工程化生物合成途径为获取复杂分子提供了新途径。
生物合成方法涵盖多种技术，包括工程化活细胞（自上而下方法）以及构建人工系统如细胞和细胞器（自下而上方法）(1)。最初活动始于20世纪末，随着新一代测序技术的发展和遗传学与分子生物学知识的扩展。这些理解促进了新型合成生物学工具和技术的开发，从而形成了基因电路、生物开关和工程化细胞工厂。基因编辑技术的出现实现了更大的飞跃。无细胞核酸合成、高效微生物合成天然产物及新型衍生物、以及工程化细胞疗法，仅仅是制药行业利用合成生物学进步的几个例子。
合成生物学的最新进展
根据杰康生物（GenScript）研发总监Lumeng Ye的说法，合成生物学是"人工设计的生物制品"。"它涉及工程化生物合成途径、基因网络、蛋白质和分子开关，旨在优化或增强自然细胞功能，用于体外或体内医疗应用，"她解释道。对于药物生产，这些途径可存在于天然细菌、病毒、植物和哺乳动物细胞内，也可以是完全人工的系统。在这两种情况下，它们都被设计用来生产具有治疗应用的高产量目标产品。
Ye指出，使用合成生物学方法有几个优势。"关于药物制造，合成生物学能够生产新型生物基药物和治疗模式，用于常见、罕见或新兴疾病，"她说。Ye补充道，使用合成生物学工具还可以提高药物发现的效率，减少时间和成本，最终增加获得有效且负担得起的治疗的机会，包括个性化疗法。
使用合成生物学生产的新型工程系统，范围从简单—酶、蛋白质和调节元件—到非常复杂的由不同基因电路和酶组成的多模块单元(2)。模块化方法提供了显著的灵活性，允许开发已在药物发现、药物生产和诊断应用中使用的多种系统。
用于合成生物学的基因组/代谢工程工具和技术的进步使该领域超越了工程化细胞，扩展到构建高度复杂的人工细胞甚至合成生物体(3)。通过结合生物学、工程学和计算科学，研究人员已开发出计算建模系统来模拟基因电路中的转录和翻译动力学，设计了基于液滴的微流体技术来制造囊泡和人工细胞，引入了能够模拟自然细胞行为的机械敏感性合成细胞概念（具有靶向药物输送的潜在应用），创建了以新机制运作的蛋白质传感器，开发了用于生产新型抗生素的人工生物合成途径，并工程化了新型基因转录受体，从而实现了新型过继细胞疗法的开发。
值得注意的具体例子包括工程化哺乳动物细胞为基础的嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法，基于工程化诱导多能干细胞（iPSCs）和间充质干细胞（MSCs）的治疗，基于工程化微生物（细菌、酵母、真菌）的活性生物治疗产品，模拟活细胞特性的自组装合成细胞器，工程化蛋白质，以及基于细菌外膜囊泡和外泌体的药物递送系统(1)。
聚焦体外（无细胞）系统
合成生物学中一个可能对高级治疗空间产生重大影响的重要领域是用于生产单链（ss）和双链（ds）DNA的无细胞方法。（注意：信使RNA [mRNA]也是通过体外转录过程以无细胞方式生产的。）
通过细菌发酵生产的质粒DNA（pDNA）是最广泛使用的dsDNA形式。除了产能限制外，将pDNA用于生物制药制造应用还有其他缺点。质粒含有细菌序列和抗生素抗性基因，内毒素杂质可能是一个问题，而且该过程可能高度可变并产生大量废物(4)。
酶促或无细胞DNA合成提供的dsDNA不含细菌和抗生素抗性基因，产量高，且涉及更简单的纯化过程。包括杰康生物（GenScript）、Touchlight、4basebio、OriCiro Genomics、Elegen Bio、LineaRx等公司已采用多种酶促方法。
杰康生物（GenScript）、Touchlight和DNA Script等几家公司的开发了用于生产ssDNA的无细胞合成方法。"杰康生物（GenScript）的方法是使用噬菌体中天然存在的酶，并以精心设计的路线依次使用它们，提供高纯度、高保真度的ssDNA，"Ye评论道。
除了DNA，人们对使用无细胞合成方法进行蛋白质制造的兴趣日益增长(5)。以批量方式制备的细胞裂解物可作为分装样品解冻并立即使用，消除了菌株扩增的需要。处理通常更简单，因为不包含不必要的细胞成分，减少了不希望的蛋白质的产生，没有细胞材料需要去除，而使用一致、高质量的试剂（DNA或mRNA模板、氨基酸、核苷酸、能源、辅因子等）则导致稳健的过程。在无细胞合成系统中也更容易掺入非天然氨基酸，从而实现新型治疗性蛋白质的生产。
抗体衍生物、抗体-药物偶联物、细胞因子、疫苗、膜蛋白、金属蛋白、病毒蛋白和抗菌肽的例子已在无细胞系统中生产，其中一些的产量高于传统细胞培养获得的产量(2)。实现所需翻译后修饰的能力也得到了改善。快速实施无细胞蛋白质合成反应的能力也推动了其在快速评估新型生物合成途径和基因电路中的应用。2024年，已有超过25种用于蛋白质合成的无细胞系统商业化，一些使用大肠杆菌（E. coli）裂解物生产的试验性治疗蛋白质正在临床试验中进行评估。
获取天然产物和半合成衍生物
生物合成方法的另一个重要应用是更高效、可靠的天然产物生产。鉴于当前抗生素耐药性带来的威胁，获得对现代病原体有效的新型抗生素尤为重要。FDA批准的许多抗生素是放线菌细菌的次级代谢物(6)，虽然抗生素的化学合成传统方法仍然相关，但合成生物学方法提供了几个优势。
特别是，组合生物合成涉及将来自不同来源的天然和/或工程化酶组合成修饰的生物合成途径，提供了有效生产具有显著结构多样性和更高生物活性的天然产物衍生物广泛阵列的潜力(6)。它还可以提供获取无法通过传统合成方法实际制造的天然产物的途径。"通过这种方法，有可能使微生物执行它们通常无法执行的新功能，"Antheia联合创始人兼首席科学官Kristy Hawkins表示。
酶通常从已知产生药理活性化合物的细菌、酵母或真菌来源分离。不同微生物的酶可以相互组合，也可以与工程化酶组合，并在单一生物体中表达。组合生物合成中使用的值得注意的酶包括mega合成酶（megasynth(et)ase），它们是用于产生天然产物结构框架的大型多功能酶，以及修饰这些框架的修饰酶（氧化酶、还原酶、氧化还原酶、转移酶和环化酶等）(7)。
例如，真菌系统中的组合生物合成已被用于生产类固醇合成子、新型他汀类药物、各种抗癌化合物，以及类药物多酮、蒽醌、黄酮类、萘类、非核糖体肽和萜类(7,8)。在这些工程化细胞工厂中生产的特定药物相关化合物包括青蒿素、某些大麻素、雷公藤红素和托烷生物碱(8)。
在某些情况下，合成生物学与合成化学相结合以实现所需产品。Hawkins指出半合成抗生素，其中支架通过发酵生产（通常使用天然宿主生物体），然后使用合成化学进行修饰以改善生物利用度或其他特性，是很好的例子。青蒿素是另一个例子，Amyris/Sanofi开发了一种发酵工艺来生产青蒿酸，然后将其转化为青蒿素。
Antheia专注于用使用高度工程化生物体的生物制造产品替代通过收获作物提取获得的天然产物供应链。"从植物中提取的活性药物成分（API）的来源可能具有挑战性，因为生产可能受到天气、农业灾害、害虫、地缘政治因素和运输问题的影响。"植物质量和化合物含量也可能变化，使开发成本效益高、稳健的提取和纯化过程变得困难。总体生产时间通常也大约为两年。
根据Hawkins的说法，使用生物合成方法，Antheia能够使用提供一致、高质量产品的稳健工艺，在短短两周内完成大多数产品的微生物发酵和下游纯化，避免了与天然产物供应链相关的许多问题。
"我们开发高产平台菌株和可扩展的工艺，以实现所需产品的高滴度，"Hawkins继续说道。"然后进行微调以生产具有略微不同结构的一系列产品，而不会影响工艺性能。只有当我们想要生产新的核心结构时，才需要进行重大重新工程化。"
目前，该公司专注于生产传统上从罂粟植物中分离的化合物，这些化合物用作制造阿片类药物成瘾治疗的原材料，在美国没有国内供应链。Antheia还在开发用于治疗心脏病和恶心的药物制造工艺。Hawkins还对肿瘤学领域感兴趣，例如生产基于天然产物衍生物的抗体-药物偶联物有效载荷。
Antheia管道中的大多数化合物是通过酵母发酵生产的生物碱，但其基因工程技术也可应用于其他宿主系统中复杂途径（涉及多达30种不同异源酶）的工程化。其一些产品是前体或关键起始材料，可通过化学转化轻松生产四种到五种不同的API，而其他产品则是可直接从发酵中获得的API。
对未来的极大期待
迄今为止使用合成生物学工具和方法取得的成功—从无细胞合成和组合生物合成到过继细胞疗法、核酸疫苗和基于病毒的基因疗法—正在产生更多兴趣，将生物合成方法应用于生物制药应用。用于生物制造、靶向药物递送和分析（包括医学诊断）的人工活细胞系统和复杂基因电路的创建可能在不久的将来实现(2)。
随着基因组测序和基因编辑技术的不断进步，无细胞DNA合成的快速和具有成本效益的解决方案得到改善，新的细胞工厂被开发，更多的合成生物学工具被引入，人工智能和机器学习被应用于新型生物合成途径的调查和设计，对生物机制的理解和将生物合成方法应用于生物制药制造的机会将大幅增加。
"能够高效可靠地生产许多新型结构，包括具有更高复杂度的化合物，将大大拓宽药物发现空间并推动重大创新，使行业、整个社会，最重要的是患者受益，"Hawkins总结道。
参考文献
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- Challener, C. Cell-Free Protein Synthesis Holds Real Potential to Transform Drug Development and Manufacturing. Pharma's Almanac, Feb 14, 2024.
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