EXPERIMENTAL CEREBRAL INFARCTION: RETRO ORBITAL, EXTRADURAL APPROACH FOR OCCLUDING THE MIDDLE CEREBRAL ARTERY*
摘要
对于从事脑血管疾病研究的人员而言，建立一套无手术伪影的实验性脑梗死模型显然十分必要。此前用于制备脑梗死的各种手术方法均未能符合我们认为理想实验模型应满足的标准。为此，我们开发了一种经眶后间隙的硬膜外入路，利用Zeiss手术显微镜暴露大脑中动脉。下文将详细描述该技术，并说明其在制备脑梗死方面的有效性。
技术方法
实验性梗死的制备
——该技术适用于多数实验动物，以下以猫为例详述方法。动物经胸膜腔内注射戊巴比妥（25 mg/kg）浅麻醉。气管插管后，术区剃毛并用六氯酚（pHisoHex）消毒。头部置于头固定器并铺单。
使用Bovie电刀从头部中线至颧弓做线性切口（图1）。用创口夹将皮肤及浅层头皮肌边缘牢固固定于铺单上，以防渗血。用电刀将软组织与眶缘骨质前后分离。用咬骨钳切除眶缘及部分颧弓。用软骨蜡填塞骨粗糙边缘以防止少量出血。
于颞肌上做弧形切口，从眶上缘至颧弓后部。此时可在肌浅筋膜中识别颞动脉，电凝该动脉以减少失血。再次使用电刀分离颞肌的两层。经肌肉可触及下颌骨冠突的骨性突起，用咬骨钳切除。
前后剥离骨膜。务必确保骨膜向前充分游离，因为该层组织与眶周筋膜共同维持眶内容物的连续性，从而可将其向前移位而不损伤眼球，且避免眶周软组织脂肪突入术野。骨膜抬起后放置自动牵开器。
在颞骨上钻一个小骨孔，扩大骨窗至蝶骨翼（图2）。骨窗扩大是主要出血来源；通过尽量远离中线并频繁使用小块骨蜡可将出血量降至最低。硬脑膜保持完整，但由于这些动物的硬脑膜较薄，透过硬脑膜可见皮层浅表血管。
余下步骤使用配备200 mm物镜和×20目镜的Zeiss手术显微镜，并在后续操作中将放大倍数调至6倍。用弯咬骨钳切除蝶骨翼。脑膜中动脉经该骨进入颅中窝，其入口位置多变但易于识别。在骨硬膜侧及其起源的眶侧以低电流电凝该动脉。蝶骨翼切除直至视神经。视神经上方硬脑膜内有多条小脑膜血管，亦应以极低电流在距神经硬膜鞘起始部较远处电凝。
随后将手术显微镜放大倍数调至10倍。用11号刀片在视神经鞘起始处切开硬脑膜，向前延伸约1 cm。此时脑脊液涌入术野，以极轻柔的吸引缓慢吸除。
再将手术显微镜放大倍数调至16倍。透过硬脑膜切口可见覆盖Willis环主要血管的极细蛛网膜组织。用11号刀片分离此半透明网状组织。若使用新刀片，蛛网膜阻力极小，通常仅切取所需组织。此步骤无出血。
去除蛛网膜组织后，可较容易地抬起大脑中动脉的襻，后者于中线附近起自颈内动脉。颈内动脉和大脑中动脉均沿视神经走行，但方向不同（图3）。用一枚小型Mayfield夹（或其他适当大小的动脉夹）横跨整个大脑中动脉进行夹闭。
可通过调整手术显微镜角度并观察夹子内血管全程来确认闭塞是否成功。夹子远端常可见白色血栓形成并向大脑中动脉第一分支延伸。透过完整硬脑膜在手术显微镜下观察皮层浅静脉的血流速度降低，亦可作为动脉完全闭塞的佐证。
整个过程中无脑组织牵拉；眶内容物被向前移位。操作完成后仅Mayfield夹的钳口靠近脑组织，夹子其余部分位于硬膜外、眶软组织中，不构成对脑的硬膜外压迫。此外，避免了Willis环附近小穿支血管的牵拉，且若夹子放置恰当，不会闭塞这些血管。
若动物用于皮质血流短期研究，则需额外切开阔叶半球表面的硬脑膜并分开移除。若用于长期研究，则冲洗伤口并分三层缝合。日后可重新打开大脑凸面的硬脑膜以观察并拍摄浅表微血管系统。
梗死体积的估算
猫于大脑中动脉闭塞后5至7天处死。处死前对大脑进行活体观察，并通过头臂动脉灌注10%福尔马林。大脑在10%福尔马林中固定数日，然后用成型斜角切割盒（图4）切片，获得相对均匀的冠状切面。
每张切片上梗死区域在照片（图5）上用求积仪测量。采用平均端面积法估算梗死体积：将单一切片两面的梗死面积相加，除以2，再乘以切片厚度。然后将所有单片体积相加得到整体梗死体积估算值。运用相同方法计算大脑切片总体积。
为比较不同动物间梗死大小，需引入校正因子，因为照片尺寸略有差异且脑体积存在微小差别。切片在照片中的位移经量筒测量为20至25 ml。我们统一以25 ml作为参照标准。将每份标本照片切片的总计算体积除以25得到校正因子，然后乘以计算得到的梗死体积（通常在0.90至1.10之间），最终值称为“校正梗死体积”。
结果
失血与低血压
——该入路在8只猫上进行了开发。在这些动物及其他用于短期研究的动物中，通过股动脉内置管监测全身血压。平均血压稳定在100至120 mm Hg之间，术中未见下降。对纱布进行称重，并估算吸引管内的血量。这些动物的最大失血量介于5至10 ml之间。后续动物失血量未超过此数值，尽管在技术初步开发后仅做了粗略估算。
脑梗死的产生
——对16只猫进行了大脑中动脉闭塞。所有动物均出现脑梗死的临床证据：明确的对侧肢体无力与痉挛、向病灶侧绕圈以及警觉性降低。总体而言，神经功能缺损的程度与内囊受累程度的相关性大于与后续大体观察梗死大小的相关性。然而，动物的反应能力似乎与梗死体积关系更密切。
在处死时表面可见梗死的动物中，梗死周围区域小血管显著扩张。然而，越靠近梗死中心，扩张血管越少，甚至可见任何血管的数量都明显减少。此外，浅表血管内血流速度显著降低，表现为血流成分的缓慢移动（“颗粒状血流”或“淤滞”）。
全部16只动物在病理检查时均检出脑梗死。梗死体积各异，各动物校正梗死体积的变异范围见表格。同时，梗死位置也有所不同：部分动物梗死位于中线附近深部基底节区，部分则延伸至浅表皮层。
表格：16只猫的校正梗死体积| 动物 | 梗死体积 (cm³) | 动物 | 梗死体积 (cm³) |
|---|---|---|---|
| CIC | 3.89 | C10C | 3.10 |
| C2C | 0.86 | C11C | 2.02 |
| C3C | 1.31 | C12C | 2.98 |
| C4C | 2.90 | C26C | 1.63 |
| C6C | 6.50 | C27C | 5.04 |
| C7C | 3.04 | C28C | 0.53 |
| C8C | 3.47 | C52C | 5.85 |
| C9C | 1.08 | C53C | 8.60 |
讨论
实验模型的标准
——为使实验动物脑梗死尽可能接近临床情况，应满足以下标准：
- 制备梗死时无显著失血或低血压。
- 避免脑组织的牵拉或操作。
- 保持硬脑膜完整，以免对伴随的脑水肿造成人为减压。
- 大脑中动脉的穿支以及其他可能充当侧支供血的小血管不应受损。
- 除用于产生梗死的闭塞血管外，其他较大血管的操作应尽量减少。
我们认为本入路符合上述标准。所有动物在夹闭动脉后均出现梗死，尽管无低血压。因此，它可能比某些已报道的方法更有效。本文仅提及16只猫的结果；我们已将该技术用于另外60只猫以评估不同治疗方式。稍加修改即可轻松适用于狗；我们还将其用于45只松鼠猴和5只恒河猴的脑梗死研究。
梗死大小与位置的可变性
——每只动物在闭塞大脑中动脉后均出现梗死，但梗死大小和位置个体差异显著。这与术中全身血压变化或失血量无关。差异可能源于血管解剖结构以及闭塞动脉正常供血区域侧支血流潜在与实际流量的不同。推测梗死发生在侧支灌注不足的区域，而梗死较小者侧支供血更发达。由于存在可变性，使用本实验模型评估治疗方式时，需要进行统计学分析并比较动物组间的梗死体积。
与临床情况的比较
——显而易见，任何依赖于暴露和操作脑部主要血管来制备脑梗死的手术技术都无法完全模拟人类临床情况。本实验模型与患者之间不可避免的差异包括：
- 在人类非栓塞性血管疾病中，通常经过数年的缓慢发展形成主要或次要血管的狭窄，导致：(a) 侧支供血渠道的建立；(b) 受累血管血流量的逐渐减少。而在本研究中，是在一个原本无疾病的血管系统上造成急性、突然的血管闭塞。
- 不同物种间，大脑表面及内部血管吻合程度以及Willis环的形态存在显著差异。
- 不同物种间，脑血管的神经源性控制可能存在显著差异，导致对突然血管阻塞的反应不同。
- 不同物种间，凝血机制以及血液本身对血流速度降低的反应可能存在显著差异。
这些困难不易克服。尽管如此，我们认为本技术确实提供了适合研究脑梗死自然发展史以及研究脑梗死治疗与改善的实验模型。
总结
虽然实验性脑梗死的制备无法完全复制临床情况，但一个合适的实验模型至少必须满足某些标准，包括：无显著失血和低血压，无脑组织牵拉和操作，硬脑膜保存完好，以及避免不必要地操作或损伤血管。本文描述的经硬膜外入路使用手术显微镜暴露大脑中动脉的方法符合这些标准。暴露后，用夹子或钳子闭塞动脉。在猫、松鼠猴和恒河猴中，该方法总能产生大小和位置多变的脑梗死。该技术也应适用于狗及其他动物。可对由此产生的梗死进行短期或长期研究，包括其形成、演变及治疗。
参考文献
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