p<0.001）。此外，专门能够预测人类预期寿命的GrimAge时钟，在治疗后（EA-A）-（EA-A）0没有回归，在12个月时约2.1年的增益在试验第18个月仍保持（图5d；表1）。此外，比较0-9个月和9-12个月之间的衰老回归速率显示，对于每个年龄估计器，随着治疗时间增加，衰老回归速率似乎显著加速（图5a-d和表1），四个时钟的平均斜率从前9个月的-1.56±0.46年/年到治疗最后3个月的-6.48±0.34年/年（p<0.005，图5f）。
3 讨论
TRIIM试验旨在调查在健康衰老男性中再生胸腺和逆转免疫衰老趋势的可能性，同时将副作用和任何可能风险降至最低。我们的结果支持这一目标的可行性，但出乎意料地也揭示了人类多个方面和衰老生物标志物回归的有力证据。这两个观察结果可能相关。
通过恢复年轻胸腺组织学（Goff等，1987；Kelley等，1986）和逆转年龄相关免疫缺陷（Kelley等，1986），生长激素给药对衰老大鼠和狗的胸腺再生和再激活已得到证实。在人类中，约54岁后存活胸腺组织的存在一直受到质疑，这对老年人成功胸腺再生是必需的（Simanovsky等，2012）。有关rhGH在HIV患者中诱导胸腺CT密度增加和免疫学改善的现有报告（Napolitano等，2008；Plana等，2011），其胸腺生理异常（McCune等，1998），对50岁以上个体是否观察到再生保持沉默。本研究现在为正常衰老男性中胸腺再生提供了高度显著的证据，伴随着多种疾病风险因素和年龄相关免疫参数的改善，以及TFFF与单核细胞百分比和LMR的有利变化之间的显著相关性，与治疗开始时最高65岁的年龄无关。这些观察结果与生长激素已知的刺激造血和胸腺上皮细胞增殖的能力一致（Savino, 2007）。我们在治疗12个月后发现FGF-21水平增加表明，目前治疗可能部分通过这种细胞因子介导胸腺再生（Youm等，2016），我们认为这是一个新发现。
我们尚未发现先前研究将rhGH给药与LMR增加或单核细胞水平降低相关联，而DHEA给药实际上可能增加单核细胞水平（Khorram等，1997）。所涉及的机制尚不清楚，但我们治疗对LMR的意外影响可能具有相当大的意义，原因有两个。
首先，较高的LMR与人类各种主要死亡来源的更好预后相关，包括至少8种癌症（如前列腺癌；Caglayan等，2019）、动脉粥样硬化（Gong等，2018）、心血管疾病（Ji等，2017）和中风（Ren等，2017），也与较少的全身炎症相关（Gong等，2018）。心血管疾病的保护与LMR高于5相关（Gong等，2018）。在我们的研究中，志愿者平均LMR在基线时低于5，但在治疗结束和治疗结束后6个月均明显高于5。
其次，绝大多数单核细胞是CD38阳性的。CD38是一种NADase外酶，降解NAD+前体烟酰胺单核苷酸，随着年龄增长CD38表达增加似乎是小鼠和很可能人类中年龄相关组织NAD+耗竭的主要原因（Camacho-Pereira等，2016）。年龄相关的CD38诱导据称由年龄相关炎症驱动，并起源于组织中的炎症细胞（Camacho-Pereira等，2016），原则上可能包括单核细胞。尽管许多其他免疫细胞表达CD38，但我们未检测到任何其他CD38+免疫细胞群随胸腺再生治疗而下降，表明单核细胞可能具有特殊意义。我们观察到CRP下降与单核细胞水平降低相结合，因此暗示组织NAD+水平可能增加。CRP降低的机制尚不清楚，但胸腺中阴性选择的再激活理论上可能减少自身免疫相关炎症；清除促炎病毒或衰老体细胞也可能涉及其中。鉴于年龄相关组织NAD+耗竭与衰老表型发作之间的关系（Das等，2018；Poljsak & Milisav, 2016），增加的组织NAD+含量可能与我们观察到的表观遗传衰老逆转、LMR较高与健康状况更好之间的普遍关联，以及先前将胸腺移植与各种非免疫学衰老过程回归相关联的观察结果相关（Fabris等，1988）。与此可能性一致，我们观察到总单核细胞和CD38+单核细胞的强烈下降、LMR增加以及GrimAge降低均在停药后6个月持续。
治疗诱导的PD-1+ CD8 T细胞下降与胸腺再生治疗表观遗传重编程"耗尽"CD8 T细胞（TEX）的可能性一致，这是一种最近被表征的独特PD-1+ CD8群体（Khan等，2019）。这些细胞之所以引人关注，部分是因为PD-1是一种免疫检查点分子，抑制T细胞增殖反应（Henson等，2012），并涉及癌症逃避免疫控制，从而促使人们大力开发靶向PD-1的药理学免疫检查点抑制剂（Khan等，2019）。阻断PD-1信号可改善"衰老"人类CD-8细胞的增殖（Henson等，2015）。小鼠随着年龄增长也会发展出一种由PD-1+和Tim-3+组成的耗尽CD8细胞亚群（Lee等，2016）。因此，胸腺再生治疗降低PD-1+ CD8 T细胞可能代表免疫状态的显著改善。
与rhGH治疗的HIV患者报告的变化相比，治疗诱导的幼稚CD4和幼稚CD8 T细胞增加相对较小，但我们的志愿者群体在基线时是前免疫衰老且未耗尽幼稚CD4和幼稚CD8 T细胞的。尽管存在淋巴结衰老可能引起的并发症（Thompson等，2019），仍观察到积极反应。因此，这些细胞和CD4 T细胞RTEs的微小增加与最终目标一致，即预防或逆转我们研究人群年龄略高时正常的年龄相关TCR库崩溃（Naylor等，2005）。
表观遗传衰老逆转可能存在免疫学和非免疫学机制。GH、DHEA和二甲双胍具有独特的作用，与衰老相反，这种特定药物组合可能激活足够广泛的治疗途径，以解释先前不可预测的表观遗传衰老逆转，即使独立于我们测量的免疫学标志物。
在这方面，必须指出GH和IGF-1也可能具有促衰老效应，因此大多数老年学家倾向于降低而非增加这些因素的水平（Longo等，2015）。然而，大多数关于衰老和GH/IGF-1的过去研究都受到使用影响衰老发育编程的突变的混淆，这对非突变成人不一定相关。例如，小鼠中的此类突变在大脑发育过程中改变了下丘脑的正常神经支配，并防止成年期下丘脑炎症（Sadagurski等，2015）。下丘脑炎症可能在非突变体中编程成年全身衰老（Zhang等，2017），但在正常非突变成人中降低IGF-1似乎不太可能提供相同保护。过去研究的第二个问题是普遍未能将GH/IGF-1信号与终生胰岛素信号变化区分开来。人类长寿似乎与胰岛素敏感性而非IGF-1水平更一致相关，IGF-1对人类长寿的影响因其与胰岛素敏感性的反比例关系而混淆（Vitale等，2019）。因此，我们认为在DHEA升高的更自然环境中，对正常非突变成人限时增加GH/IGF-1同时最大化胰岛素敏感性的方法是合理的，特别是考虑到GH和IGF-1在免疫维持中的积极作用、免疫维持在延缓衰老中的作用（Fabris等，1988）以及我们目前的结果。
无论表观遗传年龄逆转的机制如何，所选的四个表观遗传时钟尽管测量衰老的某些不同特征并与血液组成和白细胞端粒长度相关性不同，但均显示出表观遗传年龄的显著回归。在治疗9个月后还观察到表观遗传衰老逆转的显著加速。后一观察的含义仍有待探索。此外，尽管根据某些表观遗传时钟，表观遗传年龄逆转在停药后似乎部分回归，但GrimAge时钟并非如此，后者最能预测人类预期寿命和健康寿命（Lu等，2019）。表观遗传衰老的后续测量使用GrimAge时钟是否会显示预测寿命持续2年的增益或与基线相比预期寿命增加的逐渐丧失仍有待观察。在后一种情况下，确定重复或延长试验治疗是否会恢复或进一步增强预测寿命增益将很有趣。
尽管表观遗传年龄不测量衰老的所有特征，也不等同于衰老本身，但它是目前可用的生物年龄和年龄相关疾病风险的最准确测量方法。这证明使用表观遗传时钟在实际时间尺度上估计假设抗衰老干预措施的有效性是合理的。本研究有力地支持了这一方法，在仅涉及9名志愿者的一年试点试验中，即使表观遗传年龄回归也显示出高度统计学显著性。然而，有必要通过在适当有力的后续研究中复制这些结果来验证当前结果。尽管还有很多工作要做，但人类衰老有意义改善的总体前景似乎相当有希望。
4 实验程序
4.1 志愿者招募和筛查
通过公开宣布试验目标后的口口相传，招募了10名51-65岁名义上健康的成年男性参加研究。共有两个队列，第一组由7名男性组成，第二组包括3名男性。第1队列在2015年10月至2016年10月期间接受治疗，第2队列在2016年4月至2017年4月期间接受治疗。志愿者首先完成在线筛查问卷，合格候选人随后提供血液样本以客观确认健康资格。通过第二轮筛查的候选人参加了一次会议，以便进行身体评估、自我注射rhGH能力验证、胸腺基线磁共振（MR）成像、两次额外血液采集（见附录S2）、知情同意以及如何填写提供的药物日记的指导，药物日记旨在提醒志愿者服药时间表并报告任何不良反应或任何服药不规则情况。
4.2 试验实施
TRIIM试验在Aspire机构审查委员会（加利福尼亚州桑蒂）批准研究方案后进行，并在美国食品药品监督管理局（FDA）的IND 125,851下进行。志愿者在斯坦福大学Lucas影像中心接受MRI检查，在斯坦福血液中心进行血液采集，并在斯坦福大学研究合规办公室批准下由人类免疫监测中心（HIMC）进行CyTOF分析。该试验符合《赫尔辛基宣言》、《人体志愿者保护》（21 CFR 50）、《机构审查委员会》（21 CFR 56）和《临床研究者义务》（21 CFR 312）。根据FDA对探索性前期I期研究的指南（
在试验的第一周，单独给予rhGH（0.015 mg/kg）以获得初始胰岛素反应，在第二周，rhGH与50 mg DHEA联合使用，以评估DHEA单独对胰岛素的抑制作用。在第三周，rhGH和DHEA的相同剂量与500 mg二甲双胍联合使用。从第四周开始，所有剂量均根据每位志愿者的特定反应进行个性化调整。此后，在第2、3、4、6和9个月前一周采集血液，以便在这些时间点进行进一步剂量调整（以最大化IGF-1并最小化胰岛素），并在12个月时获取额外血液样本以结束治疗监测期。通过IGF-1、DHEAS和胰岛素对rhGH、DHEA和二甲双胍给药的反应、与试验志愿者的频繁沟通以及对返回药物日记的回顾性审查来验证给药依从性。在第18个月对第1队列进行了额外随访血液检测；第2队列不可用。在选定的情况下，根据需要，在其他时间进行补充血液采样。
血清和外周血单个核细胞（PBMCs）在SBC使用10%二甲基亚砜和胎牛血清（FBS）冷冻保存，并在那里和HIMC存储至试验结束，以便同时进行CyTOF分析并将部分样本分发到其他中心。通过Quest Diagnostics进行全血细胞计数，以校正由冷冻和解冻或其他因素引起的细胞损失，但通常通过将细胞亚群报告为其参考种群的百分比（例如，幼稚CD4细胞占总CD4细胞的百分比）以及门控到完整活性单细胞来避免校正的需要。其他血液测定见附录S2。
rhGH（Omnitrope，Sandoz）提供给试验志愿者，并根据副作用每3-4天自行注射一次，睡前与其他研究药物一起服用。所有志愿者还被提供并要求每天服用3,000 IU维生素D3和50 mg元素锌补充剂。
4.3 MR成像和分析
所有成像扫描均在斯坦福大学Lucas影像中心的同一台3T GE Premier MRI扫描仪上进行。由于之前未描述过定量确定胸腺脂肪含量的标准化方法，因此我们采用了一种先前应用于骨髓脂肪含量分析的计算方法（Hu等，2011）。这些脂肪量化方法已被证明比标准组织病理学活检评估更准确（Fischer等，2012），并提供0%至100%范围内的胸腺脂肪分数（TFF）。TFF在每个测试时间点的三个复制中央胸腺区域中确定，并用于计算胸腺无脂肪分数（TFFF）为100% - TFF。相同方法也应用于确定胸骨骨髓无脂肪分数（BMFFF）。有关更多详细信息，请参见附录S2。
4.4 免疫表型分析
将冷冻保存的PBMCs在温介质中解冻，洗涤两次，并重新悬浮在CyFACS缓冲液（PBS补充2% BSA、2 mM EDTA和0.1%叠氮化钠）中。通过台盼蓝染料排除法（Vi-CELL XR分析，Beckman Coulter Life Sciences）确定活力。将细胞加入V型底微量滴定板（1.5×10^6活性细胞/孔），并通过沉淀和重新悬浮在新鲜CyFACS缓冲液中洗涤一次。细胞在冰上用50μl针对35种细胞表面标志物的重金属同位素标记抗体混合物染色60分钟（有关细胞洗涤、染色、通透化和门控的详细信息，请参见附录S2）。
4.5 表观遗传年龄测定
在不列颠哥伦比亚大学分子医学与治疗中心对先前冷冻保存的PBMCs进行了基因组DNA甲基化状态测定。使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen, Hilden, Germany）提取基因组DNA，并使用Zymo EZ DNA甲基化试剂盒（Zymo Research, Irvine, CA）对提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化。使用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip（Illumina, San Diego, CA）进行DNA甲基化（DNAm）分析，该芯片测量人类基因组中866,836个CpG位点的单CpG分辨率DNAm水平。特定位点的甲基化计算为β = Max(M,0)/[Max(M,0) + Max(U,0)]，其中Max(M,0)是甲基化(M)等位基因的荧光强度（信号A），Max(U,0)是未甲基化(U)等位基因的荧光（信号B）。因此，β值范围从0（完全未甲基化）到1（完全甲基化）（Dunning等，2008）。
本研究中选择使用的特定表观遗传"时钟"是由Horvath（2013；DNAm年龄）、Hannum等（2013；DNAm年龄H）、Levine等（2018；DNAm PhenoAge）和Lu等（2019；DNAm年龄G或"GrimAge"）推导出的。这些选择的具体理由基于Horvath和Levine（2015）、Marioni等（2015）以及Triche等（2013），并在附录S2中描述。
我们通过首先将所有时间点数据拟合到纵向数据的线性混合效应模型（来自同一人的多次血液抽取，针对初始DNAm年龄进行调整）来计算干预对表观遗传年龄的影响，以跟踪全局表观遗传衰老趋势。其次，为了分离更详细的个体和特定时间变化，我们如文中所述计算了每位志愿者表观遗传年龄与实际年龄的变化，即(EA-A) - (EA-A)0，其中EA是实际年龄A时的表观遗传年龄，(EA-A)0是EA与A之间的基线差异。
4.6 统计分析
我们使用线性混合效应回归来正确考虑信息的纵向性质（来自同一人的多次抽取）。当不需要校正时间时，我们使用普通线性或非线性回归。对于治疗前和特定治疗后终点之间的比较，我们采用t检验、配对比较的t检验，或当t检验的基本假设不成立时由SigmaPlot选择的替代方法。为了能够与第零个月基线进行标准化比较，将每位志愿者在时间零点的重复结果取平均值，并将每个重复结果除以平均值，以产生与100%偏离的群体，然后可用于与后续时间点进行比较。报告的P值未对多重比较进行校正，因为在大多数情况下未进行独立假设检验，在表观遗传年龄的多重检验和CyTOF结果的显著差异情况下，所有显著检验结果高度相关，使Bonferroni校正过于保守。
致谢
我们感谢Garry Nolan和Sean Bendall提供的多方面支持。我们非常感谢HIMC的Yael Rosenberg-Hasson提供的有益建议和支持，以及斯坦福校园上HIMC、Lucas影像中心、SBC和其他机构许多其他人的愉快合作，他们使志愿者处理和校园研讨会成为可能。我们还感谢本文的审稿人，他们以重要方式帮助我们改进了手稿。我们特别感谢许多个人提供的慷慨个人捐款以及生命延长基金会的补充拨款，所有这些都使额外测量成为可能。本研究由Intervene Immune, Inc.资助。
利益冲突
GMF、RTB、JPW和SH是Intervene Immune, Inc.的股东或拥有购买该公司股份的期权，GMF和RTB是Intervene Immune的高级职员，并在相关的Intervene Immune专利申请中被提名。所有其他作者声明无竞争利益。
作者贡献
GMF设计并指导了研究，为所有图形编制了数据，准备了图形，并撰写了手稿。RTB管理研究；为设计做出了贡献；获得了所有CyTOF、TFFF和BMFFF分析的数字数据；并为手稿做出了贡献。JPW担任研究医师，提供医疗监督、支持、建议和志愿者评估，并协助试验事件。ZG设计并安排了CyTOF分析的抗体面板，指导了CyTOF分析，并协助试验事件。SSV设计了TFFF和BMFFF测量技术。HM和ML为CyTOF数据的正确处理和解释提供指导，并审查和批准了我们的CyTOF方法。DTSL和MSK进行了所有表观遗传测量，并为手稿提供了有益的见解。SH进行了所有表观遗传时钟计算，执行了所有线性混合模型相关性，并为手稿做出了贡献。所有作者批准了手稿。
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