几乎一个世纪前，Smith和Goodrich报告称"中性粒细胞分区"—一种显著且持续的左移现象—可以识别冠状动脉闭塞后的不良结局，表明血液中中性粒细胞发育状态的出现可能指示具有临床意义的生物学现象。然而，在随后的几十年中，中性粒细胞在心血管炎症中被认为仅仅是旁观者。过去十年中，这一范式发生了转变，因为大量研究揭示了中性粒细胞在多种炎症性心血管病理中的因果作用。然而，此类分析通常考虑的是整个中性粒细胞群体，并未区分中性粒细胞的成熟和激活阶段。
中性粒细胞是人体内周转率最高的细胞。它们在骨髓中由特殊的干细胞和祖细胞发育而来，这些细胞统称为有丝分裂池。中性粒细胞从粒细胞-单核细胞祖细胞逐步发育而来。粒细胞生成轨迹继续发展为前中性粒细胞1细胞，转变为前中性粒细胞2细胞，进一步发展为增殖性前中性粒细胞（preNeus），最终产生有丝分裂后未成熟和成熟的中性粒细胞。这一成熟过程是一个高度组织化的过程，其特征是逐步获得成熟标志物（如CD16和CD10）和失去保留标志物（如CXCR4、CD49d）。
在稳态下，循环中性粒细胞区室几乎完全由成熟细胞组成；然而，在炎症和随后的应急粒细胞生成情况下，未成熟细胞会被动员到血液中。积累的实验和临床证据表明，应急粒细胞生成可以以不同程度的强度进行，随着炎症应激的加剧，会释放出越来越未成熟的中性粒细胞祖细胞。这种现象，历史上被称为"左移"，反映了从骨髓释放不同阶段中性粒细胞成熟状态以满足外周需求增加的情况。粒细胞生成受生长因子和细胞因子调控，包括粒细胞集落刺激因子、白细胞介素（IL）-6和IL-1家族成员，这表明系统性炎症反应直接影响中性粒细胞动员的深度。
急性心血管综合征的特点是深刻且异质性的炎症反应。然而，尚不清楚这种生物学变异性是否由不同中性粒细胞发育状态向循环的部署所捕获。由于循环中性粒细胞水平是对损伤特别早期和敏感的反应物，我们假设并证明血液中中性粒细胞成熟阶段的出现，特别是动员越来越未成熟的中性粒细胞到循环中的深度，可能作为系统性炎症应激和疾病严重程度的生物哨兵，从而实现急性心血管疾病的危险分层。
为确定不同心血管疾病状态是否以不同深度激活应急粒细胞生成，我们分析了心力衰竭（HF）、缺血性卒中、非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）和ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者血液中的中性粒细胞成熟状态。在STEMI队列中，我们在STEMI后3-6个月进行了随访血液采集。此外，我们纳入了一个无明显心外膜冠状动脉阻塞的急性胸痛（ACP）队列。对患者和健康对照者（HC）的EDTA血液样本进行立即处理，并用高维光谱流式细胞术染色，以沿CD10和CD16轴解析中性粒细胞成熟。
基于CD10和CD16的表达，我们将循环中性粒细胞分为11个区间，从而覆盖了一个连续的中性粒细胞成熟轨迹，允许对沿着成熟过程的中性粒细胞群体进行渐进和动态的重塑进行探究。与应急粒细胞生成一致，所有心血管疾病队列都表现出与健康对照者相比向未成熟中性粒细胞状态的左移；这种左移在ACP患者中最小，并且在STEMI患者的随访中基本解决。重要的是，这种左移的组成在不同疾病状态间差异显著：HF和卒中患者主要扩增晚期未成熟中性粒细胞，NSTEMI患者表现出更深的向更早期发育阶段的位移，而急性STEMI则以向最未成熟区域的深刻位移为特征。值得注意的是，仅表现出急性疼痛和应激而无心肌缺血的ACP患者仅显示这些浅表区域的最小参与，表明仅急性疼痛和应激不太可能导致深度中性粒细胞动员。同样，在STEMI后3-6个月，非常未成熟中性粒细胞阶段的丰度恢复正常，表明这种反应代表了一种暂时性的、与损伤相关的炎症状态，而非造血的持久性改变。
最未成熟的簇表现出保留分子CXCR4和CD49d的明显表达，并在体外掺入胸苷类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU），因此反映了最后一个增殖中性粒细胞祖细胞；即前中性粒细胞（preNeu）。与此一致，荧光激活细胞分选（FACS）后进行吉姆萨染色显示，CD16highCD10high成熟中性粒细胞具有分叶核，CD16intCD10low未成熟中性粒细胞具有杆状核，而CD16lowCD10neg preNeus具有圆形核。因此，我们将这些非常未成熟的细胞称为preNeus。
在确定这一最未成熟区间的身份后，我们接下来量化了各队列中循环preNeus。STEMI患者表现出最高的preNeu丰度，而HF、卒中和NSTEMI患者表现出较低水平，且preNeu计数在STEMI后随访时恢复正常，这与心血管疾病实体之间中性粒细胞动员深度的分级一致。
在STEMI队列中，循环preNeu水平在个体之间差异很大。使用均匀流形近似和投影（UMAP）将该队列中的中性粒细胞沿着成熟连续体进行可视化。使用Killip分类法（一种与死亡率相关的STEMI后心力衰竭严重程度的临床评分），Killip 2-4级的患者与Killip 1级患者相比，表现出最未成熟区域（包括preNeus）的显著富集。同样，按30天生存率分层的分析显示，与生存者相比，非生存者向这些深度未成熟区域的移动更为明显，表明中性粒细胞动员中进行性深度未成熟伴随临床状况恶化并预测短期死亡率。这些发现共同定义了中性粒细胞动员深度作为一个分级生物程序，反映了炎症反应的幅度，特别是在STEMI后。
为定义与不同深度中性粒细胞动员相关的炎症程序，我们对图1中分析的队列进行了靶向血浆蛋白质组学分析，定量了43种细胞因子和生长因子。无监督聚类揭示了STEMI患者与HF和卒中患者相比具有独特的炎症特征。其特点是由与心肌损伤和组织应激相关的细胞因子升高，包括IL-6、肿瘤坏死因子配体超家族成员12和IL-33。这种细胞因子特征将STEMI与其他心血管疾病实体区分开来，与STEMI特异性炎症程序一致。
为将动员的中性粒细胞成熟深度与系统性炎症联系起来，我们检查了循环细胞因子如何随所有测量样本中每个中性粒细胞发育阶段的丰度而变化。该分析显示，进行性深度中性粒细胞动员伴随着越来越强的炎症特征，表明导致动员越来越未成熟中性粒细胞的应急粒细胞生成由这些患者的炎症反应的幅度和组成调节。
为特别在急性心肌梗死中解决这些关系，我们将细胞因子-成熟分析仅限于STEMI队列。即使在这种单一疾病状态下，动员越来越深度的中性粒细胞成熟阶段也与越来越强且结构化的炎症特征相关，表明STEMI患者中动员的中性粒细胞成熟深度的变异反映了其炎症微环境的分级差异。在STEMI患者中，我们随后询问不同阶段的中性粒细胞动员是否与不同的炎症程序相关，而不仅仅是一个单一的统一细胞因子反应。为此，我们使用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归（一种在自动选择最相关参数的同时构建预测模型的统计方法）推导出最能预测每个中性粒细胞成熟区间的细胞因子评分。这揭示了早期和中期未成熟中性粒细胞区室与重叠的细胞因子评分相关，包括IL-6、IL-10、抑癌素M、粒细胞集落刺激因子和血管内皮生长因子A等经典炎症介质。相比之下，与preNeus相关的细胞因子特征在组成上是独特的，包括IL-33、转化生长因子α和CXCL8等介质。与此一致，所有细胞因子评分与所有成熟区间的相关性显示，未成熟和成熟中性粒细胞区间的评分呈分级增加，而preNeu评分显示出部分不同的模式，与早期中性粒细胞释放阶段观察到的模式不同。因此，虽然增加的炎症活性逐步驱动血液中未成熟中性粒细胞的出现，但preNeus的出现标志着一个定性不同的炎症状态，与STEMI中中性粒细胞动员的最深层次相关。值得注意的是，preNeu特异性细胞因子评分与循环preNeu计数显示出强烈的线性关系，表明这种独特的炎症程序定量反映了STEMI个体患者中应急粒细胞生成的深度。
接下来，我们检查了preNeu相关炎症程序和中性粒细胞成熟状态如何与疾病背景和临床结果相关。在分析的不同疾病实体中，preNeu细胞因子评分在STEMI患者中达到最高水平，这与该环境中应急粒细胞生成的最深层次参与一致。
在STEMI队列中，与多个未成熟中性粒细胞区室相关的细胞因子评分在非生存者中升高，反映了广泛放大的炎症反应。相比之下，当检查循环细胞计数时，只有preNeus在非生存者中选择性增加。
这些发现表明，STEMI后的致命结局伴随着广泛的炎症激活，并且由此产生的最深层次中性粒细胞祖细胞区室动员提供了死亡风险的可应用读出。
使用光谱流式细胞术在急诊环境中识别和量化循环preNeus代表了常规临床实践中的显著挑战。因此，我们系统地将流式细胞术定义的中性粒细胞成熟阶段的丰度与干预时获取的常规临床参数相关联。对中性粒细胞成熟与干预时在诊所收集的血液参数的这一分析，确定了参数"未成熟粒细胞"（IGs），由标准差分血液细胞计数报告，作为与循环preNeus相关性最强的单一参数。临床血液计数测试在大多数STEMI患者（37名中的33名）中进行。IGs与最未成熟中性粒细胞区室的相关性最强，并显示出与与未成熟中性粒细胞阶段相关的细胞因子评分的稳健关联，这与IGs捕获粒细胞生成动员的最深层次一致。
通过流式细胞术识别的preNeus与自动化血液计数器分析中的IGs相关，支持将IGs用作深度中性粒细胞动员的可扩展替代指标。为直接测试通过流式细胞术识别的preNeus是否包含在临床血液计数中的IGs中，我们基于CD66b、CD10和CD16表达谱，通过FACS分离成熟中性粒细胞、未成熟中性粒细胞和preNeus，然后使用临床血液计数器分别分析每个群体。只有分选的CD10negCD16low preNeus而非成熟和未成熟中性粒细胞被血液计数器分析归类为IGs。值得注意的是，从这些样本中分选的嗜酸性粒细胞未被识别为IGs。这些发现确立了IGs特异性反映最未成熟循环中性粒细胞祖细胞的存在，而非一般的中性粒细胞增多症。
在确定了一个近似循环preNeus的易获取参数后，我们接下来通过事后分析评估了其在三个独立STEMI队列中的预后性能：(1) 我们通过流式细胞术分析的探索性队列；(2) 一个回顾性推导队列，包括2019年至2025年入院的STEMI患者，其中410名患者在入院后24小时内接受了差分血液细胞计数，67名患者在STEMI后30天内死亡；(3) 一个更大的NCT登记、前瞻性验证队列（SYSTEMI），包括接受当代指南指导治疗和完全血管重建的STEMI患者，共511名患者，其中51名患者在30天内死亡。
与我们的流式细胞术分析结果一致，所有三个队列中的非生存者IG水平显著升高。有趣的是，交叉验证的受试者工作特征曲线下面积（AUC）分析表明，IGs在预测30天生存率方面比所有其他单参数生物标志物表现出更大的区分能力，包括年龄或体重指数等风险因素，以及中性粒细胞-淋巴细胞比、肌酸激酶（CK）、CK-MB、乳酸脱氢酶（LDH）、N末端前B型钠尿肽（NT-proBNP）和C反应蛋白或可用的肌钙蛋白等血液参数。这种IGs的表现可在探索性、推导和前瞻性验证队列中可靠重现，表明IGs是STEMI后短期死亡率的稳健单参数预测因子。有趣的是，IGs还显示出与全球急性冠脉事件注册评分（GRACE评分）（用于院内死亡的v.1.0）相当的AUC，后者是一个由八个参数组成的急性冠脉综合征后生存风险评分。
值得注意的是，在验证队列中，我们还比较了入院后1天的生物标志物。该分析显示，IGs在这一延迟时间点也具有最高的交叉验证AUC之一。进一步按性别、年龄、糖尿病和高血压等参数分层的分析显示，IGs在所有亚组中表现一致，除了仅在较小的回顾性推导队列中女性亚组外。高IG计数与严重临床表现相关，表明心源性休克，且休克的STEMI患者与非MI患者相比，休克患者表现出与严重MI患者相当的高IG计数。
为评估IGs是否提供超出既定临床变量和实验室标志物的独立预后信息，我们在回顾性推导队列和前瞻性验证队列中进行了多变量风险预测分析。这些模型中包含的临床协变量和共享生物标志物在图4a中总结。在推导队列中，仅包含临床风险因素或仅包含既定实验室生物标志物的模型对30天死亡率仅显示出中等区分能力。IGs的加入提高了所有模型类别的AUC。AUC差值（ΔAUC）分析表明，IGs的加入导致了一致的区分能力增益，包括在结合临床风险因素和生物标志物的模型中添加IGs时。
我们在前瞻性验证队列中评估了这些发现的稳健性。在该队列中，基于GRACE评分、临床风险因素或实验室生物标志物的模型对30天死亡率显示出中等区分能力。添加IGs与所有模型类别中更高的AUC相关。ΔAUC分析证实，当IGs添加到GRACE评分或添加到临床风险因素和生物标志物时，区分性能有持续的增量增益。
为定义用于风险分层的临床实用IG阈值，我们使用Youden指数在两个队列中确定了最佳截断值，从而利用最大的可用STEMI人群获得适合未来研究的稳健估计。该分析确定了0.15×10^6个细胞/ml的IG阈值。
当根据这一预先指定的截断值对推导队列中的患者进行分层时，IGhigh患者在30天内死亡的风险明显高于IGlow患者（对数秩风险比=6.01），如Kaplan-Meier生存分析所示。生存曲线的分离在入院后早期发生，与IGs在呈现时捕获预后相关信息一致。我们接下来检查了相同IG阈值在独立前瞻性验证队列中的表现。该截断值的应用可重复地将患者分为高风险和低风险组，在IGhigh组中死亡风险几乎高出八倍（风险比=7.98）。仅基于推导队列计算截断值并应用于两个队列时，结果相似。值得注意的是，IGs并未预测30天后的长期生存或心力衰竭住院。
总之，我们的研究确定了动员中性粒细胞的成熟深度作为一个生物学基础和临床可获取的风险分层轴，用于STEMI患者，为未来研究提供了一个框架，以探索炎症调节髓系生成如何为急性心血管疾病的精准风险评估和治疗决策提供信息。
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