摘要
引言：
调节性T细胞(Treg细胞)表达转录因子FOXP3，通过抑制效应细胞反应来维持免疫稳态。在强烈或慢性炎症条件下，Treg细胞容易失去FOXP3表达，转化为病理性的"前调节性T细胞(ex-Treg)"。FOXP3表达缺失的一种机制涉及Foxp3基因座中内含子增强子CNS1和CNS2的DNA甲基化增加；这些增强子由TET酶维持在低甲基化状态，TET酶是5-甲基胞嘧啶(5mC)双加氧酶，能生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)和其他氧化甲基胞嘧啶，它们是所有DNA去甲基化途径中的关键中间产物。我们先前的研究表明，Tet2/3缺陷(Tet2/3 DKO)小鼠的FOXP3+ Treg细胞中CNS1和CNS2的甲基化水平增加，并且比野生型(WT)Treg细胞更有效地转化为FOXP3阴性的前调节性T细胞。
方法：
我们扩展了对Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠的先前分析。
结果与讨论：
我们根据脾脏和外周淋巴结中白细胞总数将小鼠分为DKO-中度和DKO-重度两类，并研究了这些小鼠中进行性炎症的表型和分子基础。RNA测序以及组织学和免疫细胞化学分析显示，Tet2/3 DKO-重度小鼠中T滤泡辅助(Tfh)细胞和浆细胞显著扩增。单细胞(sc)RNA测序分析表明，这是由于Tet2/3 DKO FOXP3+ Treg细胞和Tet2/3 DKO FOXP3-前调节性T细胞向Tfh样细胞的分化偏向所致。碱基分辨率"6碱基"测序显示，从Tet2/3 DKO-重度小鼠中纯化的Tfh细胞中5hmC水平预期降低而5mC水平升高，并表明观察到的基因表达模式偏向可能是由于TET缺失直接导致关键增强子甲基化增加，或者干扰了包括CTCF在内的甲基化敏感转录抑制因子的结合。
引言
调节性T细胞(Treg细胞)在人类和小鼠中均维持免疫稳态和免疫自身耐受，并抑制病理性炎症(1-8)。谱系决定性转录因子FOXP3控制Treg细胞的发育和抑制功能(9, 10)。在体内稳态条件下，表达FOXP3的Treg细胞通常保持稳定(11)，但在强烈或慢性炎症环境中，它们可能失去FOXP3并转化为称为"前调节性T细胞"的病理性细胞(11-20)。前调节性T细胞失去抑制炎症的能力，并可进一步转化为不同谱系的效应CD4+ T细胞—Th1、Th2、Th17和T滤泡辅助(Tfh)细胞，它们分泌促炎细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-21)—从而促进慢性炎症和自身免疫/炎症性疾病的发展(11-20)。已有研究表明，前调节性T细胞在几种疾病的小鼠模型中促进自身免疫反应，包括1型糖尿病(14)、移植物抗宿主病(16)、多发性硬化症(17)和自身免疫性关节炎(18, 19)。然而，前调节性T细胞在失去FOXP3后如何获得炎症功能仍不清楚。
在小鼠Treg细胞分化过程中，FOXP3表达的稳定性由位于Foxp3基因第一内含子中的两个保守非编码序列元件CNS1和CNS2(位于第一个编码外显子5'端)调控(21-23)。CNS2也称为Treg特异性去甲基化区域(TSDR)(24)，以与CNS2 DNA修饰状态相关的方式控制Foxp3表达的稳定性(24-27)。Foxp3 CNS2元件中的CpG位点在Treg细胞中主要是未甲基化的(C/5fC/5caC)，而在幼稚T细胞中则完全甲基化(5mC/5hmC)(21, 24, 27-32)。TET双加氧酶TET2和TET3在Treg细胞分化过程中冗余地在CNS1和CNS2增强子处沉积5hmC，导致它们去甲基化(5mC丢失)(28, 33)。在CD4-Cre Tet2/3floxed/floxed (Tet2/3fl/fl)小鼠的发育胸腺细胞中联合破坏Tet2和Tet3基因，导致iNKT细胞的显著抗原依赖性扩增，以及由于胸腺中T调节细胞部分丢失和外周几乎完全丢失而引起的严重炎症(34)。这些CD4-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中Treg细胞的丢失至少部分是由于FOXP3表达丢失导致的Treg稳定性降低，而FOXP3表达丢失又是由于CNS1和CNS2的DNA甲基化增加(28, 30, 33, 35)。在体外分化小鼠和人类iTreg细胞过程中添加TET激活剂维生素C，增加了TET酶活性，使CNS1和CNS2增强子保持在低甲基化状态，并提高了FOXP3表达的稳定性(28, 31)。重要的是，CNS2缺陷和Tet2/3缺陷的Treg细胞都以依赖细胞分裂的方式失去FOXP3(21, 22, 28)。FOXP3或CNS2的丢失可以通过IL-2或某些其他细胞因子治疗(22)或IL-2、视黄酸和维生素C的组合(28, 36)来缓解。
为了了解TET2/TET3在体内Treg细胞中的特定作用，我们研究了Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠。这些小鼠发展出进行性自身免疫/炎症性疾病，通常在8-22周龄时致命(33, 35)。这些小鼠的Treg细胞显示Foxp3基因中内含子增强子CNS1和CNS2的甲基化水平增加，尽管比CD4-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中观察到的程度要低，这反映了CD4在Treg发育过程中比FOXP3更早表达的事实。在这项早期研究中，我们仅分析了两只14周龄Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠的分子表型，其中一只小鼠的CD4+ FOXP3- T细胞的RNA测序数据显示Tfh相关和Th17相关基因上调(33)。与野生型(WT)Treg细胞相比，Foxp3Cre Tet2/3fl/fl小鼠的Treg细胞更容易失去FOXP3表达并成为"前调节性T细胞"(33)。值得注意的是，尽管受体小鼠中存在野生型Treg细胞，但来自Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠的总CD4+ T细胞均能有效地在受体免疫活性小鼠中引发显性炎症性疾病(33)。这些数据强调了两点：首先，TET蛋白对维持小鼠Treg细胞稳定性和免疫稳态至关重要；其次，转移实验中的炎症表型至少部分是由获得效应功能的前调节性T细胞驱动的(33)。
在本研究中，我们扩展了对Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中Treg和前调节性T细胞中TET双加氧酶作用的分析。表型上，小鼠表现出明显的脾肿大和淋巴结病，我们根据脾脏中白细胞总数将其分为中度或重度。与WT小鼠相比，DKO-重度小鼠中总CD4+ T细胞和CD4+ FOXP3+ Treg细胞的频率和数量显著增加。随着疾病从DKO-中度发展到DKO-重度，根据幼稚CD4+ T细胞数量的进行性减少来判断，小鼠表现出T细胞活化增加。组织学和免疫细胞化学分析结合流式细胞术显示，多种器官中淋巴细胞浸润增加，DKO-重度小鼠中中性粒细胞和浆细胞数量增加，以及细胞毒性CD8+ T细胞扩增，穿孔素和颗粒酶B表达增加。通过对WT和DKO-重度小鼠的CD4+ T细胞进行批量和单细胞(sc)RNA测序，我们发现Tfh相关基因表达增加，这通过流式细胞术得到证实，揭示了Foxp3Cre DKO小鼠的FOXP3+ Treg细胞和FOXP3-前调节性T细胞中Tfh表面标志物表达增加。5mC和5hmC分布的变化呈现复杂图景，取决于所涉及的基因，表明TET缺失导致的甲基化增加可能反映关键增强子的直接甲基化，或甲基化敏感转录抑制因子(如CTCF)结合减少。我们得出结论，Treg细胞中Tet2和Tet3选择性缺失的小鼠产生的FOXP3阴性前调节性T细胞表现出向Tfh细胞的偏向性转化，并引起发作时间可变的全身性炎症，其严重程度随年龄增长而逐渐增加。
结果
定义Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中的全身炎症水平
在14周龄时，Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠可分为两组，分别表现为中度或重度脾肿大和淋巴结病(图1A)，根据脾脏和外周淋巴细胞(颈部和腹股沟)总数是否少于或多于4×10^8，定义为DKO-中度和DKO-重度(图1B)。DKO-重度组中雌性小鼠比例较高(9/14，64%)，而DKO-中度组为(3/11，27%)(图1C)，这表明雌性小鼠在Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中更容易发展为严重症状。这一结论得到了先前论文中生存曲线的支持(此处重现为补充图1A)。没有小鼠能存活到成年早期(6个月)之后，表明疾病发展的变异性(中度和重度表型之间的差异)是由于个体小鼠疾病发展的进程不同所致。
虽然脾脏和淋巴结中活细胞中T细胞(TCRβ+细胞)的比例下降，但与WT或DKO-中度小鼠相比，DKO-重度小鼠中T细胞的绝对数量增加(图1D)。这反映了DKO-中度和DKO-重度小鼠中T或B细胞以外的细胞(TCRβ- B220-细胞)的频率和绝对数量均有所增加(图1E)。与WT相比，DKO-中度组中CD4+ T细胞的频率和绝对数量略有增加，而DKO-重度组中则显著增加(图1F)。Tet2/3 DKO Treg细胞的绝对数量也增加，特别是在DKO-重度小鼠中(图1G)，但通过流式细胞术评估的FOXP3表达水平与WT Treg细胞相似(数据未显示)。这些发现支持我们先前的结论，即Foxp3Cre Tet2/3fl/fl小鼠中的Treg细胞已基本失去抑制功能并获得了显性炎症表型，这通过与野生型Treg细胞相比，它们纠正T细胞和骨髓过继转移实验中scurfy细胞诱导的炎症的能力降低来衡量(33)。与WT小鼠相比，DKO-中度或DKO-重度小鼠脾脏和淋巴结中CD8+细胞的绝对数量(占所有T细胞的比例)没有变化(图1H)；然而，DKO-中度和DKO-重度小鼠中，尤其是DKO-重度小鼠中，CD4+和CD8+ T细胞群体中幼稚细胞(CD62Lhigh CD44lo)的比例显著降低，表明大多数T细胞已被活化或已成为记忆细胞(图1I, J)。
Tet2/3 DKO CD4+ YFP(FOXP3)-前调节性T细胞明显偏向Tfh样和Th17样细胞
我们对WT、DKO-中度或DKO-重度小鼠的CD4+ YFP(FOXP3)- T细胞进行了RNA测序。WT CD4+ YFP(FOXP)- T细胞包含约70%的幼稚T细胞(图1I，顶部)，在主成分分析(PCA)图中相对紧密地聚集在一起(方差小于9%，补充图1B)，而DKO-中度和DKO-重度Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠的CD4+ YFP(FOXP)- T细胞显示出更多变异性—可能是因为它们是异质性细胞群体，包含i)因FOXP3稳定性丧失而产生的Tet2/3 DKO前调节性T细胞和ii)主要是表现出活化或记忆表型的传统(非Treg)CD4+ T细胞(图1I，中和底部)。与WT T细胞相比，DKO-中度和DKO-重度CD4+ T细胞显示Tfh相关基因(Bcl6、Cxcr5、Pdcd1、Tox2、Maf、Batf、Ascl2、Il21、Il4、Klrb1c和Nfkb1)、Th17相关基因(Rorc、Il17a和Il17f)以及细胞周期基因(Cdkn1a、Cdkn2a、E2f7和E2f8)(数据未显示)显著上调(MA图，补充图1C, D)，表明部分Tet2/3 DKO Treg细胞已转化为具有Tfh样或Th17样表型的增殖性前调节性T细胞。
当差异表达基因被提取并在热图中聚类时(图2A)，大多数Tfh相关(Bcl6、Cxcr5、Pdcd1、Tox2、Maf、Batf、Il21和Nfkb1)和Th17相关(Rorc、Il17a和Il17f)基因在DKO-重度中的表达强于DKO-中度或WT CD4+ T细胞(热图聚类3)。相比之下，作为Tfh分化的抑制因子的Foxo1在DKO细胞中的表达低于WT(热图聚类1)。这些结果表明，Tet2/3 DKO前调节性T细胞中FOXP3表达的丢失可能导致具有类似Tfh或Th17细胞基因表达模式的前调节性T细胞扩增。
在DKO-重度小鼠的批量RNA测序和流式细胞术分析中，Tfh样细胞扩增。图2A显示了聚类的差异表达基因(DEGs)的表达热图。从Foxp3Cre WT小鼠和Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠(14周龄)的脾脏和外周淋巴结(颈部和腹股沟)中分选出CD4+ YFP(FOXP3)- T细胞，进行RNA测序(n=4)。提取并聚类DEGs，生成聚类DEGs的表达热图。标明了Tfh相关(Bcl6、Cxcr5、Pdcd1、Tox2、Maf、Batf、Nfkb1、Ascl2、Il21、Il4、Klrb1C和Foxo1)和Th17相关(Rorc、Il17a和Il17f)基因。
流式细胞术分析显示，在13-15周龄Foxp3Cre WT和Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠的脾脏和外周淋巴结(颈部和腹股沟)中，PD-1+ CXCR5+细胞(在TCRβ+ CD4+ YFP(FOXP3)+或TCRβ+ CD4+ YFP(FOXP3)-细胞上设门)数量增加(图2B)。图2C显示了TCRβ+ CD4+ YFP(FOXP3)+或TCRβ+ CD4+ YFP(FOXP3)-细胞中PD-1+ CXCR5+细胞的频率和脾脏和外周淋巴结(颈部和腹股沟)中的绝对数量。误差线显示至少三次独立实验的平均值±标准误。通过单因素方差分析进行统计分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。
图2D显示了在13-15周龄DKO-重度小鼠的脾脏和外周淋巴结(颈部和腹股沟)中，FOXP3+或FOXP3- CD4+ T细胞中PD-1+、CXCR5+或PD-1-、CXCR5-细胞上的BCL6+或ICOS+细胞的流式细胞术分析。"ns"表示"无显著性"。
在DKO-重度小鼠的脾脏总CD4+ T细胞中，经佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)/离子霉素刺激后产生IL-17A的细胞比例相对较小且可变(1%-12%，平均约5%；补充图2A左，2D)。相比之下，我们通过流式细胞术观察到DKO-重度小鼠中残留的CD4+ YFP(FOXP3)+ Treg细胞和CD4+ YFP(FOXP3)-细胞(包含扩增的前调节性T细胞)中Tfh样PD-1+ CXCR5+细胞显著且进行性扩增。在DKO-重度小鼠中，55%-65%的CD4+ FOXP3+和CD4+ FOXP3-细胞为PD-1+ CXCR5+ Tfh样细胞(范围45%-85%，图2B, C)。其中一些细胞可能来源于失去FOXP3并获得类似PD-1+ CXCR5+ Tfh样细胞基因表达模式的扩增前调节性T细胞，其他则来源于由于Treg特异性Tet2/Tet3缺失而在小鼠中发展的全身炎症中的旁观者CD4+ T细胞。在DKO-重度小鼠中，与非Tfh(PD-1- CXCR5-)细胞相比，PD-1+ CXCR5+细胞显示更高的Tfh细胞标志物BCL6和ICOS表达(图2D)；与DKO-中度或WT小鼠相比，DKO-重度小鼠脾脏中B220+细胞中Fas+ GL-7+生发中心B细胞的频率显著增加(补充图2K)，尽管总B220+细胞的频率下降(补充图2J)。我们还注意到，与WT小鼠相比，DKO-重度小鼠中经PMA/离子霉素刺激后产生IFN-γ的旁观者CD8+ T细胞频率显著增加，以及CD8+ T细胞中穿孔素和颗粒酶B表达增加(补充图2B, C, F-H)，尽管CD8+ T细胞没有总体扩增(图1H)。经PMA/离子霉素刺激后，DKO-重度小鼠中分泌IL-21的CD4+ T细胞比例显著增加(补充图2I)。
DKO-重度Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中Tfh样细胞比Th17样细胞扩增更为显著
为了确定Tet2/3 DKO前调节性T细胞主要偏向Tfh还是Th17细胞，并解决Tet2/3 DKO前调节性T细胞扩增对旁观者CD4+或CD8+ T细胞的影响，我们在WT和DKO-重度TCRβ+ T细胞中比较了单细胞水平的基因表达模式(图3)。单细胞RNA测序(scRNA-seq)在均匀流形近似与投影(UMAP)分析中区分了19个聚类(图3A)。UMAP图的左侧和右侧分别代表Cd4+和Cd8+细胞(图3B左侧)。聚类0和5中的细胞主要是WT幼稚CD4+，聚类1和2中的细胞主要是WT幼稚CD8+ T细胞，而聚类6(主要是DKO)和聚类9(主要是WT)是Treg细胞，基于Cd4和Foxp3的表达(图3B右侧，图3C)；通过流式细胞术，WT和DKO FOXP3+ Treg细胞表达相似水平的CD4和FOXP3(数据未显示)。有趣的是，Tet2/3 DKO Foxp3+ Treg细胞(聚类6)不仅表达Foxp3和其他Treg特征基因(Il2ra、Nrp1、Ctla4和Ikzf4)，还表达Tfh相关基因(Bcl6、Cxcr5、Pdcd1、Icos、Tox2、Maf和Batf)，表明向Tfh样前调节性T细胞的转化在FOXP3丢失之前已在Tet2/3 DKO Foxp3+ Treg细胞中启动(图3C)。事实上，DKO-重度小鼠中的许多FOXP3+ CD4+细胞表达Tfh标志物(图2B, D)，这表明引发Treg向Tfh偏向的Tfh相关基因的DNA甲基化变化可能早于通过流式细胞术检测到的FOXP3蛋白丢失。Treg向Tfh偏向的时间依赖性通过比较聚类6(主要是Foxp3+ DKO)和聚类3(主要是Foxp3- DKO)的细胞来说明，后者表达Tfh相关基因更强(图3C)。
虽然它们在DKO-重度细胞群的整体批量RNA测序中被清楚地检测到(图2A；补充图1D)，但Rorc和Il17a/Il17f表达在Tet2/3 DKO细胞的scRNA-seq中几乎未被检测到(图3C)，这表明Th17细胞在Tet2/3 DKO前调节性T细胞中不是一个主要群体。与DKO-重度小鼠中CD4+细胞中IFN-γ+细胞(可能是Th1细胞)的比例降低而非增加(补充图2A右侧，2E)；在其他模型中，前调节性T细胞已被报道具有Th1特征(12, 14, 17)。与WT或DKO-中度小鼠相比，DKO-重度小鼠中的CD8+ T细胞显示出细胞毒性功能增加，通过scRNA-seq检测Tbx21、Ifng、颗粒酶(Gzma、Gzmb、Gzmk和Gzmm)以及编码穿孔素的Prf1(图3C，scRNA-seq表达图中的聚类8)，这与IFN-γ、颗粒酶B和穿孔素的流式细胞术检测结果一致(补充图S2B, C, F-H)。
由于Foxp3Cre表达被认为存在"渗漏"(37, 38)，我们询问了Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中的Tfh细胞是否表达或已丢失Tet2。我们通过qPCR测量了WT和Foxp3-Cre Tet2/2fl/fl小鼠中Treg和Tfh细胞的Tet2表达，以确定Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中的Tfh细胞是否来源于Tet2/3缺陷的前调节性T细胞(补充图S3A, B)。DICE(免疫细胞表达、表达数量性状位点(eQTLs)和表观基因组数据库)项目数据显示，当比较WT Tfh细胞和其他WT CD4+ T细胞(包括非活化幼稚、Th1、Th2、Th17和Treg细胞)时，Tet2和Tet3 mRNA表达几乎没有差异( Treg细胞相比，FOXP3+ Tet2/3 DKO Treg细胞如预期未检测到Tet2表达(补充图3A)，而DKO-中度和DKO-重度Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠的Tfh细胞与WT CD4+非Treg细胞、不表达Tfh表面标志物的CD4+细胞(非Tfh)和幼稚CD4+细胞相比，Tet2表达水平显著降低和不可检测(补充图3B)。DKO-重度小鼠的Tfh细胞中Tet2表达特别降低(补充图3B)，这表明DKO-重度Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中几乎所有Tfh细胞都来源于Tet2/3 DKO前调节性T细胞，或者Foxp3缺失前体细胞中Tet2的随机丢失也使它们的分化偏向Tfh细胞。事实上，总Tet2/3缺陷CD4+ T细胞的分析显示PD-1+ CXCR5+ Tfh细胞数量增加(补充图3D)。在每种情况下，我们预测TET活性的短暂降低可能对Tfh的最佳发育是必要的。
为了确认Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中Tfh细胞的(前)Treg来源，我们进行了命运图谱研究。我们使用Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl Rosa26-YFPLSL小鼠品系分析了从Rosa26位点表达YFP的Tfh细胞的比例，其中Cre+ Treg细胞也从Rosa26位点表达Rosa26-YFP。该品系中的Treg细胞还表达Foxp3基因中编码的YFP-Cre融合蛋白；然而，如前所述(33)，从Rosa26位点表达YFP的细胞(表达Treg和前调节性T细胞)可以通过其高YFP强度与仅在FOXP3+ Treg细胞中低强度表达的YFP-Cre融合蛋白区分开来。我们进一步用抗FOXP3染色细胞，以排除FOXP3- Tfh细胞分析中的Treg细胞。在DKO-重度小鼠中，几乎所有FOXP3- Tfh细胞(PD-1+ CXCR5+在CD4+ FOXP3- T细胞中)都是Rosa26-YFP表达细胞，表明它们是前调节性T细胞(补充图3E)。Rosa26-YFP+ Tfh细胞的比例在杂合(Tet2/3fl/+)小鼠和DKO-中度小鼠中降低，表明在杂合Tet2/3fl/+小鼠中向Tfh样前调节性T细胞的转化频率较低，并随着小鼠从Tet2/3fl/fl Foxp3Cre中度表型进展到DKO-重度表型而增加(补充图3E)。
DKO-重度Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠次级淋巴组织中浆细胞和Tfh细胞的扩增
如前所述，尽管活细胞中T细胞(TCRβ+细胞)的比例下降，但DKO-重度Foxp3Cre Tet2/3fl/fl小鼠中T细胞的绝对数量增加(图1D)。类似地，DKO-重度小鼠脾脏和外周淋巴结中最扩增的细胞群是TCRβ- B220-群体(~70%)(图4A)，其中包含CD11b+ Gr-1+中性粒细胞(图4B左侧，4C)以及CD98+ CD138+浆细胞扩增群体(图4B右侧，4D)。我们将Foxp3Cre Tet2/3fl/fl小鼠中浆细胞的扩增归因于扩增的Tet2/3 DKO前调节性T细胞的Tfh活性，这预计会促进生发中心中的B细胞活化和浆细胞分化。
我们对Tfh样Tet2/3 DKO前调节性T细胞和浆细胞进行了免疫染色分析。在图4E中，WT或DKO-中度小鼠的脾脏中存在清晰的T细胞和B细胞区域(以及生发中心；数据未显示)，但这些结构在DKO-重度小鼠中被破坏(图4E，顶部)。在WT的T细胞中，CD4+ T细胞与CD8+的比例没有明显差异，WT脾脏中几乎没有ICOS+细胞(图4E，左中和底部)；相比之下，DKO-中度和DKO-重度脾脏中CD4+细胞和ICOS+细胞的比例略有增加并在DKO-重度中显著增加(图4E，右两面板，中和底部)，位于T细胞-B细胞边界区域。ICOS是Tfh细胞的一个明确标志物；鉴于DKO-重度小鼠中相当数量的Tet2/3 DKO Treg细胞尚未失去Foxp3但表达Icos(图3C中的聚类6)，Tet2/3 DKO前调节性T细胞转化为表达ICOS的Tfh样前调节性T细胞是一个可能的解释(见讨论)。
在图4F中，我们使用IRF4作为浆细胞标志物。WT和DKO-中度脾脏中观察到IRF4+细胞簇，但其数量和范围有限(图4F，左两面板)。相比之下，IRF4阳性细胞在DKO-重度小鼠的脾脏中广泛分布(图4F，右面板)，这与这些小鼠脾脏中CD98+ CD138+浆细胞的频率和绝对数量增加一致(图4B右侧，4D)。脾脏切片中FOXP3- Tfh样细胞和浆细胞的绝对数量在Tet2/3 DKO-重度表型小鼠中与WT小鼠相比也显著增加(图4G)。
最后，我们通过自身抗体阵列检测测试了从WT(n=8)、DKO-中度(n=3)和DKO-重度小鼠(n=4)中分离的血清的多反应性，并观察到与自身免疫疾病相关的自身抗体水平升高(补充图4)。各组之间的检测使用R包"limma"进行，并进行了多重比较校正(调整后的p值<0.05)。与浆细胞扩增一致，与WT或DKO-中度小鼠相比，DKO-重度小鼠中许多自身抗体的水平在不同程度上但显著升高；不同小鼠显示出不同的自身抗体产生模式(补充图4)。
DKO-重度Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠多种组织中的强烈炎症和自身免疫反应
我们对WT、DKO-中度和DKO-重度小鼠进行了多组织尸检分析，以使用我们的炎症评分(0-5)评估来自胰腺、结肠、骨骼肌、心脏、肝脏、肺、唾液腺、脑、膝关节和胃的苏木精-伊红(H&E)染色样本的炎症程度。虽然我们没有进行临床病理评估来评估组织功能，但我们观察到DKO-重度小鼠的肾脏、肝脏、肺和胰腺中存在强烈炎症和淋巴细胞浸润(图5A；补充图5)。在组织学上，WT和DKO-中度小鼠的肾脏中，浸润物缺失或仅限于稀疏的淋巴细胞和巨噬细胞，而DKO-重度小鼠则表现出明显的皮质间质浸润，富含浆细胞，特别是在肾静脉周围区域，偶尔延伸至尿路上皮。虽然未观察到尿路上皮溃疡，但上皮浸润可能破坏上皮屏障功能。在DKO-重度小鼠的肝脏中，大量淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞扩增门周区域并填充肝窦。在严重受影响的肝脏中，估计高达20%的组织切片被浸润细胞占据。然而，在部分肝切除实验中，约75%的小鼠肝脏可以切除而不影响功能(39)，这表明小鼠可能未经历肝功能不全。在肺部，DKO-中度小鼠具有以淋巴细胞为主的血管周围和支气管周围混合浸润，与诱导性支气管相关淋巴组织(BALT)一致，在DKO-重度小鼠中更为广泛，形成具有增加浆细胞含量的致密套。有趣的是，诱导性BALT的存在尚未显示阻碍肺功能，在其他情况下可能通过减轻炎症来改善肺功能(40)。在胰腺中，DKO-中度小鼠偶尔表现出胰岛淋巴细胞浸润，无统计学意义，这可能表明某种程度的内分泌胰腺功能不全(41)。DKO-重度小鼠的胰腺被浆细胞、淋巴细胞和巨噬细胞密集浸润；在最受影响的病例中，这种免疫浸润完全破坏了正常的胰腺结构(补充图5)，几乎确保了内分泌和外分泌功能不全的存在(42)(补充图5)。
为了确定浸润DKO-重度小鼠肝脏中血管周围区域的细胞类型，我们对肝脏切片进行了免疫染色。WT和DKO-中度小鼠的肝脏显示出少量CD3ϵ+细胞浸润(图5B，左两面板)，这些细胞不表达ICOS，表明这些T细胞不是Tfh样细胞(图5B，中面板；图5C，顶部)。然而，在DKO-重度小鼠肝脏的血管周围区域，观察到CD3ϵ+ ICOS+细胞、B220+细胞和IRF4+细胞(图5B，右底部面板；图5C)；只有少数或没有Tet2/3 DKO CD3ϵ+ ICOS+ Tfh样细胞表达FOXP3。IRF4+细胞是我们在脾脏中已经注意到的浆细胞(图4)。这些结果共同表明，Tet2/3 DKO Tfh样前调节性T细胞和浆细胞在次级淋巴组织中增殖并迁移到外周组织，可能直接加剧炎症。
Tet2/3 DKO Tfh细胞中Bcl6上调与Bcl6基因座同时高甲基化
TET酶在增强子处沉积5hmC，以维持它们处于活性、低甲基化状态(43, 44)。我们使用6碱基测序方法检查了14周龄WT小鼠的幼稚CD4+ T细胞(CD4+ YFP(FOXP3)- CD62Lhigh CD44low)和Tet2/3 DKO-重度小鼠的Tet2/3 DKO Tfh样前调节性Tfh样细胞(CD4+ YFP(FOXP3)- PD-1+ CXCR5+)中的DNA胞嘧啶修饰模式，该方法在单次测序运行中提供关于四个标准碱基—A、C、G和T—以及修饰碱基5mC和5hmC的信息(45)(图6；补充图6)。结果显示，甲基化变化与基因表达变化相关并可能调节基因表达的方式多种多样。
BCL6被公认为Tfh细胞的谱系定义转录因子(46-52)。我们观察到，与幼稚CD4+细胞(称为WT)相比，DKO-重度中Tfh样前调节性T细胞中Bcl6 mRNA表达显著增加(补充图1D；图2A，3C)，与Bcl6基因第一内含子区域中出人意料的甲基化显著增加相关(图6A，5mC轨道1-3和RNA-seq轨道4和5)。在Bcl6启动子处未观察到显著变化，该启动子在WT幼稚CD4+ T细胞中已位于DNA去甲基化的宽"峡谷"内(图6A，5mC轨道1)。两项先前研究可能解释了为什么意外的5mC增加与基因表达增加相关：CTCF通过CTCF染色质免疫沉淀(ChIP)-seq结合到Bcl6基因的同一第一内含子区域(54)，在人类B细胞淋巴瘤细胞系中，CTCF结合减少与该区域高甲基化和Bcl6表达增加相关(55)。小鼠CD4+ T细胞和Treg细胞不表达BCL6，并在该内含子区域内外显示高CTCF结合(54)(图6A中显示小鼠CD4+ T细胞，ChIP-seq轨道6和7)。基因体(基因的转录区域)中的5hmC水平与基因表达密切相关(56)，在Bcl6中未显示：5hmC在不表达BCL6的幼稚T细胞("WT"在图6A中)以及TET活性非常低的Tet2/3 DKO细胞中低至不可检测。
我们还检查了Foxo1基因中5mC/5hmC的分布，Foxo1是小鼠中Tfh分化的已知抑制因子(48, 52)。Foxo1 mRNA在WT幼稚CD4+ T细胞中高表达，但在DKO-重度小鼠的FOXP3-前调节性T细胞中下调(图6B，RNA-seq轨道5和6)—与批量和scRNA-seq中观察到的Tfh相关基因上调一致(补充图1D；图3)。WT T细胞中高Foxo1表达与Foxo1基因体中高5hmC和相对低5mC相关(图6B，5mC轨道1-3和5hmC轨道4)；Foxp3-Cre Tet2/3 DKO T细胞中低至不可检测的5hmC水平未显示。FOXP3- Tet2/3 DKO前调节性T细胞中Foxo1 mRNA表达下调与Foxo1基因中转录起始位点(TSS)3'端启动子"峡谷"边缘的甲基化增加相关(图6B；5mC轨道1-3)，这在Tet缺陷细胞中先前已被注意到。因此，与Bcl6的发现不同，Tet2/3 DKO T细胞中Foxo1 TSS 3'端的甲基化增加遵循预期的范式，即基因表达减少与调控区域内或边缘以及基因转录体中的DNA甲基化增加相关。
TOX2、MAF和BATF都是已知促进Tfh分化的转录因子(47, 48, 57, 58)，与WT小鼠相比，所有这些转录因子在DKO-重度中的表达都强烈上调(图2A；补充图1D，6，比较RNA-seq轨道)。然而，我们再次未观察到这些基因中表达变化与DNA甲基化(5mC)变化之间的简单相关性。虽然Tox2 TSS在WT和Tet2/3 DKO细胞中基本去甲基化，但我们在Tet2/3 DKO与WT细胞相比的TSS附近和Tox2基因跨区观察到甲基化增加，特别是在第一、第二和第三内含子中的假定调控区域(补充图6A)；这再次与甲基化增加(特别是靠近假定增强子或TSS)与基因表达减少相关的简单假设相矛盾，并表明间接效应。相比之下，Maf基因的5' UTR在WT或DKO细胞中均无甲基化，但基因体中甲基化减少；Maf基因的注释可能不正确，因为转录似乎在注释的5' UTR的5'端开始(补充图6B)。对于Batf，我们在不同区域观察到甲基化增加和减少，尽管RNA表达明确增加(补充图6C)。这些复杂变化将在下文讨论。
讨论
我们先前表明，TET缺陷的Treg细胞由于TET活性丧失、保守内含子CNS1和CNS2增强子的甲基化增加以及FOXP3稳定性降低而失去FOXP3表达(28)，导致Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠出现类似自身免疫的症状(28, 33)。尽管发作时间可变，但疾病完全外显且在6个月内致命(33)。在本研究中，我们根据14周龄时脾脏中淋巴细胞总数将Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠定义为DKO-中度和DKO-重度；这些小鼠分别代表疾病进展的早期和晚期阶段。通过比较DKO-中度和DKO-重度小鼠的表型，我们发现Foxp3-Cre Tet2/3 DKO小鼠的FOXP3-前调节性T细胞表现出多器官炎症的进行性、时间依赖性增加，基于活化表型T细胞的显著扩增以及组织学和免疫组织化学显示脾肿大、淋巴结病以及淋巴细胞向肾脏、肺和肝脏浸润增加。Tet2/3 DKO小鼠的缓慢增加炎症表型与人类复杂自身免疫/炎症性疾病(如系统性红斑狼疮(SLE))患者的表型相似，在这些患者中，自身免疫症状可能以不同方式表现，并可能通过多次缓解和复发周期而改善和恶化。
在DKO-中度和DKO-重度Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中观察到的炎症缓慢增加可以通过我们先前的发现来解释，即与WT细胞相比，这些小鼠的Treg细胞以时间依赖性方式失去抑制活性。例如，与WT相比，Tet2/3 DKO(与WT相比)骨髓细胞挽救新生scurfy小鼠的剧烈炎症和致命炎症表型的能力降低(33)。此外，将Tet2/3 DKO CD4+ T细胞(包括Treg细胞和前调节性T细胞)转移到具有正常功能性Treg细胞库的免疫活性小鼠中，导致受体小鼠中旁观者T细胞的活化和扩增增加，这表明即使在具有正常Treg功能的免疫活性小鼠中，Tet2/3 DKO细胞也能够赋予显性炎症表型(33)。
值得注意的是，通过流式细胞术和免疫组织化学判断，DKO-重度Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠显示表达Tfh标志物(PD-1、CXCR5和ICOS)的CD4+ T细胞的频率和绝对数量显著增加。这些小鼠的CD4+ T细胞(包括FOXP3- "前调节性T细胞"和传统活化CD4+ T细胞)与WT小鼠的CD4+ FOXP3-细胞相比，显示IL-21转录和分泌增加以及Tfh相关基因表达增加，基于刺激细胞的流式细胞术以及批量和单细胞RNA测序。小鼠还显示次级淋巴组织和外周组织中浆细胞的总数和频率进行性增加，在DKO-重度小鼠中尤为明显。此外，DKO-重度表型小鼠显示循环自身抗体显著增加，尽管检测到的确切自身反应性有所不同。Tfh细胞为生发中心B细胞提供帮助，然后分化为浆细胞，而驻留在炎症组织中的浆细胞在慢性炎症和系统性自身免疫疾病中产生抗体。在Tet2/3 DKO小鼠中确实观察到自身抗体产生增加，尤其是被归类为DKO-重度的小鼠。细胞毒性CD8+ T细胞表达高水平穿孔素和颗粒酶B的平行增加可能是由于产生IL-21的Tfh样细胞的出现，这在抗肿瘤免疫或病毒感染中已被证明通过上调IFN-γ和颗粒酶B等关键分子来诱导CD8+ T细胞的细胞毒性效应功能(59, 60)。
相比之下，DKO-重度Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中经刺激后表达IL-17的CD4+细胞频率非常低，并且随着疾病进展，IFNγ+细胞频率下降。批量RNA测序表明，所检查的四只小鼠中只有一只表达了显著的基础IL-17或Rorc水平，并且通过附加到每个细胞的序列条形码(允许我们区分WT和DKO细胞)的scRNA-seq在CD4+ FOXP3- Tet2/3 DKO T细胞中检测到的Rorc表达细胞非常少(范围0.2%至3%)。由于这些小鼠中的CD4+细胞包括FOXP3- "前调节性T细胞"和传统活化CD4+ T细胞，变异性可能反映了这两种细胞类型相对比例的差异。对聚类3(主要是DKO前调节性T细胞的Tfh样细胞聚类)的分析显示，只有1.5%的DKO细胞表达Rorc。综合数据表明，Rorc的表达不如Tfh标志物高，并且在Tfh样前调节性T细胞中表达较差。这一发现与先前报道一致，即BCL6和TOX2等Tfh相关转录因子抑制Rorc表达和Th17分化(48, 57, 61, 62)。
TET蛋白的生化活性如何导致自身免疫疾病？答案可能在于任何给定细胞类型中对TET活性丧失最敏感的基因。TET蛋白的主要生化效应是在基因启动子、转录区域(基因体)、增强子和其他调控区域维持低水平的DNA甲基化。基因表达的变化明显与基因体内外基因周围区域中DNA甲基化的异常(通常是微妙的)变化相关—转录起始位点或假定内含子增强子周围的去甲基化区域边缘的5mC增加。其中一些去甲基化区域符合"峡谷"的定义，在其他系统中，这些区域在与细胞谱系特化密切相关的基因附近被观察到(53)。然而，值得注意的是，DNA甲基化变化和基因表达之间并不总是存在明确的联系。例如，我们观察到Bcl6基因第一内含子中5mC的显著积累，与Bcl6 mRNA表达增加相关(图6A)。这一发现不支持增加的DNA甲基化总是抑制基因表达的范式。我们的数据支持高甲基化干扰人类和小鼠Bcl6基因内含子区域中CTCF结合的假设(54, 55, 63, 64)。与WT T细胞相比，具有20%-30%残余Tet2基因表达的老年(中年)Tet2gt基因捕获低表达小鼠的CD4+ T细胞显示Tfh细胞扩增，Bcl6基因的同一内含子区域高甲基化(63, 64)。同样，Raji人类B细胞淋巴瘤细胞与表达较低BCL6水平的H929浆细胞瘤细胞相比，显示BCL6表达增加、内含子高甲基化和CTCF结合减少(55)。潜在地，CTCF结合到未甲基化的内含子区域在远端增强子(或TAD边界)和基因启动子之间形成屏障，如在印记基因和某些癌基因中所示(65)；高甲基化导致CTCF结合减少和基因表达增加。
相比之下，Foxp3-Cre Tet2/3 DKO CD4+ T细胞中FOXO1表达减少显示了与FOXO1基因转录区域跨区甲基化增加的"预期"相关性。此外，DKO-重度小鼠中FOXO1的几乎完全丢失与Foxp3-Cre Tet2/3 DKO小鼠基因组中5hmC的几乎完全丢失相关；5hmC的存在是正在活跃转录的基因的最佳标志物之一。FOXO1和RUNX1相关转录因子RUNX2和RUNX3是小鼠中Tfh分化的已知抑制因子(48, 52)：FOXO1与TET2协调介导Runx2和Runx3基因的去甲基化和表达(66)。SMARTA TCR转基因小鼠(特异性针对淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)GP66-77表位)的Tet2缺陷CD4+ T细胞在LCMV感染后表现出向Tfh细胞的优先分化，而不是像病毒感染的野生型小鼠中那样主要分化为Th1细胞(66, 67)；这与Runx2和Runx3启动子的去甲基化失败以及Runx2和Runx3 mRNA表达降低相关(66)。在我们自己的研究中，DKO-重度CD4+ FOXP3阴性前调节性T细胞中Runx2/3启动子的DNA甲基化增加，但与WT细胞相比，Runx2/Runx3 mRNA表达未改变(数据未显示)。FOXO1可能单独作用而不需要RUNX2和RUNX3；或者，因为FOXO1对T细胞静息至关重要(68)，在通常静息的Treg细胞中FOXO1表达降低将促进它们在Foxp3-Cre Tet2/3 DKO小鼠中的增殖，同时BCL6和其他Tfh谱系程序效应物的表达增加将导致Tfh偏向。
在DKO-重度小鼠中，尚未完全失去FOXP3的FOXP3+ Treg细胞以及FOXP3-细胞中都观察到Tfh群体的扩增。我们推断Tfh分化过程在FOXP3完全丢失之前已在FOXP3+ Treg细胞中启动。然而，我们不能排除传统CD4+ T细胞也发生Tfh偏向的可能性—Tet2 KO幼稚CD4+ T细胞在LCMV感染后表现出向Tfh分化的细胞内偏向，Th1分化受损(66, 67)，并且TET缺陷在体外抑制幼稚细胞向Th1、Th2和Th17的分化(69)。在造血发育过程中以低随机水平发生的Foxp3-Cre的"渗漏"表达(37, 38)也可能是Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中一些异常谱系指定的原因。为了解决这个问题，我们正在实施一种新的前调节性T细胞发育策略，其中从CD4-Cre Tet2/3fl/fl小鼠(在其他谱系中TET缺失不渗漏)中纯化的Treg细胞被过继转移到新的受体小鼠中(K. Suzuki，未发表)。
我们先前报道，在CD4-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中，iNKT细胞的扩增需要抗原刺激，因为它在缺乏非经典MHC蛋白CD1d(向iNKT细胞呈递脂质抗原)的小鼠中未发生(34, 70)。此外，我们观察到在CD4-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中，真正的定居Tfh细胞表现出显著扩增。Tet2/3 DKO前调节性T细胞显示克隆扩增增加(33)；事实上，对体内遇到的信号作出反应的特定细胞类型的增殖是TET缺陷小鼠模型中反复出现的特征(34, 70, 71)，TET2功能缺失突变在人类造血癌症中经常被观察到(43, 72)。由于TET蛋白在胸腺Treg分化中发挥重要作用，TET缺陷可能与Foxp3-Cre Tet2/3fl/fl小鼠中自身反应性CD4+ FOXP3+ T细胞的出现有关。因此，胸腺中自身反应性Tet2/3 DKO Treg可能扩增并在外周产生Tfh样前调节性T细胞克隆，这可能导致Foxp3-Cre Tet2/3 DKO小鼠中自身反应性Tfh细胞和自身抗体产生浆细胞的扩增。不同小鼠中不同自身反应性克隆的随机出现可能有助于Foxp3-Cre Tet2/3 DKO小鼠的可变自身免疫表型。
总之，由于TET功能缺失导致的DNA甲基化增加如何导致基因表达变化、谱系偏向和炎症的机制仍不清楚。基因表达受到对每个基因特定的远端、近端或内含子增强子/调控区域的转录调节因子结合变化的强烈影响。因此，要深入理解DNA甲基化变化对基因调控和谱系指定的影响，有必要识别调控每个差异表达基因表达的转录调节因子，并剖析启动子、增强子和基因体中的DNA甲基化如何影响这些调节因子与基因启动子和增强子的结合。在人类中，增强子活性的变化可以追溯到全基因组关联研究(GWAS)中识别的假定增强子中的单核苷酸多态性，这表明值得研究人类自身免疫疾病中DNMT/TET活性和调控的变化，以及DNA甲基化的变化。这尤其有趣，因为GWAS中频繁的C>T转换被认为反映了在进化过程中甲基化CA和CpG序列的脱氨基(73, 74)。
最近，TET2被确定为年龄相关克隆性造血[ARCH或CH，也称为意义未明的克隆性造血(CHIP)]中第二常见突变(仅次于DNMT3A)(75)。在CH中，体细胞TET2突变导致造血干细胞(HSC)克隆扩增。TET2缺陷的HSC表现出增强的自我更新能力和克隆扩增的髓系偏向。此外，TET2缺陷的髓系细胞通过产生IL-1β等炎症细胞因子促进慢性炎症，研究表明CHIP个体患动脉粥样硬化和心血管疾病的风险增加(76, 77)。事实上，与同龄健康对照相比，SLE和RA患者中CHIP的患病率更高(78, 79)。特别是在类风湿关节炎(RA)中，已观察到晚发型疾病的亚群，60岁以上患者发病。由TET2或DNMT3A缺陷驱动的年龄相关CH/CHIP可能有助于晚发型自身免疫疾病的发展。
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