摘要
儿童期是造血系统发育和血液疾病易感性的关键时期。本研究构建了健康人骨髓的多模态单细胞图谱，捕获了90,710个细胞的mRNA和表面蛋白表达，包括来自9名2-32岁捐赠者的20,000多个造血干细胞和祖细胞（HSPC）以及间充质基质细胞（MSC）。年幼儿童（YP，<10岁）骨髓在组成和分子特征上与青少年和年轻成人（AYA，≥13岁）骨髓存在明显差异：YP骨髓以B细胞生成为主导，而AYA骨髓则表现出髓系和T细胞分化偏向。对6例骨髓活检样本（0-23岁）的空间转录组学分析证实了这些年龄依赖性变化。两种淋巴祖细胞（LyP）亚群调控了这种谱系转变：10岁前富集的CD127+ LyP细胞具有B细胞偏向性输出，而10岁后则以兼具淋巴和髓系特征的CD127- LyP细胞为主。骨髓基质信号也显示出相应的年龄依赖性变化，YP骨髓间充质基质细胞产生的白细胞介素-7（IL-7）较AYA显著增加，表明在发育过程中微环境调控了HSPC的谱系分化潜能。这一单细胞图谱为理解造血系统发育和血液疾病的早期起源提供了全面资源。
结果
参考图谱显示儿童骨髓的单细胞组成
为揭示人类儿童骨髓的细胞和转录组景观，我们建立了一个实验流程，能够在保留天然细胞频率信息的同时对罕见骨髓细胞类型进行单细胞分析（图1a和补充图1）。骨髓样本取自7名健康儿童捐赠者（4名女性和3名男性，年龄2.1-16.7岁，中位年龄9.6岁），均作为同种异体造血细胞移植的供体（补充表1）。为实现对HSPC和MSC的深入分析并以经济高效的方式准确估计代表性细胞频率，从每位捐赠者中分离出三个细胞组分：非富集的红细胞去除CD235a-组分、HSPC富集的CD235a-CD34+组分和MSC富集的CD235a-CD45loCD90+或CD235a-CD45loCD271+组分。每位捐赠者的富集细胞组分与基因型不同捐赠者的非富集细胞组分混合（补充图1）。捐赠者特异性单核苷酸变异（SNVs）使得测序后可将细胞分配到富集和非富集组分以确定天然细胞频率。使用10x Genomics平台进行基于CITE-seq的单细胞转录组和表面蛋白表达联合分析，并采用138种寡核苷酸偶联抗体的定制面板（图1a）。
经过质量控制和阈值设定后，儿童数据集包含68,094个高质量细胞，RNA模态中位数为每个细胞5,133个转录本和2,001个独特基因，蛋白模态中位数为每个细胞1,307个计数和114个独特蛋白（扩展数据图1a-h）。跨捐赠者和测量模态的整合揭示了28个高分辨率簇。这些簇使用已发表数据集、经典标记基因和差异表达的转录本及蛋白进行注释，得到8个主要造血群体和28个亚群：HSPC（8个亚集，包括造血干细胞、淋巴-髓系预备祖细胞、巨核细胞-红系祖细胞等）、B细胞和浆细胞（6个亚集）、T细胞和自然杀伤（NK）细胞（7个亚集）、髓系群体（3个亚集）和树突状细胞（2个亚集；图1b和补充表2）。红系和基质细胞不含进一步亚集（图1b）。所有捐赠者都贡献了每个亚集（扩展数据图1i）。
骨髓中的年龄相关细胞和转录变化
接下来，我们利用CITE-seq参考图谱探索从婴儿期到青春期骨髓组成的发育变化。非富集细胞组分的分析显示，2.1-9.6岁捐赠者（n=4，2男2女；补充表1）中B系细胞高度富集，占据骨髓细胞的大部分（图2a），这与先前在外周血中的观察一致。相比之下，13.3-16.7岁捐赠者（n=3，1男2女；补充表1）的骨髓组成表现出髓系和T细胞的主导地位（图2a）。为验证所观察到的组成差异是否持续到成年期，我们将数据集扩展至包括两名成年骨髓捐赠者（20.7岁和31.3岁，均为女性，11,278和11,338个细胞；补充表1）。这两名成年个体的骨髓组成与13.3-16.7岁捐赠者非常相似（图2a），使我们能够定义两个年龄类别：YP（年龄<10岁）和AYA（年龄13-31岁；图2b）。B系细胞在YP组中显著更高（中位数49.7%对13.9%），而T细胞（中位数18.6%对10.4%）和髓系细胞（中位数51.7%对24.0%）在AYA组中富集（图2c）。为验证这些年龄相关差异，我们对来自独立队列的3名YP（两名男性和一名女性，年龄0.7、1和1.5岁）和3名AYA捐赠者（均为男性，年龄13.5、17和23岁；补充表7和8）的骨髓穿刺活检进行了空间转录组学分析。这些骨髓活检中的细胞组成分析显示YP样本中B系细胞更丰富（YP中位数34.6%对AYA中位数9.1%），而AYA样本中髓系细胞更普遍（YP中位数36.1%对AYA中位数58.2%；图2d,e和扩展数据图3）。这些发现表明YP骨髓与AYA骨髓不同，其特征是从婴儿期到成年早期从B细胞谱系偏向性向T细胞和髓系输出增加的转变。
YP B系细胞偏向性源于LyP细胞
我们进一步探索了所观察到的B、T和髓系细胞频率的年龄相关差异是否伴随着这些群体或其上游祖细胞的转录变化。为确定这些频率变化是反映跨造血细胞类型的共享衰老程序还是仅限于特定造血细胞群体，我们在CITE-seq数据中比较了28个骨髓亚簇（如图1b所定义）中YP和AYA骨髓的每个亚簇的单细胞转录组和表面标记表达。差异表达分析鉴定出约5,000个基因（扩展数据图4a和补充表9）和约200个在YP和AYA骨髓群体间差异表达的表面蛋白（扩展数据图4b和补充表10）。在5,000个差异表达基因中，大多数是细胞类型特异性的：YP骨髓中上调的基因67%和AYA骨髓中上调的基因62%仅在单个细胞群体中显著改变（例如，仅限于HSCs、前B细胞或经典单核细胞；扩展数据图4和5）。相比之下，少数基因，如CD59（AYA骨髓中表达更高）和CD74（YP骨髓中表达更高）在多种细胞类型中一致上调或下调（扩展数据图4和5）。
为评估YP和AYA骨髓之间差异表达基因是否对B细胞谱系与髓系命运施加谱系偏向性，我们计算了谱系特异性模块评分。这些评分是通过聚合YP和AYA细胞群体之间的差异表达基因（补充表9）然后分配给CITE-seq数据中的每个单个细胞生成的。然后在所有28个骨髓细胞群体（如图1b和补充图3和4所定义）上可视化平均模块表达，重点关注从HSC到B细胞谱系的分化轨迹中的群体（HSC、LMPP和LyP；图2f-h）。由HSC中差异表达基因（例如，IGFBP2和PROK2；补充表8）和LMPP（例如，CD24；补充表9）衍生的模块在B细胞和髓系群体之间均匀分布（图2f,g和补充表9），表明尽管早期祖细胞（HSC和LMPP）在从YP到AYA阶段的成熟过程中经历了转录变化，但这些差异并未赋予谱系分化偏向性。相比之下，由YP上调的LyP基因（例如，EBF1和CD79A；补充表9）衍生的模块在B细胞群体（前B、前-B、幼稚/记忆B和浆细胞）中富集，相比于其他骨髓细胞群体（图2h和补充图3）。相反，在AYA LyP与YP LyP中上调的基因模块（例如，CD37和SPINK2；补充表9）在HSC、LMPP、原髓细胞、髓细胞、经典单核细胞和非经典单核细胞中富集（补充图3）。
不同的LyP亚群与年龄相关谱系偏向性相关
接下来，我们进一步解析LyP群体，以调查该群体内的异质性是否可以解释YP和AYA骨髓之间B细胞谱系与髓系偏向性的差异。LyP细胞的亚聚类揭示了两个具有独特转录组和蛋白质组特征的不同群体（亚簇1和2；图3a）。两个亚簇都表现出LyP的标志性特征，包括经典LyP转录本（例如，IGLL1和DNTT）和表面蛋白（CD34+CD90-CD45RA+；扩展数据图7）的表达。通过映射到Deeply Integrated Human Single-Cell Omics（DISCO）外部参考数据集，该身份得到进一步验证，其中两个亚簇都被注释为LyP（扩展数据图8）。
亚簇1显示出高水平的B系细胞相关基因（EBF1、CD79A和VPREB1）表达和高水平的CD127（白细胞介素-7受体）表面蛋白表达（图3b,c和补充表11和12），此后被称为B细胞偏向性LyP（LyP-B）。亚簇2显示出与干性（例如，SPINK2、ABCB1和LRMDA）、髓系（LGALS1、CSF3R和CLEC12A）和淋巴细胞谱系基因（CD37和SPIB；图3b）相关的基因高水平表达。该簇中的细胞还表现出髓系（例如，CD123和CD33）和淋巴系（例如，CD18和CD155）标记物的蛋白表达增加（图3c），被称为稳定LyP（LyP-S）。基因本体论术语富集分析支持了这一功能区别，LyP-B细胞富集于与B细胞受体信号传导和淋巴细胞增殖及分化相关的通路，而LyP-S细胞则富集于与髓系白细胞活化、单核细胞分化和B细胞活化相关的通路（图3d）。
基因调控网络推断显示LyP-B细胞中B系细胞相关调控子活性增加（例如，PAX5、LEF1和TCF3），而LyP-S细胞则富集于与一般淋巴发育和干性相关的调控子（例如，ELF4、RXRA和KLF4；图3e和补充表13）。为在造血层级中可视化这两种LyP亚群，我们创建了一个扩散图，结合了B细胞和髓系轨迹（从HSCs到LMPP、LyP、循环前B细胞和前B细胞，以及从HSCs到LMPP、原髓细胞、髓细胞和经典单核细胞；图1b和扩展数据图7b）。当注释到此轨迹上时，LyP-B细胞定位于更接近前B细胞群体的位置，而LyP-S细胞则位于更接近LMPP和原髓细胞的位置（扩展数据图7e），支持尽管两种LyP亚群均在LMPP下游产生，但LyP-B细胞表现出B细胞谱系偏向性，而LyP-S细胞保持更广泛、更多能的潜能。
虽然两个LyP亚群在所有个体中都存在，但LyP-B细胞在YP骨髓中显著更丰富，而LyP-S细胞在AYA骨髓中占主导（LyP-B中位数74.4%对26.9%；图3f）。值得注意的是，在两名成年个体中的一名（20.7岁），LyP-B细胞仅在富集组分中检测到（图3f），强调了该亚群在成人中的稀有性。细胞周期分析显示YP样本中循环LyP-B细胞（S + G2/M）的比例趋势高于AYA样本（中位数45.2%对24.5%；图3g），这可能促使其丰度增加。此外，每个个体中LyP-B细胞的频率与B系细胞的总体百分比显著相关（图3h）。
年龄依赖性基质信号驱动LyP谱系偏向性
B系细胞分化部分由骨髓微环境内MSC的细胞外信号调控。为探索基质信号是否以年龄依赖性方式调控LyP亚群，我们使用NicheNet推断LyP-B和LyP-S细胞之间差异的配体-受体相互作用。我们根据对LyP-B和LyP-S细胞之间差异表达基因（如EBF1、ZCCHC7和GLRX（LyP-B）以及CD37、ATP8B4和LGALS1（LyP-S））的预测调控影响以及这些配体匹配受体在LyP-B和LyP-S细胞之间受体的差异表达，优先考虑表达的配体。生长因子IGF2、支持淋巴的细胞因子IL-7和免疫球蛋白超家族成员BTLA被确定为LyP-B细胞的顶级候选配体（图4a）。IL-7对B系细胞转录因子（包括EBF1、LEF1和PAX5）表现出最强的预测影响（图4a）。相比之下，多效性细胞因子转化生长因子-β1（TGFβ1）被确定为LyP-S细胞的顶级候选调控因子（图4a）。
两种配体都显示出交叉调控潜力：IL-7影响某些LyP-S靶基因（例如，LGALS1、RFLNB和MAP3K8），而TGFβ1影响某些LyP-B基因（例如，HMGB1、SOCS2和IL7R；图4a），支持其相互调控关系。我们对CITE-seq数据的受体分析显示，LyP-B细胞上白细胞介素-7受体α链（IL-7Rα，由IL7R编码；倍数变化（FC）：7.01）及其共受体共同γ链（IL2RG；FC：1.45）的mRNA表达显著增加。这通过CD127（IL-7Rα）蛋白水平表达增加得到证实（图3c）。相反，LyP-S细胞表达更多TGFBR1 mRNA（FC：2.26；图4b）。
为确定骨髓中这些配体的细胞来源，我们在CITE-seq数据中映射了所有骨髓细胞类型（如图1b所定义）的IL7和TGFB1表达。虽然TGFB1在树突状细胞、髓系细胞、NK细胞和T细胞中广泛表达，但IL7表达主要局限于MSC（图4c）。IL7和TGFB1都显示出年龄依赖性模式：YP MSC中的IL7 mRNA表达高于AYA MSC，而TGFB1 mRNA在AYA骨髓细胞中的表达高于YP骨髓细胞（图4d,e）。为验证IL-7的年龄依赖性可用性，我们使用基于珠子的多重免疫测定法量化了独立队列78名捐赠者（0-20岁；中位年龄8岁；47名男性和31名女性捐赠者；补充表14）骨髓血浆（定义为骨髓穿刺液的无细胞部分）中包括IL-7在内的12种细胞因子和生长因子的浓度。IL-7浓度在YP骨髓血浆中显著高于AYA（2.6对2.0 pg ml−1；图4f）。其他细胞因子，如IL-15、IL-3或IL-34，未显示年龄依赖性差异（图4f）。
讨论
本研究编制了健康儿童骨髓的全面多模态单细胞分析，包括单细胞转录组学、细胞表面蛋白质组学和空间转录组学，以绘制从婴儿期到成年早期（0-32岁）人类发育过程中HSPC谱系命运决定的图谱。我们发现YP骨髓（<10岁）偏向于B系分化，而AYA骨髓则以T细胞和髓系群体为主导。这种年龄依赖性谱系转变由两种不同的LyP亚群驱动：在10岁前富集的CD127+ LyP（转录预设为B细胞输出，LyP-B），以及从≥13岁开始占主导的具有T细胞和髓系特征的CD127+ LyP。这些变化与骨髓MSC信号的年龄相关差异相关，其特征是从出生到成年早期IL-7产生减少，以及AYA中TGFβ信号增加，表明微环境来源的信号是跨发育过程中HSPC谱系偏向性的关键调控因子。
我们确定了两个在表面标记表达、谱系分化程序和年龄依赖性丰度方面不同的LyP细胞转录和表型亚群。我们的数据与之前报道人类LyP内类似异质性的基于流式细胞术的研究一致。高达57%的多能LyP（CD34+CD38−Thy-1neg-loCD45RA+）从成人骨髓中体外和体内生成B细胞、T细胞和髓系后代，反映了残留的髓系潜能。在人源化小鼠中的研究表明，CD34+CD38loCD45RA+ITGB7+祖细胞可分为CD127−和CD127+ LyP亚群，分别偏向NK细胞-先天淋巴细胞-T细胞或B细胞谱系。虽然CD127− LyP细胞分化已与FLT3信号传导相关，但CD127+ LyP细胞的扩增被认为主要是细胞自主的。我们的数据通过识别微环境来源的IL-7作为CD127+ LyP细胞的HSPC外在调控因子，完善了这一模型，塑造了NK细胞-先天淋巴细胞-T和B细胞谱系输出之间的发育平衡。
我们的工作强调了骨髓基质信号在驱动造血年龄依赖性变化中的关键作用。基质衍生因子，包括FLT3L、CXCL12和IL-7，是B细胞淋巴细胞生成的既定调控因子。我们表明，骨髓基质细胞IL7的表达从出生到成年早期逐渐下降，与LyP细胞中从B细胞谱系向髓系分化的转变相吻合。骨髓来源血浆中IL-7蛋白浓度的测量支持了我们转录组数据的功能相关性。
最后，健康儿童淋巴谱系内观察到的发育状态与B细胞急性淋巴细胞白血病中报道的转录组异质性非常相似。来自年幼儿童的大量白血病样本显示出比AYA个体更强的B细胞谱系转录特征，而AYA个体则具有更多多能性转录谱。这些年龄依赖性白血病状态反映了此处确定的LyP细胞的年龄依赖性转录程序。由于儿童B细胞急性淋巴细胞白血病的起源细胞可能在临床诊断前数年出现，可能在胎儿发育期间，这些发现表明骨髓微环境介导的B细胞谱系分化的指导在恶性环境中得以保留。YP骨髓中升高的IL-7可诱导前白血病状态，因此可能促进获得额外的致癌事件。鉴于淋巴靶向治疗的日益应用以及谱系转换作为逃逸机制的潜力，操纵骨髓微环境的谱系指导信号可能提供相关的治疗策略。
总之，我们提供了从出生到成年早期（0-32岁）健康儿童骨髓的全面参考，并将我们的数据集作为伴随本文的在线资源公开提供。儿童和成人骨髓之间的差异强调了在解释疾病相关变化时使用年龄匹配参考的重要性。通过实现此类比较，我们的儿童单细胞图谱为未来儿童血液疾病研究奠定了基础。此外，它揭示了可能影响儿童和青少年血液恶性肿瘤发生时间和易感性的年龄特异性调控机制。
【全文结束】
