光遗传学作为眼部疾病治疗的新方法Optogenetics as a Novel Therapeutic Approach for Ocular Disease

摘要

光遗传学是一个新兴领域，旨在通过选择性表达视蛋白（可被光照激活的通道蛋白）来研究神经细胞的生理学。一旦该方法确立，多个研究小组试图在受损神经组织中表达这些蛋白，以恢复适当的信号传导。多年来，研究人员已做出大量努力，试图恢复慢性退行性疾病患者（尤其是视网膜色素变性患者）的视力，临床试验已取得令人鼓舞的结果。然而，仍存在重大挑战，例如将信号传递到特定视网膜细胞的困难，以及复制靶细胞生理激活的复杂性。随着研究的继续，光遗传学仍是一个前景光明但不断发展的领域。本综述旨在突出光遗传学相对于当前可用策略的治疗优势，并促进对这一新兴学科的进一步科学探索。

关键词：光遗传学；视网膜色素变性；腺病毒；基因治疗；遗传性视网膜疾病；青光眼

1. 引言

光遗传学是一种突破性技术，能够利用光精确控制活体组织中特定类型的细胞。光遗传学起源于2006年卡尔·戴瑟罗斯的研究，其目标是通过编码光敏感通道蛋白的基因载体，使任何神经元细胞能够在光刺激下激活或抑制自身。在尝试应用这些技术时，由于激活或抑制程度的失调以及载体运输技术和蛋白质本身在细胞内过表达导致的结构改变，复制实际生理功能方面出现了困难。该技术的基础是"视蛋白"，这是一类七尾跨膜蛋白，能够通过光照调节其作用。视蛋白分为I型和II型。I型视蛋白存在于原核生物、藻类和真菌中；它们与11-顺式视黄醛相关联，光照后异构化为11-反式视黄醛，随后蛋白质构象变化允许离子通过。然后，11-反式视黄醛重新转化为11-顺式视黄醛，同时仍与蛋白质结合。II型视蛋白则存在于真核生物中，与G蛋白相关联，处于11-顺式视黄醛构象，光照后变为11-反式视黄醛；随后视黄醛从蛋白质上解离。这就是为什么I型视蛋白因其更快的激活和抑制动力学而在光遗传学研究中更受青睐，因为它们独立于11-顺式视黄醛重新结合时间和G蛋白相关途径。

最早应用的视蛋白是通道视紫红质-1（ChR-1），随后是从莱茵衣藻中分离出的ChR-2；暴露于蓝光（470纳米）会导致阳离子通道开启和通过，导致细胞去极化和激活。随后引入了盐视紫红质，最初是从嗜盐古菌Natronomonas pharaonis（NpHR）中分离出来的；暴露于黄光（580纳米）会导致其开启和氯离子通过，导致超极化和神经元失活。最后，从Halorubrum sodomense分离出的古菌视紫红质作为细胞外质子泵，能够超极化和抑制神经元；作用范围在绿黄光区域（566纳米）。

2006年，安丁的比等人研究小组首次提出了眼科领域的应用；他们证明在光感受器受损的视网膜组织中，通过使用腺相关病毒载体（AAV）运输的ChR，可以恢复视网膜信号和视觉皮层信号，这得益于神经节细胞的功能恢复；局限性在于ON和OFF细胞激活缺乏选择性，因此在光感受器受损的情况下，双极细胞成为理想的靶标。事实上，莱加利等人的研究表明，通过电穿孔引入ChR激活ON双极细胞可以产生类似生理的反应。然而，由于电穿孔在体内应用性不强，随后提出了腺病毒载体，其中最近开发的是"直接进化"载体，能够更高效地穿透视网膜各层，直达双极细胞，然后是光感受器和视网膜色素上皮；这是通过玻璃体内注射实现的，避免了更具侵入性的视网膜下注射。

2. 材料和方法

我们对文献进行了检索，包括截至2024年1月的所有出版年份，使用MEDLINE（PubMed）。首先使用以下关键词搜索数据库："光遗传学、视网膜色素变性、腺病毒、基因治疗、遗传性视网膜疾病、青光眼"。包括的出版类型有综述和临床试验。我们仅考虑英文研究和有摘要的研究，从而将数量减少到281篇论文。评估了所有检索到的文章的参考文献列表，以确定额外的相关研究。文章检索使用PubMed（访问于2023年10月1日）和Reference Citation Analysis（访问于2023年10月1日）进行。

3. 光遗传学在视网膜变性疾病中的应用

光遗传学已成为治疗视网膜疾病（特别是涉及退行性疾病的疾病）的一种有前景的治疗方法。通过选择性靶向特定视网膜细胞，光遗传学旨在恢复光感受器受损患者的视觉感知，提供功能视力恢复的潜力。

3.1. 视网膜变性疾病

3.1.1. 视网膜色素变性

在遗传性视网膜疾病中，视网膜色素变性（RP）是一组临床相似且基因异质的表型，其特征是视杆和视锥光感受器的原发性变性。它们分为综合征型和非综合征型RP亚型。非综合征型RP（作为该疾病最常见的亚型）的临床表现包括主要在生命前三十年发生的夜盲症的渐进模式，以及由于视杆细胞丢失导致的视野狭窄。晚期变性也涉及视锥细胞，导致中心视力丧失。RP是导致视觉残疾的主要原因，全球患病率为1:4000。随着疾病进展和视杆及视锥细胞完全丧失，基因和细胞替代疗法变得无效，有必要考虑其他旨在治疗晚期视网膜变性的方法。上述新方法可以由光遗传学代表，这仍是一个正在发展的领域。

3.1.2. Stargardt病

另一种进行性遗传性视网膜疾病是Stargardt病，主要影响负责精细视觉的视网膜中心部分——黄斑。它由ABCA4基因突变引起，该基因编码一种参与光感受器细胞中视黄醇运输的蛋白质。这种功能障碍导致毒性物质在视网膜细胞内积累，特别是在视锥细胞中，导致其变性和随后的视力丧失。早期症状通常包括视力模糊、在低光环境下视力困难和中心视力丧失，通常在儿童或青少年时期出现。与其他视网膜变性一样，一旦视锥细胞严重受损，针对潜在病因的治疗可能变得无效。然而，基因治疗和光遗传学方法正被探索为恢复视力的有希望策略。皮奥特等人（2021年）的研究探索了包括基因治疗和光遗传学在内的各种治疗方法，在临床前研究中取得了令人鼓舞的结果。在这方面，黄等人（2022年）的研究为Stargardt正在调查的治疗策略提供了见解，强调了光遗传学方法通过靶向幸存视网膜细胞来恢复部分功能性视力的潜力。

3.1.3. 年龄相关性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人视力受损的主要原因之一，主要影响55岁以上人群。与RP或Stargardt病不同，它并非严格意义上的遗传性疾病，尽管具有很强的遗传易感性。AMD被认为是一种多因素疾病，其中遗传倾向和环境因素（如衰老、氧化应激和炎症暴露）都起着重要作用。它是一种主要影响黄斑的视网膜退行性疾病，根据Ferris 2014分类，表现为中间型AMD（具有大型玻璃疣（大于≥125微米）或与玻璃疣相关的色素异常）和晚期AMD。晚期AMD有两种形式：干性（萎缩性）AMD，其特征是视网膜细胞逐渐分解；湿性（新生血管）AMD，其中异常血管在视网膜下生长并渗漏液体，导致进一步损伤。血管生成（VEGFA）、脂质运输和代谢（APOE）、细胞外基质调节（COL101A、MMP9和TIMP3）、全反式视黄醛代谢（ABCA4）以及补体级联（CFH、CFD、C3、C5、C7）等生化途径的基因改变涉及疾病发病机制。这些基因中的许多也参与调节氧化应激。例如，ABCA4功能障碍导致毒性双视黄醇如A2E的积累，这些物质在光照下产生活性氧（ROS）。同样，APOE和CFH的失调与视网膜细胞中抗氧化防御机制受损和对氧化损伤的易感性增加相关。这些改变加剧了线粒体功能障碍和慢性炎症，这两者都是氧化应激和光感受器变性的关键贡献因素。视网膜细胞的变性，特别是黄斑中的光感受器，导致显著的中心视力丧失，严重影响阅读和识别人脸等日常活动。

对于AMD的治疗，抗VEGF疗法靶向血管内皮生长因子（VEGF）以抑制异常血管的形成。它们已成为湿性AMD的主要治疗方法。这些疗法已被证明在防止进一步视力丧失方面相当有效，但它们不能恢复已丧失的视力。另一方面，基因治疗方法正被探索为解决潜在细胞变性的手段。研究人员正在开发基因编辑工具和病毒载体，以递送健康基因副本或沉默有害基因，旨在阻止甚至逆转退行过程。基于干细胞的疗法虽然有望替代受损的视网膜色素上皮（RPE）细胞，但目前面临几个限制。这些包括与细胞存活和整合相关的挑战、免疫排斥以及不受控制的细胞增殖风险。此外，分化效率和递送方法的变异性阻碍了这些治疗在临床环境中的可重复性和安全性。除这些治疗方法外，光遗传学正在成为恢复晚期AMD视力的一种有前景的方法。与旨在修复或替换受损基因的基因治疗不同，光遗传学涉及将光敏感蛋白引入幸存的视网膜细胞（神经节或双极细胞），以恢复光敏感性并使这些细胞能够将视觉信息传递给大脑。这种方法特别适用于已失去光感受器但仍有一些剩余视网膜细胞功能的患者。研究表明，光遗传学治疗可能有助于绕过受损的光感受器并恢复部分视力，特别是在地理萎缩患者中，这是一种严重的干性AMD形式。

3.2. 临床前研究

尽管光遗传学是一门不断发展的科学，但已进行了大量临床前和临床研究，临床前研究已在动物模型的视觉恢复方面显示出非常令人鼓舞的结果。最早的临床前研究之一表明，通过AAV转染到rd1小鼠视网膜神经节细胞中的Chop2-GFP嵌合体使视网膜神经节细胞能够将光信号编码为能够到达视觉皮层的动作电位。广岛富田等人研究了称为通道视紫红质-2（ChR2）的绿藻视紫红质古型，作为一种光遗传学工具，使ON型视网膜神经节细胞能够向啮齿动物皮层发送对光的电反应信号。光感受器变性的大鼠，在视网膜神经节细胞（RGCs）中表达ChR2并由Thy-1.2启动子调节后，已证明在明暗光栅期间有头部追踪行为。此外，发现了RGCs的电生理变化。这凸显了ChR2在视网膜色素变性患者中的应用潜力，旨在恢复他们的视力。

在视网膜疾病的临床过程中，如在rd1和rd10小鼠中所证明的，神经节和双极细胞相对保存完好，但由于光感受器及其突触的丧失，它们会经历退行性重塑。此外，在正常条件下，神经节细胞对光刺激的反应具有高度变异性：OFF神经节细胞减少其活性，而ON细胞增加其活性。基于这些认识，在光遗传学治疗中靶向神经节细胞可能很复杂。此外，由于处于视觉信息处理系统的更极端水平，由于双极细胞、无长突细胞和水平细胞缺乏处理，可能会发生电-视觉信息的丢失。然而，由于它们在视网膜层内的内部位置，这些细胞的获取很复杂。由于视网膜由分离良好的层和两个限制膜组成，从玻璃体腔进入最外层对载体来说很困难。因此，玻璃体内注射可能需要剥离内界膜（ILM），这是一种高度侵入性的程序，或者使用高浓度的腺病毒，这可能导致意外的炎症反应。替代的视网膜下注射则使患者面临高风险，如孔源性视网膜脱离。此外，开发具有双极细胞选择性启动子的载体并不容易，因为腺病毒载体可以携带小基因包，约5千碱基（kb）；因此，不可能使用大型、高度特异性的启动子，如双极细胞所需的L7，需要使用更压缩的启动子。目前正在进行大量关于动物模型中视蛋白使用的临床前研究，如表1所示。

帕梅拉·S·莱加利等人强调了将视网膜神经节细胞作为光遗传学治疗靶标的几个关键问题。作者在rd1小鼠中将ON双极细胞转染ChR2，实现了光敏感性的恢复。这一发现揭示了ON双极细胞的光敏感性，以及它们诱导RGCs光诱发尖峰活动的能力。此外，作者观察到了神经节细胞的瞬态反应和中心组织的维持。这些特性使得在啮齿动物视觉皮层中创建信息成为可能，使它们能够成功执行r。然而，Chr2对蓝光的光敏感性低，需要信号放大设备在时间、空间和强度方面高度精确，以产生类似生理激活的激活。此外，蓝光等波长的放大可能产生光毒性，会损害视网膜的残留细胞。这是因为蓝光谱中的光子比红光谱中的光子具有更大的能量；这种能量首先被内源性光敏剂如NADP和FMN吸收，然后通过光敏化传递给氧，产生自由基。此外，长期暴露于蓝光可能导致内在光敏感视网膜神经节细胞（ipRGCs）的过度激活，这些细胞能够调节褪黑激素的释放，可能导致昼夜节律的可能破坏。

为克服这一问题，贝里等人将中波长视锥视蛋白（MW-opsin）基因转移到rd1小鼠的ON和OFF视网膜神经节细胞中，并实现了对LCD屏幕上二维空间图案和内部光的三维物体识别的改进识别。韦尔登·W·赖特等人通过玻璃体内给予腺相关病毒（vMCO1）将ON双极细胞转染到rd10小鼠体内，该病毒具有多特征视蛋白，能够响应环境光刺激产生跨膜电流。他们的研究涉及分析径向视觉水迷宫中的视觉空间行为，与未使用MCO1的rd10对照组相比，转染MCO1的小鼠表现更快。与中波长视锥视蛋白（MW-opsin）相比，MCO1在光谱敏感性、快速反应时间和多次刺激的可重复性方面显示出更大的优势。格雷戈里·高万等人在非人类灵长类动物的周边黄斑视网膜神经节细胞中测试了AAV2.7m8—ChR-tdT（ChrimsonR-tdTomato）载体。在他们的研究中，他们计算了产生足够数量表达光遗传构建体细胞所需的感染剂量。他们使用了一种对红光有反应的视蛋白，具有更安全的暴露/反应剂量曲线。他们的观察是，这种类型的视蛋白仅对日常环境中不存在的光强度有反应。因此，他们使用了能够放大图像中的光子并触发表达细胞激活的外部刺激设备。然而，理解灵长类动物的视觉质量很复杂，因为到目前为止，视觉能力的恢复是通过关注对比敏感度和水平运动来评估的，排除了更复杂的功能，如面部识别或视觉记忆激活。

根据当前技术，光遗传学能够恢复的视力水平不超过法定盲，这引发了伦理问题：使患者接受具有未知长期影响的侵入性程序，而不会产生能够积极改善其生活质量的益处。

表1. 光遗传学治疗的临床前研究总结。

3.3. 临床应用

格雷戈里·高万等人的结果促成了PIONEER的启动，这是一项由GenSight Biologics（法国巴黎）赞助的1/2a期开放标签、剂量递增研究，旨在评估GS030在晚期非综合征型视网膜色素变性（RP）患者中的安全性和耐受性。该方法使用光敏感视蛋白ChrimsonR靶向视网膜神经节细胞（临床试验.gov标识符：NCT03326336）。除这项研究外，其他临床试验目前正在开展，如表2所示。

萨赫尔等人描述了PIONEER研究中一名58岁男性参与者部分视觉恢复的显著案例，该患者患有晚期非综合征型RP，仅存光感。在单次玻璃体内注射光遗传载体GS030-DP（通过AAV2.7m8载体递送的ChrimsonR-tdTomato）后，结合使用光刺激护目镜（GS030-MD）的视觉训练程序，患者的视觉感知、视觉运动协调和脑电图反应有所改善。该研究正在进行中，预计于2025年12月完成。

与此同时，RESTORE（NCT04945772）是一项已完成的2b期、多中心、随机、双盲、假对照、剂量范围研究，由Nanoscope Therapeutics赞助。它旨在评估单次玻璃体内注射MCO-010（一种通过病毒递送的靶向ON-双极细胞的多特征视蛋白）在RP成人患者中的有效性和安全性。虽然研究已经结束，但最终结果尚未公布（临床试验.gov，截至2025年2月9日）。

Nanoscope Therapeutics还进行了STARLIGHT（NCT05417126），一项评估单次玻璃体内注射vMCO-010在Stargardt病患者中安全性和有效性的临床试验。该疗法也靶向ON-双极细胞。在48周随访期间，黄斑受累的参与者表现出视力的渐进性改善。结果已提交并正在接受质量控制审查。此外，Nanoscope Therapeutics宣布计划启动MCO-010在Stargardt黄斑变性中的3期临床试验。值得注意的是，MCO-010已获得FDA快速通道指定和孤儿药指定，适用于RP和Stargardt病。

另一种有前途的方法是BS01，这是一项1/2期临床试验，评估BS01（一种基于AAV2的载体，编码ChronosFP——一种具有高光敏感性和快速动力学的光敏感视蛋白）玻璃体内注射的安全性和有效性。ChronosFP靶向视网膜神经节细胞，并与眼内编码器-换能器系统耦合，该系统将视觉输入转换为视网膜神经信号，有效模拟功能性前神经节视网膜。该试验目前处于招募阶段（临床试验.gov标识符：NCT04278131；截至2025年2月9日）。

4. 光遗传学在其他眼科疾病中的应用

一个最有前景但较少探索的领域是光遗传学在视神经疾病（特别是青光眼和缺血性视神经病变）中的应用。这些疾病是不可逆失明的主要原因，主要是由于视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突的变性。传统治疗主要集中在减缓疾病进展（例如，降低青光眼中的眼内压），但未能恢复丧失的神经功能。光遗传学不仅有可能用于神经保护，还可能用于这些视神经疾病的神经功能恢复。青光眼光遗传学研究的很大一部分集中在调节眼内压（IOP）上，这是该疾病中主要可调节的风险因素。传统的药物和手术干预通常提供不一致的结果，特别是在类固醇诱导的青光眼中，小梁网（TM）功能障碍导致眼内压升高。最近的光遗传学研究证明了通过靶向光激活精确控制TM功能的潜力。在一项开创性研究中，Kowal等人利用CRY2-CIBN光遗传学系统调节OCRL 5-磷酸酶的活性，OCRL 5-磷酸酶是一种参与维持TM细胞中细胞骨架动力学的酶。通过将CRY2-OCRL构建体通过AAV2载体递送到前房并应用蓝光刺激，他们成功逆转了小鼠模型中类固醇诱导的TM功能障碍。这种光遗传学方法导致房水流出增强和相应的眼内压降低，突显了一种用于管理类固醇诱导的眼内高压的新型非侵入性策略。同时，光遗传学已显示出作为神经保护工具的前景，不仅靶向眼睛，还靶向大脑中的视觉中心。该领域最具创新性的研究之一是由Geeraerts等人进行的，他们研究了在青光眼小鼠模型中上丘（SC）的光遗传学刺激的神经保护作用。上丘是RGCs的主要投射目标，在视觉处理和对视觉刺激的运动反应中起着关键作用。研究人员使用稳定化阶梯函数视蛋白（SSFO）实现SC神经元的持续激活，只需最小的光暴露。这种靶向刺激导致RGC损失减少了63%，表明增强SC中的神经元活动促进了向视网膜的逆行神经保护信号。这些发现突显了大脑靶向光遗传学疗法作为青光眼传统眼部治疗的补充方法的潜力。虽然神经保护对于阻止疾病进展至关重要，但治疗视神经疾病的最终目标是恢复视觉功能。光遗传学通过使幸存的RGCs对光敏感，从而绕过受损的光感受器和视神经纤维，提供了一条有希望的途径来实现这一目标。在一篇全面的综述中，Prosseda等人详细介绍了旨在恢复视神经病变中视觉功能的各种光遗传学策略。一种方法涉及使用ChR2和黑视蛋白（OPN4），通过AAV介导的基因递送引入RGCs。这些视蛋白赋予剩余视网膜神经元光敏感性，即使在晚期视神经损伤的情况下，也能部分恢复视觉感知。这种方法特别有利，因为它独立于视神经疾病的潜在遗传原因，使其适用于从青光眼到缺血性视神经病变的各种情况。初步临床试验已经显示出令人鼓舞的结果。晚期视神经损伤的患者在接受光遗传学治疗后表现出部分光感知恢复，标志着视力恢复领域的一个重要里程碑。此外，最近针对视神经损伤的临床前研究表明了有希望的结果：例如，在视神经挤压（ONC）的动物模型中，AAV介导的F-iTrkB递送导致显著的视网膜神经节细胞保护、轴突再生和视觉功能改善，通过视动反应和视觉诱发电位（VEPs）测量。

然而，功能结果仍受到光强度要求和重新激活神经元的空间分辨率等因素的限制。为解决这些挑战，研究人员正在开发红移视蛋白，它们对更长波长的光有反应，允许更深入的组织穿透和更自然的视觉体验。

5. 结论

光遗传学代表了眼科领域的一项重大进展，为治疗视网膜变性疾病（包括视网膜色素变性、Stargardt病和年龄相关性黄斑变性）提供了有希望的治疗策略。恢复幸存视网膜细胞（如神经节和双极细胞）的光敏感性，为晚期视网膜变性患者带来了希望，否则这些患者将无法通过传统的基因和细胞替代疗法治疗。通过使用光敏感视蛋白，光遗传学技术在绕过受损光感受器、恢复功能性视力方面显示出相当大的潜力。

临床试验，如探索MCO和ChR2使用的试验，正逐渐将这些临床前成功转化为人类应用，在晚期视网膜疾病患者中证明了视觉功能的部分恢复。此外，光遗传学有望用于治疗视神经疾病，如青光眼和缺血性视神经病变，传统治疗主要集中在减缓疾病进展，但无法恢复丧失的视觉功能。通过利用光来调节神经元活动，光遗传学可能为神经保护和恢复以前被认为不可逆的疾病的视力提供一条新途径。

尽管这些结果令人鼓舞，但在将光遗传学疗法完善为广泛临床应用方面仍存在若干挑战。光强度要求、潜在视网膜细胞损伤以及视蛋白表达精准靶向等问题需要解决。然而，随着视蛋白技术、病毒载体递送系统和个人化治疗策略的不断进步，光遗传学有望彻底改变视网膜变性疾病和视神经疾病的治疗，为全球数百万患者带来希望。未来的研究和临床试验对于优化这些技术、确保安全性、有效性和长期益处至关重要，这些益处适用于因视网膜和视神经病理而遭受视力丧失的个体。

作者贡献

概念化，E.M.V.和S.M.；方法学，E.M.V.和S.M.；软件，S.M.、F.M.和M.C.；验证，E.M.V.；正式分析，S.M.、M.B.和F.M.；调查，M.C.、M.B.和F.M.；资源，S.M.、F.M.、M.B.和M.C.；数据整理，S.M.；撰写—初稿准备，E.M.V.和S.M.；撰写—审阅和编辑，S.M.、F.M.、M.B.和M.C.；可视化，M.B.、M.C.和F.M.；监督，E.M.V.；项目管理，E.M.V.。所有作者均已阅读并同意发表版本的手稿。

资金

本研究未获得外部资金支持。

机构审查委员会声明

不适用。

知情同意声明

不适用。

数据可用性声明

本研究的原始贡献包含在文章中。进一步的查询可直接向通讯作者提出。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

参考文献

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表2. 光遗传学治疗的临床试验总结。

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