对呼吸与疾病之间联系的理解可以追溯到两千多年前，当时希波克拉底在其关于呼吸气味的报告中描述了口臭（fetor oris）和肝臭（fetor hepaticus）（1）。自那时起，对呼出气体中的挥发性有机化合物（VOCs）及其在疾病生理学中的作用的研究取得了指数级的进步。VOCs可以来自身体的不同部位，通过血液运输并在肺部交换到空气中。由于这些VOCs源自体内的代谢过程，因此它们有可能作为评估个体健康状况的无创生物标志物（图1）。
图1：VOCs可用作评估个体健康状况的无创生物标志物。
过去几十年来，呼吸采样和分析技术的迅速发展使得呼吸测试在临床环境中的成功部署成为可能。这包括用于哮喘的呼出一氧化氮（FENO）、用于胃部幽门螺杆菌感染的13C-尿素测试，以及用于诊断小肠细菌过度生长（SIBO）或乳糖不耐受等碳水化合物吸收不良的氢-甲烷测试（2-4）。为了加速生物标志物发现向临床应用的转化，并开发适用于更广泛疾病的测试，进行动物模型研究至关重要。
需要标准化的方法
在呼吸研究中，VOC生物标志物的发现、验证和临床转化过程中仍存在若干挑战。其中一个显著的难题是采样和分析的标准化，以确保区分人体呼出气体中的化合物与背景污染。此外，由于饮食、环境和个人代谢差异等多种外部和内部来源的变异性，旨在区分疾病组和对照组VOC标记的临床试验需要大量参与者，以确保足够的统计能力来考虑这些协变量。这一要求不仅增加了临床研究的成本和持续时间，还增加了数据分析的复杂性，因为样本储存时间等因素可能会引入额外的变异性。
体内研究用于生物标志物验证
小鼠模型在加速识别和验证用于临床使用的呼吸生物标志物方面具有高度优势和必要性，原因有以下几点。首先，小鼠模型在实验室中严格控制的环境中饲养，最大限度地提高了标准化并减少了背景和饮食摄入变化的影响。其次，使用近交系小鼠可以减少个体间的变异性，这是人类呼吸研究中难以克服的一个挑战。第三，微生物组产生大量可检测到的VOCs，但在小鼠模型中控制微生物组组成相对简单，使其成为生物标志物验证的理想选择。
最近，开发了一种新的临床前方法，用于在实验室中收集小鼠呼吸样本并高精度地表征呼吸VOCs。通过修改标准的呼吸力学设备（flexiVent®）并使用特定的空气过滤器，可以从插管的健康小鼠身上采集呼吸样本到行业标准的吸附管上，进行TD-GS-MS分析，同时最大限度地减少背景影响（图2）。使用这种方法，可以通过比较呼吸和空白样本，有效地区分健康小鼠基线呼吸VOCs与背景化合物。这种区分水平无法通过其他采样方法轻松实现，例如从通风笼或仅鼻吸入管中直接收集未限制的小鼠呼吸（5,6）。此外，在人类呼吸分析中使用相同的空气过滤器、吸附管和分析方法，可以实现人类和小鼠呼吸VOCs的直接比较。这一比较揭示了49种共享化合物，为将临床前发现和生物标志物转化为人类临床研究奠定了基础（7）。
图2 - 收集小鼠呼吸的方法示意图，以及如何将其应用于a）用于药物发现的EVOC探针方法和b）使用无菌小鼠识别特定肠道细菌产生的VOCs（8）。
利用小鼠模型加快转化研究
小鼠模型的呼出气体为推进药物开发提供了一个有价值的工具。近年来，使用外源性VOC（EVOC）探针靶向特定酶活性已成为癌症筛查的新方法（图2 A）。此外，EVOC探针柠檬烯在最近的一项临床研究中成功地区分了肝硬化患者（9）。EVOC探针的工作原理类似于临床上已建立的13C标记尿素呼气测试，用于检测幽门螺杆菌感染。给药后，微环境中的肿瘤相关酶会裂解EVOC探针，释放出可在呼出气体中检测到的同位素标记化合物作为报告分子。
最近的一项研究表明了EVOC探针在小鼠模型中的潜力（10）。研究人员对植入癌细胞和健康对照小鼠进行了探针混合物测试，确定了一种酶靶标β-GlcNAc。在体内（小鼠呼吸）和体外（组织顶空）条件下均检测到了报告VOC 13CD5-乙醇的升高水平。研究进一步表明，一种针对β-GlcNAc的市售肿瘤激活前药显著减少了移植了三阴性乳腺癌（TNBC）的小鼠的癌症活动。这项研究强调了小鼠模型在呼吸研究中的强大作用，可以识别与特定疾病相关的酶靶标，为加速药物发现提供了途径。
微生物组产生大量可检测到的VOCs；在肠道中，微生物组的组成与小肠细菌过度生长（SIBO）、炎症性肠病（IBD）和肠易激综合症（IBS）等胃肠疾病密切相关，使呼吸VOCs成为非常有前景的疾病生物标志物。然而，将人类呼吸中的特定VOCs与特定肠道微生物种类联系起来仍然是一个挑战。小鼠模型提供了一个可行的解决方案，因为无菌小鼠可以移植不同的肠道细菌种类，并将其呼出的VOCs与相应细菌种类在体外培养的顶空分析中检测到的VOCs相匹配（8）（图2 B）。这种方法将呼吸中检测到的VOCs与产生这些VOCs的特定肠道细菌联系起来，为深入了解呼吸VOCs的起源提供了更深层次的理解。
图2 - 收集小鼠呼吸的方法示意图，以及如何将其应用于a）用于药物发现的EVOC探针方法和b）使用无菌小鼠识别特定肠道细菌产生的VOCs（8）。
呼吸VOCs作为一种未来无创、去中心化的疾病诊断和治疗监测工具具有巨大的潜力。结合小鼠模型在呼吸研究中的独特优势，以及可靠的呼吸采样和分析平台，使小鼠和人类呼吸成分的公平比较成为可能，这将推动将新知识转化为临床应用的努力。利用小鼠模型进行呼吸研究将弥合实验室发现与人类临床研究之间的差距，为开发快速、即时的疾病诊断设备铺平道路。
参考文献
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