主要发现
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肝脏运动因子GPLD1靶向衰老大脑血管系统上的GPI锚定蛋白
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脑血管内皮细胞上的GPI锚定TNAP破坏血脑屏障并损害认知功能
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增加GPLD1或抑制TNAP可恢复衰老过程中的血脑屏障功能和认知能力
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增加GPLD1或抑制TNAP可改善阿尔茨海默病病理
摘要
血液因子能够独立于身体活动将运动的益处传递给衰老的大脑。本文表明，肝脏来源的运动因子（exerkine）——GPI特异性磷脂酶D1（GPLD1），一种GPI降解酶，通过靶向脑血管系统逆转衰老和阿尔茨海默病相关的记忆功能丧失。GPLD1具有切割100多种潜在GPI锚定蛋白的能力，因此需要确定介导认知恢复的下游靶点，以实现治疗应用。我们发现脑血管系统上的GPI锚定组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）是GPLD1的底物。模拟衰老过程中脑血管TNAP的增加会损害年轻小鼠的血脑运输和认知功能，并减弱GPLD1在衰老小鼠中诱导的认知益处。在衰老过程中抑制TNAP重现了GPLD1的益处，恢复了海马体的年轻转录特征并挽救了认知功能。在阿尔茨海默病模型中，增加GPLD1或抑制TNAP可改善Aβ病理并提高认知缺陷。因此，我们确定脑血管系统是肝脏-大脑运动轴认知益处的中介者。
图形摘要
关键词
- 衰老
- 恢复活力
- 阿尔茨海默病
- 运动
- GPLD1
- 肝脏
- 血管系统
- 血脑屏障
- 血液因子
- 认知
引言
运动可以逆转大脑衰老的广泛细胞和分子标志，挑战了长期以来认为与年龄相关的认知功能障碍是一个刚性过程的观点。在海马体——一个对记忆至关重要的脑区，且对衰老的有害影响高度敏感——老年小鼠的跑步运动增加了再生能力，增强了突触可塑性，减轻了神经炎症，并提高了相关认知功能。在阿尔茨海默病（AD）病理的动物模型中，运动已被证明可以改善学习和记忆。在人类中，增加身体活动与降低痴呆风险、减缓随年龄增长的认知下降以及延迟痴呆发作相关，即使在常染色体显性AD形式中也是如此。不幸的是，老年人常常因身体和医疗限制而难以持续进行运动。因此，确定替代方法来提供运动的认知益处而无需身体活动，可能提供一种独特且未被探索的治疗方法。
我们和其他研究人员最近证明，将运动小鼠的血液血浆系统性地输注给久坐不动的小鼠，可以在不进行身体活动的情况下将运动对衰老大脑的益处传递给久坐不动的小鼠。我们确定了GPI特异性磷脂酶D1（GPLD1）——一种肝脏来源的GPI降解酶——作为运动诱导的循环血液因子（exerkine）。虽然我们证明了GPLD1在老年小鼠中具有显著的认知益处，但GPLD1具有切割100多种潜在GPI锚定蛋白的能力。因此，为了探索肝脏来源的GPLD1在大脑衰老中的治疗潜力，确定介导认知恢复的下游细胞和分子靶点对于将肝脏来源的GPLD1应用于AD等痴呆相关神经退行性疾病的转化应用非常重要。有趣的是，增加系统性GPLD1改善了认知功能，但并未轻易进入大脑，突显了尚未确定的外周作用机制。
为了研究GPLD1下游的因子，我们使用生物信息学和针对性候选测试，确定了脑血管系统上强烈上调的GPI锚定组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）是GPLD1的底物。模拟脑血管TNAP表达的年龄相关增加会损害年轻小鼠的血脑屏障（BBB）功能和认知能力，并减弱GPLD1在老年小鼠中诱导的认知益处，而抑制TNAP活性则重现了GPLD1给药在老年小鼠中的转录和认知效应。我们发现，在AD病理的5xFAD小鼠模型中，运动后肝脏GPLD1增加，而在老年人和AD个体的脑中TNAP水平升高，与健康年轻人相比。此外，增加肝脏来源的GPLD1或抑制TNAP活性可逆转AD相关的海马体转录特征，改善Aβ病理并提高认知缺陷。这些发现表明，脑血管系统是肝脏来源的运动血液因子恢复认知益处的重要中介者。
结果
GPI锚定TNAP是衰老海马体血管系统上GPLD1的底物
首先，我们验证了与久坐对照组相比，老年小鼠肝脏中GPLD1表达在自愿运动干预后的增加（图S1A-S1E）。我们使用体内水动力尾静脉注射（HDTVI）介导的过表达方法模拟老年小鼠肝脏中运动诱导的GPLD1增加。我们评估了健康指标和海马体依赖性记忆，使用新物体识别（NOR）和Y迷宫行为任务（图S1F-S1L）。年轻对照小鼠在NOR和Y迷宫测试中分别对新物体和新臂表现出偏好，而老年对照小鼠则没有偏好（图S1G和S1H）。然而，GPLD1处理的老年小鼠逆转了与年龄相关的认知障碍（图S1G和S1H）。为了确定介导肝脏来源GPLD1这些认知恢复效应的潜在下游外周细胞和分子靶点，我们专注于候选GPI锚定蛋白的分析。
首先，我们利用公开的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，并调查了148种潜在GPI锚定蛋白在组织中的细胞表达（图1A；表S1）。我们观察到内皮和上皮细胞上GPI锚定蛋白的高浓度（图1A），提出血管系统可能是血液和大脑界面的GPLD1潜在靶点。
我们接下来分析了小鼠脑内皮细胞（BECs）上年龄相关的GPI锚定蛋白表达变化，使用了年轻和老年小鼠的公开RNA-seq数据集。我们发现了11个上调和2个下调的基因，其中alkaline phosphatase, biomineralization associated（Alpl）（编码TNAP）是年龄增长中最显著增加的基因之一（图1A和1B）。虽然其规范功能仍不完全清楚，但TNAP是四种碱性磷酸酶（AP）同工酶之一，其规范作用是促进组织矿化和血管钙化。最近的研究表明，年龄相关的脑血管TNAP增加会损害血脑运输，而TNAP抑制可恢复年轻的血脑运输。因此，我们决定研究血管TNAP是否是GPI锚定的GPLD1底物。
在海马体中，我们发现了TNAP血管表达和AP活性染色的年龄相关增加（图1C-1E，S1M和S1N）。在其他脑区也观察到类似的增加（图S2A和S2B）。此外，我们观察到与久坐老年小鼠相比，运动老年小鼠的脑血管中TNAP表达和AP活性下降（图1F-1H），而海马体中的Alpl mRNA表达保持不变（图S1O）。
为了研究TNAP是否是GPI锚定的GPLD1底物的可能性，我们首先选择利用体外方法。GPLD1的催化活性依赖于His133，His133→Asn（H133N）或His158→Asn（H158N）氨基酸取代消除了其酶活性，我们使用已知GPLD1底物ALPP的切割报告基因测定验证了这一点（图S2F）。我们接下来生成了一个组成性表达TNAP的报告基因细胞系，其中可以通过测量细胞培养基中TNAP的AP活性来评估切割，因为TNAP在从质膜切割和释放后。
TNAP表达细胞用小鼠或人GPLD1、催化失活的H133N或H158N GPLD1或绿色荧光蛋白（GFP）对照处理（图1I和S2G）。我们在用小鼠GPLD1或人GPLD1处理的细胞培养基中检测到TNAP介导的AP活性显著增加，但在用催化失活的H133N或H158N GPLD1或GFP对照处理的细胞中未检测到（图1J和S2G），确定TNAP是GPLD1的直接GPI锚定底物。
为了研究血管TNAP是否是体内GPI锚定的GPLD1底物，我们评估了老年小鼠海马体血管系统中TNAP表达和AP活性的变化，这些小鼠肝脏来源的GPLD1增加（图1K）。老年雄性小鼠通过HDTVI给予编码GPLD1、催化失活的H133N GPLD1或GFP的表达构建体，并评估了海马体血管系统上的TNAP表达和AP活性（图1K-1M）。与催化失活的H133N GPLD1或GFP对照治疗组相比，肝脏来源的GPLD1增加导致海马体血管系统中血管TNAP表达和AP活性染色降低（图1L和1M）。肝脏来源的GPLD1也在调查的其他脑区降低了AP活性染色（图S2C和S2D）。
值得注意的是，我们观察到GPLD1治疗不会改变老年海马体中Alpl的mRNA表达（图S1P），表明在GPLD1处理的老年小鼠中观察到的TNAP蛋白表达下降不是由于mRNA水平的变化。此外，我们在另一组老年小鼠中独立测量了基线和肝脏来源GPLD1急性表达后的循环TNAP水平，并观察到循环TNAP增加（图S2H和S2I）。鉴于循环TNAP本质上必须来自被切割的质膜蛋白，GPLD1治疗后血液水平的增加为进一步证明体内TNAP切割提供了证据。综合这些数据表明，脑血管TNAP是GPI锚定的GPLD1底物。
增加肝脏来源的GPLD1恢复衰老海马体的BBB功能
在确定TNAP是GPLD1底物并考虑到脑血管TNAP表达增加在衰老中对血脑运输功能障碍的作用后，我们接下来研究了增加肝脏来源的GPLD1对衰老海马体BBB功能的影响（图2A）。老年小鼠通过肝特异性腺相关病毒（AAV）给予编码GPLD1或催化失活的H133N GPLD1的表达构建体（图2A和S2E）。为了建立年龄相关BBB功能变化的基线，给予年轻小鼠肝特异性AAV编码H133N GPLD1的额外对照组（图2A）。我们在几个高度血管化组织中评估了GPLD1表达，并观察到仅在肝脏中选择性增加，进一步验证了AAV递送方法的特异性（图S2E）。
为了评估BBB通透性，一部分动物系统性地给予小分子示踪剂N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）-生物素（图2B）。与年龄相关的功能失调血脑运输一致，我们在老年相比年轻对照动物的海马体中检测到许多NHS-生物素从血管外部泄漏的热点（图2B）。然而，增加肝脏来源的GPLD1导致老年海马体广泛区域的血管NHS-生物素泄漏显著减少（图2B）。
在衰老的脑血管系统中，还报道了从受体介导的运输向小窝转胞作用的转变。为了评估受体介导的运输，一部分动物系统性地给予荧光标记的经典配体转铁蛋白（TF-647）（图2A和2C）。在老年相比年轻对照动物的海马体中观察到TF-647运输的年龄相关减少；然而，在老年GPLD1治疗组中，这种减少部分得到缓解（图2C）。
接下来，我们通过测量小窝的配体非特异性小窝蛋白Caveolin-1（Cav1）的表达来检查小窝，Cav1是小窝的结构蛋白，随年龄增加。虽然在老年相比年轻对照动物的海马体血管上检测到Cav1表达增加，但在增加肝脏来源GPLD1的老年动物中，Cav1表达显著降低（图2D）。综合这些数据表明，增加肝脏来源的GPLD1改善了衰老海马体的BBB功能。
为了深入了解增加肝脏来源GPLD1在BECs中诱导的分子变化的机制，我们使用了scRNA-seq。BECs从表达肝脏来源GPLD1或H133N GPLD1的老年小鼠，或表达肝脏来源H133N GPLD1的年轻小鼠的海马体中分离（图2E）。鉴定了动脉、毛细血管和静脉簇（图2F和S3A-S3E）。我们检测到由于衰老在BECs中发生的显著转录变化（图2G），其中超过38%在增加肝脏来源GPLD1后恢复到年轻表型（图2G）。随后，我们专注于分析在衰老中变化但在GPLD1治疗后得到挽救的差异表达基因（DEGs）（图1G和S3F-S3H）。基因本体论（GO）分析的DEGs确定了与炎症过程、能量代谢和蛋白质稳态相关的生物过程（图2H）。这些单细胞转录组学数据表明，增加肝脏来源的GPLD1部分地恢复了衰老海马体中BECs的更年轻转录特征。
模拟脑血管TNAP的年龄相关增加破坏海马体BBB功能并损害认知
虽然脑血管TNAP表达增加已被证明会损害向衰老大脑的适当血脑运输，但其对认知的影响尚未被探索。因此，我们使用细胞类型特异性病毒介导的过表达方法，在年轻小鼠中评估了模拟脑血管TNAP表达年龄相关增加对BBB功能和海马体依赖性记忆的功能后果。
年轻小鼠通过尾静脉注射给予BEC特异性AAV编码TNAP或作为对照的mRuby2（Ruby）（图3A和S4A-S4C）。在AAV-TNAP注射后，在海马体血管系统上确认了TNAP表达和AP活性的增加（图3B和S4C-S4E）。
BBB功能使用NHS-生物素示踪剂和荧光标记的转铁蛋白进行评估（图3A）。过表达脑血管TNAP的年轻动物与年轻对照动物相比，表现出海马体血管NHS-生物素泄漏增加和TF-647运输减少（图3C和3D）。同时，我们在TNAP过表达后观察到血管上Cav1表达增加（图3E）。
海马体依赖性记忆使用NOR、Y迷宫和放射臂水迷宫（RAWM）行为范式进行评估（图3F）。在NOR测试期间，年轻对照小鼠对新物体表现出偏好，而过表达脑血管TNAP的年轻小鼠则没有偏好（图3G）。在Y迷宫测试中，治疗组之间未观察到差异（图3H）。在RAWM范式的训练阶段，所有小鼠表现出相似的空间学习能力（图3I）。然而，过表达脑血管TNAP的年轻小鼠在任务的测试阶段表现出学习和记忆平台位置的损害，与年轻对照小鼠相比犯了更多错误（图3I）。在各组之间未观察到健康指标的差异（图S4F-S4L）。这些数据表明，增加的脑血管TNAP损害了海马体的BBB功能，并且是物体和空间记忆的负调控因子。
恢复脑血管TNAP的年龄相关增加减轻肝脏来源GPLD1在衰老中的认知益处
接下来，我们研究了增加肝脏来源GPLD1在老年小鼠中的认知益处是否可以通过恢复脑血管TNAP表达的年龄相关增加而减轻。老年小鼠通过尾静脉注射给予肝特异性AAV编码GPLD1和BEC特异性AAV编码TNAP或Ruby对照（图4A）。给予尾静脉注射肝特异性AAV编码催化失活的H133N GPLD1和BEC特异性AAV编码Ruby的老年小鼠被包括在内作为阴性对照（图4A）。在老年小鼠中病毒介导的脑血管TNAP过表达后，观察到的GPLD1介导的血管TNAP AP活性减少被消除（图4B）。
海马体依赖性学习和记忆使用NOR、Y迷宫和RAWM进行评估（图4A-4E）。与表达血管Ruby的H133N GPLD1处理的老年小鼠相比，增加肝脏来源GPLD1并表达血管Ruby对照的老年小鼠对新物体和新臂表现出偏好，并在寻找隐藏平台时犯了更少的错误（图4C-4E）。然而，GPLD1介导的认知益处在NOR和RAWM测试中（但不是Y迷宫测试中）被过表达脑血管TNAP的老年小鼠消除（图4C-4E）。同样，TNAP表达消除了GPLD1处理小鼠中观察到的一些健康指标的改善（图S4M-S4S）。这些体内病毒介导的过表达和行为数据表明，靶向GPI锚定的脑血管TNAP部分调控了增加肝脏来源GPLD1对老年小鼠物体和空间记忆的认知益处。
靶向脑血管TNAP逆转衰老相关认知障碍
为了确定选择性靶向脑血管TNAP表达的年龄相关增加对认知功能的影响，我们使用病毒介导的体内CRISPR-Cas9方法生成了年龄控制的BEC特异性条件性Alpl基因敲除小鼠。诱导型Cas9转基因老年小鼠通过尾静脉注射给予BEC特异性AAV编码Cre和靶向Alpl或安全港位点的引导RNA序列作为对照（图4F，S5A和S5B）。在AAV注射后，在海马体血管系统和额外脑区确认了AP活性的降低（图4G，S5C和S5D）。
海马体依赖性学习和记忆使用NOR、Y迷宫和RAWM进行评估（图4F）。与老年对照小鼠相比，脑血管TNAP表达的消除导致NOR测试中对新物体的偏好以及RAWM测试中寻找隐藏平台时犯的错误减少（图4H和4J）。虽然在Y迷宫测试中组间未观察到差异，但在条件性敲除小鼠中观察到整体健康指标的选择性改善（图4I和S5E-S5I）。
接下来，我们将增加肝脏来源GPLD1在老年小鼠中的认知益处与使用更治疗可行的药理学方法抑制血管TNAP活性的影响进行了比较。给予HDTVI编码催化失活H133N GPLD1表达构建体的老年小鼠在食物中给予口服生物可利用的非脑穿透性TNAP抑制剂（TNAPi）（SBI-425）或载体对照（图4K）。给予编码GPLD1的表达构建体并给予对照食物的老年小鼠被包括在内作为GPLD1介导认知益处的阳性对照（图4J）。在TNAPi治疗后，在海马体血管系统上确认了AP活性的降低（图4L）。
与老年对照小鼠相比，TNAP活性的抑制导致物体记忆（NOR测试）和空间记忆（RAWM测试）的认知改善，与增加肝脏来源GPLD1的老年动物的改善程度相似（图4M和4O）。虽然增加GPLD1处理的老年小鼠在Y迷宫测试中表现出工作记忆的改善，但在TNAPi治疗后未观察到变化（图4N）。在TNAP活性抑制或增加肝脏来源GPLD1的老年小鼠中检测到整体健康指标的选择性改善（图S5J-S5P）。综合这些行为数据表明，靶向血管TNAP可以在老年时部分挽救物体和空间记忆，与增加肝脏来源GPLD1的认知益处相当。
抑制TNAP活性重现肝脏来源GPLD1在衰老中的海马体转录特征
为了深入了解机制，我们进一步比较了在老年小鼠中血管TNAP抑制和增加肝脏来源GPLD1表达后海马体BECs和实质中诱导的细胞和分子变化，使用scRNA-seq和海马体实质的单核RNA测序（snRNA-seq）（图5A）。
首先，我们从TNAPi治疗后的老年小鼠中分离BECs，并与来自老年对照的BECs相比检测到显著的转录变化（图5B和S3A-S3E）。随后，我们专注于分析GPLD1和TNAPi治疗后保守的DEGs，并观察到显著的重叠，GPLD1治疗组中65%的DEGs与TNAPi组保守（图5B和5C）。保守DEGs的GO分析确定了炎症过程、能量代谢和蛋白质稳态作为两种干预措施之间的共享生物过程（图5D，S3H和S3I）。
此外，我们在衰老、GPLD1和TNAPi比较中观察到530个DEGs的重叠，其中97.3%恢复到更年轻的水平（图5E）。我们在scRNA-seq数据集中确定的几个DEGs，包括Vcam1和Ppia（亲环素A），先前已被证明与大脑衰老和血管功能障碍有关（图5F）。综合这些单细胞转录组学数据表明，增加肝脏来源GPLD1以及TNAP抑制部分地恢复了衰老海马体中BECs的更年轻转录特征。
由于已显示恢复脑血管功能障碍的干预措施可调节衰老大脑中的神经炎症、再生和认知功能，我们接下来使用互补的snRNA-seq方法调查了驻留在脑实质中的细胞类型基因表达变化。
从表达肝脏来源GPLD1的老年小鼠、TNAPi治疗的老年小鼠或表达H133N GPLD1的对照小鼠的海马体中分离细胞核，并通过snRNA-seq进行分析（图5A和5G）。确定了22个细胞簇，并比较了治疗组之间的群体（图5H和S6A-S6D）。我们检测到在TNAPi治疗或增加肝脏来源GPLD1表达的老年小鼠海马体中，神经元群体和小胶质细胞的显著转录变化，与表达肝脏来源H133N GPLD1的对照治疗老年小鼠相比（图5H和5I）。
在TNAP抑制后诱导的转录变化中，约30%与增加肝脏来源GPLD1表达诱导的变化保守（图5H，5I，S6E和S6F）。我们发现海马体中的转录响应在不同细胞类型中编码，包括上调和下调基因的组合，DEGs在很大程度上是细胞类型特有的（图5H和S6G-S6I）。TNAPi和对照治疗组之间DEGs的GO分析确定了与突触可塑性相关的生物过程，与增加肝脏来源GPLD1表达后观察到的变化一致（图5J，5K，S6J和S6K）。
对保守DEGs的聚焦分析显示，大多数保守的转录响应是细胞类型特有的，小胶质细胞和兴奋性神经元群体（CA1/2/3）表现出最大的变化（图5I，S6E和S6I）。DEGs的GO分析确定了与突触可塑性和行为相关的生物过程，进一步支持我们在GPLD1和TNAPi治疗组中观察到的认知改善（图4K-4O和5J-5N）。
由于我们在小胶质细胞簇中观察到显著的基因表达变化，我们接下来通过评估补体成分1q（C1q）的水平来补充转录组学数据，C1q是一种参与突触修剪的小胶质细胞衍生补体因子，已知随年龄增加。我们观察到在TNAPi治疗和增加肝脏来源GPLD1的老年小鼠海马体中，与对照组相比C1q表达减少（图5O）。
由于技术限制，星形胶质细胞在我们的snRNA-seq方法中未被稳健捕获；因此，我们评估了老年海马体中的星形胶质增多症水平，并在GPLD1和TNAPi治疗组中检测到胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达减少（图5P）。这些数据表明，靶向TNAP活性可以部分重现增加肝脏来源GPLD1的老年小鼠海马体中观察到的转录组特征。
肝脏来源的GPLD1随运动增加并在AD病理模型中挽救海马体转录特征
衰老导致对AD等痴呆相关神经退行性疾病的易感性。相应地，我们接下来探索了增加肝脏来源GPLD1在改善AD病理和相关认知缺陷方面的转化潜力，使用转基因AD小鼠模型。我们选择了表达人类Amyloid-β前体蛋白（APP）和Presenilin-1（PSEN1）转基因的5xFAD模型，该模型在APP/PSEN1中有五个AD相关突变，代表一个具有相对早期AD病理和认知缺陷的转基因模型，这些缺陷在正常衰老相关认知下降之前就已观察到。
我们试图利用5xFAD模型中AD病理的快速进展性质，以区分Gpld1在老年野生型（WT）小鼠中针对年龄特异性损伤的有益效果与在年轻年龄通常缺乏自然年龄相关认知损伤的5xFAD小鼠中针对AD病理的有益效果。我们让成熟5xFAD小鼠进行3个月的自愿轮式跑步运动（图6A）。使用NOR评估海马体依赖性认知功能。与久坐不动的同类相比，运动5xFAD小鼠在新物体上花费了显著更多的时间（图6B）。
我们检测到在运动5xFAD小鼠与久坐不动5xFAD小鼠的肝脏（循环GPLD1的主要来源）中GPLD1表达增加（图6C），其中GPLD1表达与NOR任务中的表现呈正相关（图6D）。这些数据表明，运动在成熟5xFAD小鼠中增加了肝脏GPLD1表达，同时认知功能得到改善。
为了调查增加肝脏来源GPLD1在5xFAD小鼠海马体中诱导的细胞和分子变化，我们进行了snRNA-seq分析。成熟5xFAD小鼠通过HDTVI给予编码GPLD1或GFP对照的表达构建体（图6E）。给予HDTVI编码GFP的年龄匹配WT同窝仔鼠对照小鼠被包括在内，以评估AD病理诱导的基线变化（图6E）。确定了20个细胞簇，并比较了基因型和治疗组之间的群体（图6F和S7A-S7D）。
我们在5xFAD相比WT对照小鼠的海马体中检测到兴奋性神经元群体（齿状回[DG]和CA1）中的显著转录变化（图6G），以及在增加肝脏来源GPLD1表达后（图6G）。在5xFAD中检测到的转录变化中，接近30%在GPLD1处理的5xFAD组中恢复到WT条件（图6G，6H，S7E和S7F）。我们发现海马体中检测到的转录响应在不同细胞类型中编码，包括上调和下调基因的组合，这些基因在很大程度上是细胞类型特有的（图6G，S7G和S7H）。
5xFAD小鼠和GPLD1治疗后DEGs的GO分析确定了与神经发生和突触相关的生物过程（图6I，6J，S7I和S7J）。随后，我们专注于分析在5xFAD小鼠中变化但在GPLD1治疗后得到挽救的DEGs，与WT对照条件相比（图6H，S7E和S7F）。大多数挽救的转录响应是细胞类型特有的，兴奋性神经元群体（DG和CA1）表现出最大的变化（图6H，S7E和S7K）。
DEGs的GO分析确定了与神经发生和突触相关的生物过程（图6K和6L）。与转录组学数据一致，我们在GPLD1处理的5xFAD小鼠海马体中观察到成人神经发生（MCM2阳性神经祖细胞和doublecortin[DCX]阳性新生神经元）增加和脑源性神经营养因子（BDNF）水平升高，BDNF是一种参与突触可塑性的神经营养因子（图6M-6O）。
此外，我们调查了小胶质细胞簇，并观察到与对照5xFAD小鼠相比，在GPLD1处理的5xFAD小鼠中几种疾病相关小胶质细胞（DAMs）标志物和炎症基因的表达减少，这些基因先前在AD病理的小鼠模型中报道过（图S7L）。最后，我们评估了海马体中的星形胶质增多症水平，并检测到GFAP表达降低（图6P）。这些转录组学数据表明，增加肝脏来源的GPLD1挽救了在AD病理小鼠模型中诱导的海马体转录特征。
增加肝脏来源的GPLD1或抑制TNAP活性可改善小鼠AD病理和认知缺陷
在5xFAD小鼠中，AD病理已被证明对运动敏感，轮式跑步后β-淀粉样蛋白（Aβ）负担减少并改善认知功能。因此，我们评估了过表达肝脏来源GPLD1的5xFAD小鼠、表达GFP的5xFAD小鼠或表达GFP的WT同窝仔鼠对照的海马体中Aβ病理和认知缺陷的变化（图7A）。
我们观察到GPLD1处理的5xFAD小鼠与GFP对照5xFAD小鼠相比，硫黄素S阳性淀粉样蛋白沉积和Aβ表达减少（图7B-7E）。我们检查了海马体和皮层中的APP处理，并观察到C末端片段减少，而全长APP水平没有变化（图S8A-S8J），表明GPLD1处理的5xFAD小鼠中APP处理发生变化。
此外，我们评估了健康指标，包括筑巢评分和海马体依赖性记忆（通过NOR和Y迷宫），并观察到GPLD1处理后5xFAD小鼠在筑巢形成、物体记忆和工作记忆方面的功能改善（图7F-7H）。在另一组小鼠中，我们使用主动位置回避任务评估了空间学习和记忆，并观察到5xFAD相比WT同窝仔鼠对照的损伤，这些损伤在增加肝脏来源GPLD1的5xFAD小鼠中部分恢复（图S8K-S8N）。
GPLD1在5xFAD小鼠中的功能益处与年龄匹配的WT GFP对照动物观察到的基线水平相当（图7F-7H和S8O-S8R）。为了确定介导认知恢复的GPI锚定GPLD1靶点是否同样可以改善AD病理，我们首先评估了老年人和AD个体脑中TNAP的表达，并通过蛋白质印迹分析观察到与健康年轻人相比水平升高（图7I和7J）。
接下来，我们检查了GPLD1处理的5xFAD小鼠海马体中TNAP表达和AP活性的变化，并观察到与表达GFP的5xFAD小鼠相比，在增加肝脏来源GPLD1后减少（图7K-7M）。因此，我们研究了在5xFAD小鼠中靶向TNAP活性对Aβ病理和认知功能的影响。
成熟5xFAD小鼠在食物中给予TNAPi或载体对照（图7N）。给予对照食物的年龄匹配WT同窝仔鼠对照小鼠被包括在内，以评估AD病理导致的基线变化（图7N）。我们通过筑巢评分评估了健康指标，并通过NOR和Y迷宫评估了海马体依赖性记忆。
在5xFAD小鼠中抑制TNAP活性导致硫黄素S阳性淀粉样蛋白沉积和Aβ表达减少（图7O-7R），并在筑巢形成和物体记忆方面功能改善，但与对照条件相比工作记忆未改善（图7S-7U和S8S-S8V）。综合这些数据表明，增加肝脏来源GPLD1或抑制其GPI锚定底物TNAP的活性可以改善AD小鼠模型中的Aβ病理和认知缺陷。
讨论
综合起来，我们的数据显示，肝脏来源的运动因子GPLD1通过靶向脑血管系统上的GPI锚定TNAP逆转了衰老和AD病理模型中的记忆丧失。从转化角度看，这些数据进一步表明，在缓解神经退行性疾病病理方面具有显著的治疗潜力，类似于运动的益处，但独立于身体活动。
在衰老过程中针对脑血管健康的广泛治疗方法可能非常适合减缓AD相关认知功能障碍的进展。脑血管系统在衰老过程中显示出显著变化，包括血管密度减少和BBB功能失调。脑血管完整性的破坏现在也被认为是AD的标志性特征，这在人类的全基因组、神经病理学、神经影像学和脑脊液（CSF）研究中得到了强调。在AD连续体中的个体中，脑血管和BBB损伤的CSF和神经影像学生物标志物在明显的痴呆症状之前就已显现，并与认知和功能症状相关。即使是被认为代表早发性AD病理的常染色体显性AD形式，也会在症状出现前长达十年显示脑血管损伤。总之，血管破坏是衰老和AD中的早期现象，并与AD患者认知症状的发作和进展密切相关。令人兴奋的是，脑血管系统对血液干预敏感。因此，使用年轻血液因子或靶向促衰老因子的治疗已被证明可以促进血管生长并恢复功能，无需直接递送到大脑。
在这方面，GPLD1作为一个有吸引力的治疗候选物出现，可以改善认知，可能通过调节影响大脑血管功能的因素。事实上，脑血管TNAP活性增加已被证明会促进BBB功能的破坏，我们现在在功能上将其与衰老和AD病理小鼠模型中的认知缺陷联系起来。因此，GPLD1对血管GPI锚定TNAP的切割指向适当的血脑运输作为恢复老年人和AD个体认知的一个潜在脑血管靶点。
事实上，TNAP抑制已被证明可以将老年动物的血脑运输恢复到年轻水平。虽然当前治疗AD的方法主要集中在靶向中枢神经系统内的神经病理学，但我们研究肝脏-大脑运动轴的工作加强了靶向血液和外周组织中互补分子因子治疗痴呆相关神经退行性疾病的可能。
我们的研究具有重要的转化潜力，确定了GPLD1下游的GPI锚定蛋白作为潜在的治疗靶点。然而，应该注意的是，虽然抑制血管GPI锚定TNAP部分重现了肝脏来源GPLD1在衰老和AD病理模型中的认知益处，但GPLD1的益处可能是通过靶向不同细胞类型上的多个GPI锚定蛋白的结果。
事实上，在Y迷宫测试中观察到的GPLD1介导的认知益处对工作记忆的影响在老年小鼠中增加脑血管TNAP表达后并未减弱。在机制上，下游GPLD1靶点的益处可能与其他已知的运动诱导因子协同工作，如irisin、胰岛素样生长因子1（IGF1）、clusterin、血小板因子4（PF4）和硒蛋白P（SEPP1）。
因此，未来的研究阐明每个因子是否通过汇聚或分散的细胞靶点和分子途径发挥作用非常重要。鉴于个体似乎沿着不同的衰老轨迹进展，成功开发旨在恢复老年认知的未来疗法可能需要识别汇聚机制，其激活可能提供多种运动诱导血液因子的附加益处。
更广泛地说，GPLD1最近被报道在已知延长寿命的小鼠模型的肝脏和血浆中增加，包括生长激素受体敲除小鼠、Snell侏儒、热量限制和雷帕霉素等化合物的治疗。在这方面，我们的数据提出了一个令人兴奋的可能性，即肝脏来源GPLD1的益处可能不仅限于认知恢复和改善衰老大脑中的神经退行性疾病病理，还可能促进机体水平的整体长寿。
研究局限性
海马体snRNA-seq和BEC scRNA-seq分析开始解析增加肝脏来源GPLD1如何在衰老和AD小鼠模型中促进认知益处的机制。我们注意到，由于技术限制，我们的细胞核分离和测序方法未捕获足够数量的星形胶质细胞用于snRNA-seq分析。此外，某些细胞群体（如激活的小胶质细胞）中的转录变化通常难以通过snRNA-seq解决，样本的汇集限制了我们评估个体间变异性的能力。
尽管我们通过免疫组织化学分析补充了转录组学数据，并观察到各种条件下星形胶质增多症减少，但这些数据对这些细胞群体中发生的分子变化提供的见解有限。在海马体以外的几个脑区观察到TNAP活性增加。同样，GPLD1治疗以及我们的病毒介导表达方法在大脑中更广泛地靶向脑血管TNAP。
虽然我们的分析主要集中在海马体功能上，但我们的数据显示GPLD1和TNAP操作的影响可能扩展到未调查的额外脑区。在外周，生物信息学分析还确定了外周免疫细胞上GPI锚定蛋白的富集，暗示与年龄相关系统性炎症增加有关的分子变化作为改善认知的GPLD1额外潜在下游靶点。
我们预计这些数据将促使进行机制和转化研究，阐明在衰老和疾病中GPLD1治疗后观察到的认知益处的海马体中鉴定基因和外周GPI锚定蛋白的贡献。
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