肝硬化和非肝硬化门静脉高压症的肠道微生物群分析表明，门静脉高压可能是肝硬化特异性菌群失调的主要因素 - 硒与微生态

摘要

肠道菌群失调在肝硬化中起着重要作用，但其发展机制尚未明确。本研究旨在验证门静脉高压可能是肝硬化中肠道菌群失调发展的主要因素这一假设。这项横断面研究包括25名因门静脉血栓形成后门静脉阻塞引起的慢性非肝硬化门静脉高压（NCPVT组）患者、29名无门静脉血栓形成的肝硬化患者（CirNoPVT）、15名慢性门静脉血栓形成的肝硬化患者（CPVT）以及22名健康对照者。使用16S rRNA基因测序评估粪便微生物群。CirNoPVT和CPVT组与对照组相比，肠道微生物群组成的差异大致相似。NCPVT患者以及肝硬化患者与健康个体相比，Streptococcus, Escherichia, Enterococcus, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Streptococcaceae, Bacilli, Gammaproteobacteria, Proteobacteria的丰度较高，而_Roseburia_, Faecalibacterium, Methanobrevibacter, Ruminococcaceae, Methanobacteriaceae, Clostridia, Methanobacteria, Euryarchaeota的丰度较低。NCPVT患者与健康个体相比，Bifidobacterium, Bifidobacteriaceae, Actinobacteria的丰度较高，而_Gemmiger_和_Catenibacterium_的丰度较低，这在肝硬化组中未观察到。Porphyromonadaceae属中的_Parabacteroides_在两个PVT组中丰度降低，但在CirNoPVT组中未见此现象。CirNoPVT, CPVT和NCPVT组之间的肠道微生物群β多样性没有显著差异。所有这些组与对照组相比，β多样性有显著差异。门静脉高压似乎是肝硬化中肠道菌群失调发展的主要因素。

引言

肝硬化是增加死亡率和残疾的重要因素。最近的研究显示，肠道微生物群（肠道菌群失调）组成的紊乱在肝硬化的进展中起着重要作用。肝硬化与有害兼性厌氧菌（如Streptococcaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Bacilli, Proteobacteria）在肠道中的丰度增加有关，这些细菌能够穿透肠壁、腹水、肝脏和全身循环（细菌移位），同时有益细菌（如Faecalibacterium, Ruminococcaceae, Clostridia）的丰度减少，这些有益细菌能形成短链脂肪酸以加强肠道屏障。这些不利变化增加了肝脏损伤和门静脉高压，恶化了肝硬化的短期和长期预后。这被称为肠-肝轴。然而，肝硬化中肠道菌群失调的发展机制尚未确定。肝硬化的主要表现有两种综合征，即门静脉高压和肝功能下降。假设正是门静脉高压，它会损害肠道的运动和保护功能，从而导致肝硬化特异性菌群失调。为了验证这一假设，我们比较了肝硬化患者和由于非肝硬化门静脉血栓形成（NCPVT）而保留肝功能的非肝硬化门静脉高压患者的肠道微生物群组成。除了肝硬化，门静脉血栓形成（PVT）也可以是门静脉高压的原因。如果血栓不溶解而是组织化，无论是否发展成门静脉海绵状变性，这称为慢性肝外门静脉阻塞（EHPVO）。这些患者有门静脉高压，表现为腹水、分流性肝性脑病和食管静脉曲张，但通常没有肝功能障碍，例如低白蛋白血症、高胆红素血症等。他们形成了NCPVT组。PVT也可以使肝硬化的病情复杂化。因此，应比较无PVT的肝硬化（CirNoPVT）、慢性PVT的肝硬化（CPVT）和NCPVT患者的肠道微生物群，以推测其组成的变化哪些与门静脉高压本身相关，哪些与PVT和肝硬化单独相关。

材料和方法

患者

这是一项非干预性横断面研究，包括各种原因引起的门静脉高压患者：由于PVT后的EHPVO引起的非肝硬化门静脉高压（NCPVT组）、无PVT的肝硬化（CirNoPVT组）、伴有PVT的肝硬化（CPVT组）。对照组由前来诊所进行预防性检查的临床健康个体组成。所有患者均签署了自愿知情同意书。该研究按照赫尔辛基宣言进行，并得到了谢切诺夫大学地方伦理委员会的批准（20.10.2020，参考号：20-22）。NCPVT和CPVT组构成了PVT患者的整体组。CirNoPVT和CPVT组构成了肝硬化患者的整体组。

纳入标准：年龄18-70岁，签署知情同意书，根据增强CT扫描结果存在慢性门静脉高压（一个或两个标志：门静脉、脾静脉、上或下肠系膜静脉直径增加；门体侧支循环），结合以下一个或多个标志：食管或胃静脉曲张、脾肿大、腹水。门静脉高压持续时间至少6个月。

排除标准：在纳入研究前6周内服用影响肠道微生物群的药物（益生元、益生菌、合生元或抗生素）或酒精，存在显著影响肠道微生物群组成的肠道疾病或其他疾病，包括实体瘤。

肝硬化的诊断通过活检或结合临床、实验室和仪器数据（包括瞬时弹性成像）根据当前指南建立。

PVT和NCPVT基于增强CT扫描数据，通过门静脉主干或其海绵状变性的对比缺陷来诊断。这些变化在纳入研究前至少持续6个月。如果这些患者的肝脏硬度符合F4纤维化阶段，则将其纳入CPVT组；如果其肝脏硬度对应于F0-F3纤维化阶段，则将其纳入NCPVT组。其他情况下（急性PVT、随访期间进展至F4阶段）被排除，以消除分组偏差。

所有患者均进行了标准检测：全血细胞计数、血液化学、腹部超声、胃镜检查、神经学和体检。此外，还采集了早晨粪便样本进行16S rRNA基因测序。

样品制备和细菌16S rRNA基因测序

使用MagPure Stool DNA LQ Kit (Magen)提取DNA，按照制造商说明操作。使用QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe)和Fluo-200荧光计 (AllSheng) 测量DNA浓度。

使用针对16S rRNA V4区域的515 F Forward Primer 5'Phos-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA和806R Reverse Primer 5'Phos-GGACTACNVGGGTWTCTAAT进行PCR扩增构建DNA文库。290 bp PCR产物通过Tersus Plus PCR kit (Evrogen)扩增。热循环条件为95°C - 3分钟，30个循环：95°C - 30秒，50°C - 30秒，72°C - 60秒，然后72°C - 5分钟。

通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析产物质量，并使用VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme)纯化，按照制造商说明操作。连接反应包括100 ng 290 bp扩增子、1 mkl 10x连接酶缓冲液、0.5 mkl T4 DNA连接酶 (Genterra)、0.5 mkl索引接头 (VAHTS RNA Adapters set 8 for MGI, Vazyme)，用水补足至10 mkl。反应混合物在16°C孵育过夜。使用VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme)纯化连接反应产物，按照制造商说明操作。

使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase kit (Vazyme)进行文库扩增反应，引物为Ad153_PCR2_2 (TGTGAGCCAAGGAGTTG) 和 Ad153_PCR2_1 (5'Phos-GAACGACATGGCTACGA)。

使用Qsep100毛细管电泳分析仪 (Bioptic) 和Standart Cartridge kit (Bioptic)分析制备好的文库质量。使用QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe)和Fluo-200荧光计 (AllSheng)测量DNA浓度。使用MGIEasy Circularization Kit (MGI)根据制造商说明从PCR产物制备用于MGI测序仪的单链环状DNA文库。

使用High-throughput Sequencing Kit (MGI)准备DNA进行测序。样品使用DNBSEQ-G50平台 (MGI) 进行双端测序，读长为150 bp。

生物信息学分析

使用QIIME2 v.2023.9.217进行微生物组生物信息学分析。原始双端读段经过质量过滤、修剪、合并和去噪处理，生成扩增子序列变异 (ASVs)。使用q2-feature-classifier插件中预训练的Naïve Bayes分类器对ASVs进行分类注释，该分类器采用人类粪便特异性分类权重。分类器基于Greengenes 13_8 99% OTU序列，修剪至515 F/806R区域。然后，过滤掉未定义门注释的ASVs。删除在少于3个样本中出现且总频率低于10的ASVs。对于α-和β-多样性分析，所有样本均稀疏化到相同的测序深度（每个样本5,500条序列）。使用q2-diversity插件计算Shannon多样性指数、Bray-Curtis差异指数、α-和β-多样性指数的稀疏曲线。组间α多样性的比较使用Kruskal-Wallis检验。组间β多样性的比较使用非参数PERMANOVA21和PERMDISP。使用qiime2R R包绘制主坐标分析 (PCoA) 图可视化β多样性。使用Bonferroni校正进行多重检验。使用LEfSe v.1.1.0122和在线资源

统计分析

定量变量的值以中位数 [四分位数范围] 表示。定性数据表示为计数和百分比。多组间的比较使用Kruskal-Wallis检验。两组间连续变量的比较使用Mann-Whitney检验。多组间的分类和定性变量比较使用卡方检验。两组间的分类和定性变量比较使用Fisher精确检验。显著性水平设为_p_ < 0.05。使用STATISTICA 10 (TIBCO Software, Palo Alto, CA)进行分析。

结果

从先前收集的数据库中筛选出CPVT和NCPVT患者参与研究。研究还包括定期检查期间招募的CirNoPVT患者。将前来诊所进行预防性检查的22名临床健康个体作为对照组。不幸的是，6个测序样本的序列深度较低（每个样本少于4,000 ASV），因此我们不得不将这些患者排除在外（图1）。

图1

研究流程图。

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在有无PVT的肝硬化患者之间，肝硬化的病因没有显著差异（p = 0.830；补充表1）。NCPVT组中EHPVO的原因包括血液系统恶性肿瘤、凝血酶基因突变、天然抗凝剂缺乏、门静脉分支静脉炎（由于脐炎或急性胰腺炎）、口服避孕药和不明原因（补充表2）。

在NCPVT、CPVT、CirNoPVT和对照组之间，年龄、体重指数、饮食和性别分布没有显著差异（补充表3）。在NCPVT、CPVT和CirNoPVT组之间，主要共病没有显著差异（表1）。

表1 包括患者的主要特征。

完整表格

CPVT和CirNoPVT组在肝硬化的表现和严重程度以及所用药物方面没有显著差异，但PVT患者更可能使用抗凝剂（表1）。

NCPVT患者肝功能保存良好，这反映在没有肝性低白蛋白血症和高胆红素血症，白蛋白水平高于两种肝硬化患者组，总胆红素水平较低。四名NCPVT患者由于遗传性血栓形成并发症（微血管溶血性贫血）或骨髓增殖性疾病引起的无效造血而出现间接胆红素升高。所有这些患者的血清白蛋白、凝血酶原、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)、γ-谷氨酰转移酶 (GGT) 和碱性磷酸酶 (ALP) 水平正常，肝脏硬度对应于纤维化阶段≤F2，除了唯一一例轻微低白蛋白血症，这是由于骨髓增殖性疾病的并发症（表1）。

NCPVT患者的腹水和肝性脑病的严重程度低于肝硬化患者。三组患者之间的食管静脉曲张严重程度没有显著差异。NCPVT患者的肝损伤生物标志物（ALT和AST）水平正常，而在肝硬化患者中较高。NCPVT患者的血小板减少症较轻。同时，三组患者的红细胞和白细胞水平没有显著差异（表1）。

肝硬化患者更常使用螺内酯和袢利尿剂。PVT患者（CPVT + NCPVT）比无PVT的肝硬化患者更常使用抗凝剂。各组之间β受体阻滞剂的使用没有显著差异（表1）。

各组之间的Shannon肠道微生物群α多样性指数没有显著差异（p = 0.710；补充图1）。无PVT肝硬化、CPVT和NCPVT组之间的肠道微生物群β多样性没有显著差异。然而，所有三个门静脉高压患者组的β多样性与健康对照组有显著差异（图2，补充表4）。

图2

主坐标分析 (PCoA) 图展示了门静脉高压（无门静脉血栓形成的肝硬化 [CirNoPVT]、伴有门静脉血栓形成的肝硬化 [CPVT]、非肝硬化门静脉血栓形成 [NCPVT]）患者与健康对照组之间的Bray-Curtis β多样性。

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门静脉高压患者总体组（有和无PVT的肝硬化 + NCPVT）在肠道微生物群中，Streptococcus, Veillonella, Escherichia, Enterococcus, Streptococcaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Bacilli, Gammaproteobacteria, Proteobacteria的丰度较高，而_Roseburia_, Faecalibacterium, Parabacteroides, Gemmiger, Methanobrevibacter, Ruminococcaceae, Methanobacteriaceae, Clostridia, Methanobacteria, Firmicutes和Euryarchaeota的丰度较低（图3a）。CirNoPVT和CPVT组在肠道微生物群组成方面与健康对照组的差异大致相似（图3b-d）。

图3

LEfSe分析产生的LDA评分直方图揭示了以下组别之间肠道微生物群中差异丰富的类群：（a）门静脉高压和健康对照；（b）肝硬化和健康对照；（c）无门静脉血栓形成的肝硬化（CirNoPVT）和健康对照；（d）伴有门静脉血栓形成的肝硬化（CPVT）和健康对照。

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NCPVT患者一方面与肝硬化患者一样，与健康个体相比，Streptococcus, Escherichia, Enterococcus, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Streptococcaceae, Bacilli, Gammaproteobacteria, Proteobacteria的丰度较高，而_Roseburia_, Faecalibacterium, Methanobrevibacter, Ruminococcaceae, Methanobacteriaceae, Clostridia, Methanobacteria, Euryarchaeota的丰度较低。另一方面，与健康个体相比，Bifidobacterium, Bifidobacteriaceae, Actinobacteria的丰度较高，而_Gemmiger_和_Catenibacterium_的丰度较低，这在肝硬化组中未观察到（图4a）。

图4

LEfSe分析产生的LDA评分直方图揭示了以下组别之间肠道微生物群中差异丰富的类群：（a）非肝硬化门静脉血栓形成（NCPVT）和健康对照；（b）NCPVT和无门静脉血栓形成的肝硬化（CirNoPVT）；（c）NCPVT和伴有门静脉血栓形成的肝硬化（CPVT）；（d）CPVT和CirNoPVT。

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与无PVT的肝硬化患者相比，NCPVT患者在肠道微生物群中_Bifidobacterium_, Bifidobacteriaceae, Actinobacteria的含量较高，而_Parabacteroides_, Weissella, Lactococcus, Porphyromonadaceae和Leuconostocaceae的含量较低（图4b）。与CPVT患者相比，NCPVT患者在肠道微生物群中_Bifidobacterium_, Collinsella, Bifidobacteriaceae, Coriobacteriaceae, Actinobacteria, Coriobacteriia的含量较高，而_Coprobacillus_的含量较低（图4c）。

与无PVT的肝硬化患者相比，CPVT患者在肠道微生物群中Leuconostocaceae和_Weissella_的含量较低（图4d）。

比较四个组在主要类群水平上的丰度（补充表5和6），所有门静脉高压组的Proteobacteria和Bacilli的丰度都比正常人高，但在门静脉高压组之间没有显著差异（图5a-b）。所有门静脉高压组的Clostridia和Euryarchaeota的丰度都比对照组低，但在门静脉高压组之间没有显著差异（图5c-d）。只有NCPVT组的Actinobacteria丰度增加（p = 0.008），而在两个肝硬化组中与对照组没有显著差异（图5e）。此外，NCPVT组的这种细菌丰度显著高于两个肝硬化组（p < 0.001和_p_ = 0.010；图5e）。Porphyromonadaceae（包含_Parabacteroides_属）的丰度在两个PVT组中显著降低（p = 0.003和_p_ < 0.001），而在无PVT的肝硬化组中与正常人没有显著差异（p = 0.089；图5f）。

图5

比较非肝硬化门静脉血栓形成（NCPVT）、伴有门静脉血栓形成的肝硬化（CPVT）、无门静脉血栓形成的肝硬化（CirNoPVT）患者和健康个体之间肠道微生物群主要显著类群的相对丰度：（a）Proteobacteria，（b）Bacilli，（c）Clostridia，（d）Euryarchaeota，（e）Actinobacteria，（f）Porphyromonadaceae。

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在肝硬化和非肝硬化PVT（CPVT vs. NCPVT）患者之间，血栓的范围和门静脉海绵状变性的发生率没有显著差异（补充表7）。在CPVT和NCPVT组中，不同范围的门静脉血栓形成之间的肠道微生物群β多样性没有显著差异（补充表8，补充图2）。在CPVT和NCPVT组中，有无门静脉海绵状变性的患者之间的肠道微生物群β多样性没有显著差异（补充表9，补充图2）。在PVT总体组中，门静脉海绵状变性的患者在肠道微生物群中Pasteurellaceae和_Haemophilus_的含量较高。在PVT总体组中，血栓延伸至两个门静脉来源（上肠系膜静脉和脾静脉）的患者在肠道微生物群中Actinobacteria, Turicibacteraceae, Klebsiella, _Turicibacter_的含量较高。在CPVT和NCPVT组中，这些亚组的规模太小，无法进行充分的LEfSe分析。

讨论

我们的研究目的是分析非肝硬化门静脉高压症（保留肝功能）是否会导致与肝硬化相同的肠道微生物群组成的不良变化。我们得到了肯定的答案。所有肝硬化特异性肠道菌群失调的主要表现（Proteobacteria和Bacilli丰度增加，Clostridia丰度减少）也在无肝硬化的门静脉高压症患者中观察到。这表明门静脉高压，而不是肝功能下降，可能是导致有害的肝硬化特异性肠道菌群失调的主要因素，在我们的研究中，这种表现与大多数先前发表的论文一致。

肝硬化相关肠道菌群失调的致病作用可以简述如下。有益的Clostridia形成短链脂肪酸和其他有益产物，以加强肠道屏障。因此，在肝硬化中这些细菌的丰度减少与肠道屏障通透性的增加有关。有害的Proteobacteria产生内毒素，并且与Bacilli一起，作为兼性厌氧菌，能够穿透人体的活组织（细菌移位），导致全身炎症反应。后者促进了全身血管扩张、液体潴留、高动力循环，进一步加重了门静脉高压。

显然，我们首次发现在门静脉高压症中，无论是肝硬化还是非肝硬化，产甲烷古菌的含量减少。这些变化在肝硬化发病机制中的意义尚待确定。肥胖者的产甲烷古菌水平增加，而厌食症患者的产甲烷古菌水平降低，这可能与体重控制有关。肝硬化的特点是肌少症，肌肉和总体重下降，这可能与肠道中古菌缺乏有关。此外，产甲烷古菌在炎症性肠病中减少，这也可能表明它们对防止肠道损伤具有保护作用。

我们的研究还发现，与肝硬化患者相比，非肝硬化门静脉高压患者中属于Actinobacteria门的有益_Bifidobacteria_的水平显著增加。这可能是某种补偿反应，并且可能与这些患者肝功能的保留有关。测试这一假设是后续研究人员的任务。

有趣的是，无论PVT的起源如何，PVT患者的肠道微生物群中Porphyromonadaceae的丰度降低，这在无PVT的肝硬化中未观察到。这些细菌在人类肠道中的确切作用尚未确定，但已知它们在长寿老人的肠道中含量增加。需要进一步研究以澄清这个问题。

门静脉高压是如何导致肝硬化特异性肠道菌群失调的？我们可以假设，这是由于门静脉胃病和肠病的发展，这些疾病是对胃和肠道静脉血液淤积的反应。这可能导致胃和小肠保护功能的下降以及小肠运动的减慢。肝硬化特异性肠道菌群失调的特征是有害细菌的增长，这些细菌最有可能来自口腔。正常情况下，它们会在胃和小肠中死亡。然而，这些保护机制可能在门静脉高压的情况下受损。这与小肠运动减慢一起，可能导致它们过度生长并抑制有益细菌。需要新的实验和临床研究来验证这一假设。

检测门静脉高压中肠道菌群组成的紊乱可以作为开具影响肠道细菌群落的药物（包括益生菌）的指示。最近的综述表明，这些药物在肝硬化以及重症患者中具有积极效果。

我们的工作的优势在于，首次研究了非肝硬化门静脉高压症的肠道菌群组成，并将其与肝硬化的肠道菌群组成进行了比较，证实了这些病理条件下肠道菌群失调的相似性，这加强了关于门静脉高压在肝硬化中有害菌群失调发展中起关键作用的理论。

我们的研究局限性在于，研究的患者数量较少，这与NCPVT的相对罕见有关，而且我们无法进行额外的测试，例如测量肝静脉压力梯度、评估肠道屏障状态和小肠运动情况，以及抗菌分子的分泌，这些都是未来研究的挑战。分析门静脉高压中肠道菌群组成与其他指标的相关性仍然是未来研究的任务。另一个局限性是我们无法获得在参与者数量和所有感兴趣指标上均等的组别，这可能也是偏倚的来源。需要进一步研究以验证我们的发现。