吲哚-3-乙酸与边缘可切除或局部晚期胰腺癌的治疗反应 - 硒与微生态

背景与目的

最近有报道称，转移性胰腺导管腺癌（PDAC）患者血液中由细菌产生的代谢物吲哚-3-乙酸（3-IAA）浓度较高，与更好的化疗反应有关。本研究旨在将这些观察结果扩展到非转移性PDAC患者中。

方法

我们测量了一项前瞻性人群队列中124例边缘可切除或局部晚期PDAC患者的循环3-IAA水平，这些样本是在开始新辅助化疗前收集的。大多数（61%）患者接受了FOLFIRINOX治疗。我们使用单变量和多变量Cox比例风险回归模型来估计治疗前3-IAA与总生存期之间的关系。

结果

化疗前的血清3-IAA中位浓度为290（四分位数范围203-417）ng/mL。未经调整的风险比（HR）为0.93，95%置信区间（CI）[0.74-1.16]，p=0.52。在调整年龄、ECOG、CA19-9和肿瘤分类后，log2(3-IAA)的HR为0.87，95% CI [0.68-1.12]，p=0.28。

结论

我们的研究结果表明，在接受化疗的转移性PDAC中观察到的3-IAA增强效应可能不适用于边缘可切除或局部晚期PDAC。我们建议在尝试在人体研究中实施之前，进一步临床验证3-IAA在不同类型PDAC中的预测价值。

引言

胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的癌症之一，挪威（2023年）的发病率为每年每10万人约15例。大约85%的PDAC患者不适合进行根治性手术。许多患者接受新辅助或姑息治疗，但不幸的是，反应率较低。化疗反应的生物标志物对于选择可能从治疗中受益的患者至关重要。

在PDAC中，碳水化合物抗原19-9（CA19-9）是最常用的治疗反应生物标志物，但其预测能力有限。考虑到肿瘤学领域的新方法，特定受体的表达或基因重排的存在通常是候选生物标志物。肠道微生物组组成与多种健康特征相关，包括对某些癌症治疗的反应。最近，Tintelnot等人发现循环中的肠道微生物代谢物吲哚-3-乙酸（3-IAA）与转移性PDAC的化疗反应呈正相关。在一项精心设计的实验和分子表征研究中，发现化疗效果的增加依赖于中性粒细胞来源的髓过氧化物酶氧化3-IAA，随后增加了肿瘤细胞中的活性氧，从而导致肿瘤细胞死亡。该研究引入了一个新的概念，即肠道微生物产生的代谢物被系统吸收并影响宿主的化疗反应。在该研究中，通过补充饮食中的3-IAA前体色氨酸，可以提高小鼠的化疗反应，导致3-IAA水平升高，这表明类似的辅助方法可能在人类中具有临床疗效。

转移性PDAC的化疗目的是姑息治疗，但对于边缘可切除或局部晚期PDAC患者，化疗是主要治疗手段，旨在提高根治性手术的切除率。因此，我们在一组边缘可切除或局部晚期PDAC患者中测量了3-IAA，这些患者在开始化疗前采集了血液样本，旨在调查无远处转移的PDAC人群中3-IAA水平升高是否与治疗反应相关。

患者和方法

研究设计和参与者

本研究的参与者来自NORPACT-2研究，这是一项前瞻性、基于人群的队列研究，纳入了2018年至2020年间在奥斯陆大学医院登记的边缘可切除或局部晚期PDAC患者。我们纳入了124例在开始任何化疗前捐献血液的患者（流程图见补充图S1）。35例（28%）愿意捐献额外样本的患者在开始化疗2-4个月后进行了第二次采血。研究方案得到了北区医疗和健康研究伦理委员会的批准。为了评估3-IAA的人群浓度，还纳入了100例健康对照组血清样本（中位年龄40岁，女性41%），这些样本是在其他研究中分析的，得到了南区医疗和健康研究伦理委员会的批准。

结局、定义和诊断标准

根据2017年版美国国家综合癌症网络（NCCN）标准，诊断边缘可切除或局部晚期PDAC。通过腹部和胸部计算机断层扫描（CT）排除远处转移。需要通过细针穿刺细胞学检查或内镜超声引导下的活检来确认PDAC。化疗方案由当地医院的主治肿瘤科医生决定。

主要结局定义为总生存期，结局时间定义为从采血开始，即开始主要化疗的时间。次要结局包括在适用的情况下，参与者在手术切除（开始主要化疗后）时被删失。

靶向液相色谱-串联质谱

基线和随访血清按照奥斯陆大学医院的标准程序采样和储存。血清凝固至少30分钟后，以2450 x g离心15分钟，然后冷冻并储存在-80°C。3-IAA的靶向代谢物分析使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台进行，该平台也用于测量B族维生素和人源及细菌源色氨酸代谢物，具体方法见Midttun等人描述。

简而言之，3-IAA被添加到已建立的方法中，使用从C/D/N Isotopes Inc（加拿大魁北克）获得的吲哚-2,4,5,6,7-d5-3-乙酸（3-IAAd5）作为内标。保留时间分别为4.93分钟（3-IAA）和4.91分钟（3-IAAd5）。分析物在正离子多反应监测（MRM）模式下检测，使用的离子对分别为176.2/130.2 m/z和181.1/134.1 m/z。

统计分析

通过绘制3-IAA四分位数的Kaplan-Meier生存曲线来可视化生存比例。使用Cox比例风险模型估计3-IAA（log2转换）与总生存期的关联。我们在多变量Cox模型中包括了ECOG表现状态（建模为连续变量）、CA19-9（log2转换）、肿瘤分类（局部晚期或边缘可切除）和年龄。

为了测试连续变量分布的差异，我们使用Wilcoxon秩和检验用于独立观察，使用Wilcoxon符号秩检验用于配对观察。分布以中位数（四分位数范围，IQR）表示。

对于任何用于分析的变量，数据缺失少于5%的参与者，因此未进行缺失数据填补。所有数据处理、可视化和统计分析均在R中进行。

结果

共纳入124例（中位年龄68岁，47%男性）边缘可切除（n=68）或局部晚期PDAC（n=56）患者（表1）。76例（61%）患者接受了氟尿嘧啶、亚叶酸钙、伊立替康和奥沙利铂（FOLFIRINOX）治疗，26例（21%）接受了吉西他滨加白蛋白结合型紫杉醇治疗，22例（18%）接受了吉西他滨单药治疗或其他化疗方案。

表1

表1. 研究人群的基线特征。

化疗前的3-IAA中位浓度为290（IQR 203-417）ng/mL。这一浓度在另一项研究中分析的100名健康个体的范围内（中位数377（IQR 303-464）ng/mL）。血清3-IAA与年龄呈正相关（Spearman's ρ=0.33，p<0.001；补充图S2A），但与肿瘤直径或血清CA19-9无关（补充图S2B, C）。不同化疗组的治疗前3-IAA相似（补充图S2D）。

我们未发现根据CT扫描或CA19-9下降定义的反应中治疗前3-IAA浓度有统计学显著差异（图1A, B）。在后来接受手术切除和一年后仍存活的患者中，3-IAA浓度数值上较高，但差异无统计学意义（图1C, D）。在有第二次样本的参与者中，化疗后3-IAA浓度平均增加（中位数化疗前265 nmol/L，化疗后328 nmol/L），但增加无统计学意义（p=0.24，补充图S2E）。

图1

图1. (A-D) 根据RECIST标准的CT反应 (A) ，CA19-9下降>50% (B) ，是否进行了新辅助化疗后的手术切除 (C) ，以及一年生存状态 (D) 的3-IAA分布。统计显著性使用Mann-Whitney U检验进行测试。(E) 根据治疗前3-IAA浓度（四分位数）分组的参与者总生存期的Kaplan-Meier生存曲线，图下方显示了每个时间点的风险人数。单变量Cox模型的结果显示在图中。3-IAA，吲哚-3-乙酸；CI，置信区间；HR，风险比。

中位生存时间为499天（95% CI 437-597）。26例（21%）患者在最后一次随访时无事件发生。我们将参与者按治疗前3-IAA浓度分为四分位数，但未发现各组间生存期有显著差异（图1E），这一发现得到了Cox模型的支持，其中3-IAA（log2）的HR=0.93，95% CI [0.74-1.16]，p=0.52。在边缘可切除或局部晚期癌症的亚组中，模型估计值相似。由于41例（33%）参与者最终接受了原发肿瘤的手术切除，这可能影响生存，我们评估了在手术时删失这些病例时3-IAA的预后价值。在这里，我们也未发现3-IAA与总生存期之间存在关联的证据（补充图S3）。最后，使用全队列，我们调整了3-IAA，包括年龄、ECOG、CA19-9和肿瘤分类，其中3-IAA（log2）的调整后HR=0.87，95% CI [0.68-1.12]，p=0.28。

讨论

在本研究中，血清3-IAA浓度与化疗反应或总生存期在边缘可切除或局部晚期PDAC开始化疗的人群中无关联。结果表明，高3-IAA水平不能预测边缘可切除或局部晚期PDAC的化疗反应。

唯一可比较的数据来自Tintelnot及其同事的开创性论文，他们发现了3-IAA与PDAC化疗反应之间的关联。这些研究之间的几个差异可能解释了这些矛盾的观察结果。Tintelnot等人的研究在两个转移性PDAC队列中共47例患者中调查了化疗反应与3-IAA之间的关联。相比之下，虽然我们研究的患者数量超过他们的两倍（n=124），但我们的研究人群没有远处转移的迹象。非转移性癌症患者通常总肿瘤负荷较小，功能状态较好，且肿瘤生物学特性与转移性癌症不同，所有这些都可能影响化疗及其修饰剂的效果。

另一个主要差异是分析方法。本研究中的3-IAA中位浓度约为Tintelnot等人发现的10倍。在其他正在进行的研究中分析的健康对照人群中，3-IAA的中位数在同一数量级。因此，我们推测3-IAA浓度的差异主要源于检测方法的不同，很难排除这可能是导致结果分歧的部分原因。值得注意的是，本数据是使用高质量的LC-MS/MS方法和放射性标记的内标生成的。然而，如果3-IAA测量的个体间变异在两种方法中一致，那么如果确实存在关联，我们会在我们的队列中发现生存期与3-IAA的关联。在我们的单变量模型中，3-IAA的置信区间较宽（0.74-1.16）。虽然这使得难以自信地断定是否存在效应，但任何潜在的临床意义似乎最有可能较小。

第三个问题是，发现队列中的明显预测性能往往过于乐观，模型在新人群中通常表现较差，原因多种多样。这一点在Tintelnot等人的研究中得到了说明，他们在第二个PDAC队列中观察到的效果大小低于第一个队列（3-IAA与生存时间相关性的解释方差在汉堡队列为R² = 0.51，在慕尼黑队列为R² = 0.24）。

我们研究的一个局限性是54%的患者因黄疸接受了胆道支架，目前尚不清楚高胆红素血症是否影响色氨酸的肠道代谢，而色氨酸是3-IAA的前体。此外，只有28%的队列有第二次血样用于血清3-IAA测量，只有61%的患者接受了FOLFIRINOX治疗。

总之，我们的结果与Tintelnot等人研究带来的乐观情绪不符。在启动旨在改变3-IAA水平的人体临床试验之前，需要进一步验证3-IAA作为PDAC化疗反应的生物标志物。此外，后续研究应可能集中在转移性PDAC上。

数据可用性声明

由于挪威的数据隐私法规和缺乏参与者同意，数据未存放在公共存储库中。然而，如果分析目的在参与者签署的知情同意书中涵盖，可以请求访问数据，前提是经过伦理批准的修正案和数据传输协议。请求访问数据集应联系JH，j.e.r.hov@medisin.uio.no。

伦理声明

涉及人类的研究经北区医疗和健康研究伦理委员会（参考编号2017/1382）和东南区医疗和健康研究伦理委员会（参考编号2015/2140）批准。研究按照当地法规和机构要求进行。参与者提供了书面知情同意书，同意参与本研究。

作者贡献

PB：数据管理、正式分析、调查、方法、软件、可视化、撰写初稿、审阅与编辑。IF：数据管理、调查、方法、项目管理、资源、撰写初稿、审阅与编辑。EK：数据管理、调查、方法、项目管理、资源、撰写初稿、审阅与编辑。SY：概念化、调查、方法、项目管理、资源、监督、撰写初稿、审阅与编辑。AM：调查、方法、撰写初稿、审阅与编辑。PU：调查、方法、撰写初稿、审阅与编辑。KL：概念化、数据管理、资金获取、调查、方法、项目管理、资源、监督、撰写初稿、审阅与编辑。JH：概念化、资金获取、调查、方法、项目管理、资源、监督、撰写初稿、审阅与编辑。

资金

作者声明，本研究、作者身份和/或出版的资金支持来自挪威东南部地区卫生局的研究资助（编号2018088、2019029、2023018）和挪威癌症协会（198039-2018），以及奥斯陆大学医院的战略研究领域“个性化微生物治疗在临床医学中的应用”。JH部分资金来自欧洲研究理事会的资助（编号802544）。