代谢功能障碍相关脂肪肝病（MASLD）及其进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是全球性的医疗挑战。男性和女性在MASLD和MASH的患病率和机制上的异质性与肝脏内不同性激素信号传导以及衰老过程中激素水平下降有关。在本研究中，我们使用生物化学特征化的多能干细胞衍生的3D肝球模型来模拟“培养皿”中睾酮和雌激素信号对代谢性肝病的保护作用。我们识别出性类固醇依赖性的基因表达变化，这些变化对代谢功能障碍、纤维化和晚期肝硬化模式的基因表达具有保护作用，从而为MASLD和MASH的发病机制提供了新的见解，并突出了新的药物靶点。此外，我们还强调了已经存在药物的基因靶点，以便在未来进行转化研究。
为了研究激素信号的影响，女性肝球在诱导脂肪变性之前暴露于生理浓度的17β-雌二醇（E2）。基因表达通过NanoString代谢和纤维化面板进行分析，并与MASLD和MASH（SteatoSITE）的临床数据库进行基准对比（涵盖疾病F0/1到F4阶段）。未经E2处理的LPO处理的女性肝球与F4样本表现出强烈的关联（ρ = 0.46，P < 0.0001 vs. LPOE，ρ = 0.41，P < 0.0001），而性别分层分析中（ρ = 0.34，P < 0.001 vs. ρ = 0.32，P < 0.01）也表现出相似的关联。代谢等效的男性肝球在诱导脂肪变性之前暴露于生理浓度的10^-8 M睾酮（T）。尽管经过激素治疗后男性肝球有所改善，但添加T并未像E2预处理的女性肝球那样纠正晚期纤维化基因表达。
为了更好地理解细胞水平上的激素信号效应，我们采用了单核RNA测序（snRNA-seq）。女性肝球由肝细胞（HEP）、肝前体细胞（HB）、增殖性肝细胞（Proliferative HEP）和死亡肝细胞（Dying HEP）、内皮细胞、间充质祖细胞、间充质基质细胞（MSC）、静止（qHSC）和激活（aHSC）的肝星状细胞组成。暴露于LPO后，我们在HB、HEP和MSC簇中观察到细胞数量增加。然而，经过E2处理后，Proliferative HEP簇中表达癌症标志物的细胞更多，这突显了基于激素疗法的风险。此外，在HEP簇中，DLGAP1下调（> 1.5倍），而PTP4A1和ABCA1上调（> 1.45倍）。在E2处理的肝前体细胞中，疾病标志物ANKRD1下调（> 1.5倍），而脂肪代谢标志物ABCA1上调（> 1.45倍）。有趣的是，我们检测到了一个单独的Dying HEP簇，在该簇中MT-ATP6在E2处理后下调（> 1.45倍）。在间充质祖细胞中，我们观察到自噬标志物MT-CO3在E2处理后下调（> 1.4倍）。在MSC簇中，GK、KYNU、ADARB1和IGFBP4上调（> 1.5倍），而ARHGEF28（> 1.5倍）和MT-CYB（> 1.4倍）在E2处理后下调。
男性肝球由肝细胞（HEP）、包括成熟肝细胞（Mature HEP）、未成熟肝细胞（Immature HEP）、受损肝细胞（Injured HEP）、增殖性肝细胞（Proliferative HEP）和死亡肝细胞（Dying HEP）；肝前体细胞（HB），还包括胆管肝前体细胞（Cholangiocyte HB）和代谢肝前体细胞（Metabolic HB）；内皮细胞、间充质祖细胞、脂纤细胞、间充质基质细胞（MSC）、静止（qHSC）和激活（aHSC）的肝星状细胞组成。LPO处理的肝球在Mature HEP、Injured HEP和Dying HEP簇中的细胞数量比T处理的细胞多。此外，T处理的肝球在Immature HEP和MSC中的细胞数量减少，而在Proliferative HEP、HB、Metabolic HB和Cholangiocyte HB簇中的细胞数量增加。激素处理细胞中差异表达的基因包括在肝细胞中APOA1和AQP4-AS1上调（> 两倍），在肝前体细胞中CKB、FTL、TTR和APOA1上调（> 两倍）。值得注意的是，在激素处理的间充质祖细胞中LAMA2下调（> 七倍）。在MSC簇中，AFF3（> 六倍）、SLIT3（> 三倍）、MIR99AHG、ROR1、MEIS1、UNC5C、MAP2、MT2A、MLLT3、LSAMP、NRXN3、KIF26B、TANC1、NHS、NTNG1、ANO4和HMGA2下调（> 两倍）。而在HSC标记物中，SLIT3（> 4.5倍）、PCDH9（> 三倍）、UNC5C、LSAMP、RUNX1T1、PDZRN4、MIR99AHG、PDGFRA、CASC9和VAV3在T处理后下调（> 两倍）。
综上所述，E2处理在女性肝球中表现出对晚期肝硬化的保护作用，增加了与乙醇代谢、尿素生成、糖代谢、脂质生成、药物代谢、免疫反应和纤维化相关的基因表达。按性别分层进一步识别了参与MASH的其他基因，包括葡萄糖代谢和胰岛素敏感性、尿素生成和脂质形成。我们还发现了与文献中不同的基因表达差异。以前的研究表明CYP8B1、PKLR和SLC2A2在人类和小鼠MASLD中上调，而我们的数据支持了SteatoSITE的结果，这些差异可能是由于先前的研究没有按性别分层或仅在雄性实验系统中测试。正如详细描述的，E2处理在晚期MASH基因表达方面比T具有更大的保护作用。E2处理对肝细胞和肝前体细胞的发展具有保护作用，下调了DLGAP1和ANKRD的表达，增加了PTP4A1和ABCA1的表达。在间充质祖细胞簇中，MT-CO3下调表明自噬减少。同样，E2处理导致与葡萄糖（GK）和色氨酸代谢（KYNU）相关的基因表达增加。而炎症（ADARB1）、线粒体损伤（MT-CYB）和肝硬化（ARHGEF28）标志物的表达减少。在男性肝球中，T添加导致肝细胞和肝前体细胞中APOA1表达增加，表明脂质稳态改善。我们还观察到AQP4-AS1表达增加，这可能与免疫系统的抑制有关。T处理的肝前体细胞也减少了EMT标志物（CKB）的表达，同时保持了胰岛素敏感性标志物（TTR）。此外，我们检测到铁蛋白轻链（FTL）表达减少，这是MASH患者中常见的上调基因。在间充质祖细胞中，T下调了与晚期纤维化相关的LAMA2表达。此外，T在MSCs中通过抑制TGFβ信号（SLIT3）、抑制凋亡（UN5C）和癌症发展（ROR1、MT2A）以及减少脂质积累（HMGA2、MIR99AHG和NRNX3）表现出保护作用。T还下调了与炎症和从MASLD到HCC转变相关的基因（ANO4；HMGA2；MAP2、NTNG1和KIF26B；MEIS1和MLLT3；NHS）的表达。有趣的是，HCC抑制剂LSAMP、免疫调节因子AFF3和肝损伤标志物TANC1在T预处理后显著下调。这与文献报道的数据相反。总的来说，T处理的肝球显示出与凋亡（PCDH9）、癌症进展（CASC9和LSAMP）和脂质积累（VAV3）相关的基因表达下调。此外，纤维化（PDGFRα）和糖酵解相关基因表达在激素治疗后也减少。虽然性激素对MASH的发展具有保护作用，但基因特征因性别而异。值得注意的是，对于MASLD/MASH中受损通路，如肝细胞代谢（ADH1C和CPS1）、胰岛素敏感性和葡萄糖代谢（PKLR、FTL和TTR）、脂质积累（ABCA1）、MASLD向癌症转变（MT2A和MAP2）以及纤维化和瘢痕形成（CKB、PDGFRα）已批准有药物（
总之，我们的研究确定了MASLD和MASH进展中的性别差异，E2和T在对抗终末期疾病方面发挥保护作用。特别是，我们强调了新的性别特异性基因表达模式，其中一些靶点已经可以药物干预。我们认为，我们的研究强调了在人类生物医学研究中基于性别建模的重要性。
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