摘要
心肌梗死(MI)仍然是全球主要的死亡原因。尽管已知不同类型细胞之间复杂的相互作用决定了MI后整体愈合反应，但组织结构的精确变化仍不甚清楚。在本研究中，我们结合基于成像的转录组学（分子地图学）和基于抗体的高度多重成像（序列免疫荧光），生成了小鼠MI急性期的整合细胞图谱。这使我们能够在亚细胞分辨率下随时间评估细胞类型组成和变化。我们观察到白细胞通过心内膜被招募到梗死心脏，并使用深度视觉蛋白质组学(DVP)进行无偏空间蛋白质组分析，以研究潜在机制。DVP在MI后24小时鉴定出血管性血友病因子(vWF)是炎症上调的介质，功能阻断vWF减少了C-C趋化因子受体2(Ccr2)阳性单核细胞的浸润并恶化了MI后的 cardiac功能。
主文
心肌梗死(MI)是一种急性疾病，其特征是由于局部缺氧导致的心肌组织细胞死亡，引起细胞组成和组织结构的大幅变化。尽管在MI的预防和治疗方面取得了显著进展，但MI仍然是全球主要的死亡原因。尽管恢复心肌血流（称为再灌注）和药物治疗策略的进步已大幅降低了短期死亡率，但MI后的长期死亡率仍然很高。死亡率居高不下的一个原因是，我们尚不了解急性疾病期间的分子信号和组织微环境变化如何长期影响愈合和重塑。在急性梗死期间，心脏中的坏死细胞释放应激信号，包括促炎性细胞因子和趋化因子，导致免疫细胞—特别是中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞(Mo/Mɸ)以及随后的T细胞、B细胞和自然杀伤细胞—侵入梗死区域。调节浸润梗死区域的免疫细胞类型和数量已被假定为改善MI后愈合和结局的潜在治疗靶点。因此，更好地了解MI早期阶段免疫细胞浸润途径、详细组织微环境和心脏内细胞相互作用有望提供潜在的新型治疗策略。
已在人类和小鼠中对MI过程中免疫细胞浸润的时间动力学进行了广泛研究。已使用左心室心肌组织的荧光激活细胞分选(FACS)生成免疫浸润的细胞计数估计。单细胞RNA测序(scRNA-seq)进一步揭示了浸润坏死心肌的不同免疫细胞亚型及其不同的通路活性和生理作用。最近的两项研究将单核RNA测序(snRNA-seq)与非靶向空间转录组学相结合，研究小鼠MI中的梗死边界区域。将空间读数与全基因组范围的测量相结合，这两项研究确定了梗死边界区域的重要转录特征。另一项生成人类MI空间多组学图谱的大型研究也使用非靶向转录组学研究人类MI进展过程中的不同细胞邻域和组织结构。尽管这些研究能够将MI期间的关键分子模式和过程与其空间背景联系起来，但由于所用技术的空间分辨率有限（约55 µm），它们无法准确量化组织微环境和细胞邻域，这实际上每次测量捕获了10-20个细胞的混合物。具有亚细胞分辨率的新型靶向空间组学技术正在改变我们对健康和疾病中组织结构和相应细胞类型相互作用的理解。测量数十至数千个转录本、抗体或两者结合的高度多重方法能够详细描述稳态和疾病期间变化的细胞表型和邻域。此外，计算机视觉的发展现在能够使用自动细胞分割和分类算法进行细胞识别。
在本研究中，我们分别使用基于RNA检测的荧光原位杂交(FISH)条形码（分子地图学）和基于抗体的序列免疫荧光(SeqIF, Lunaphore COMET)的组合成像技术，来表征小鼠急性MI期间变化的组织微环境。随后，我们开发了可扩展的计算管道(nf-core/molkart)，针对心脏组织定制，使用最先进的方法处理这些复杂的高度多重成像数据集。在急性梗死心脏的时间过程中（梗死前对照、MI后4小时、24小时、2天和4天），在微创MI模型中，我们使用分子地图学和SeqIF能够在单细胞分辨率下表征急性MI微环境。从这个MI的时空图谱中，我们发现髓系细胞（特别是Mo/Mɸ）不仅通过边界和心外膜梗死区域进入梗死区域，还通过此前未知的心内膜梗死区域进入。在梗死后24小时对心内膜区域进行激光显微切割，随后进行超灵敏蛋白质组学分析，以研究这种浸润途径，揭示了炎症和凝血因子的局部特征，并强调vWF是心内膜细胞中免疫介导的因子。为进一步研究vWF的作用，在MI后的第一天基于抗体的功能阻断vWF显示出通过心内膜途径Mo/Mɸ浸润的显著减少和左心室功能的降低。因此，我们的研究表明，据我们所知，心内膜对免疫细胞通过局部上调粘附因子（如vWF）浸润至梗死区域具有关键作用。这些结果揭示了此前未知的免疫细胞浸润途径，并为药理学干预提供了新的潜在靶点。
结果
急性MI的单细胞分辨率空间转录组学分析
为了表征小鼠心脏稳态和急性MI期间的细胞环境，我们使用了由Resolve Biosciences开发的基于组合单分子FISH(smFISH)的技术，称为分子地图学（图1a和扩展数据图1a-c）。分子地图学允许在选定的兴趣区域(ROIs)中以单分子分辨率高灵敏度检测多达100个候选基因的RNA转录本。基于现有公开可用的scRNA-seq数据集的标记基因表达和专家知识，我们随后为此研究专门设计了一个包含100个基因的转录面板，以捕获急性MI期间的主要细胞类型和炎症信号（补充表1）。使用此面板，我们为每个心脏选择了一个ROI（2.09 mm²至2.97 mm²）横截面，以测量急性MI期间四个不同时间点的心内膜、心肌和心外膜区域（梗死前对照、梗死后4小时、2天和4天）（扩展数据图1a-c）。分子地图学技术重复载片的RNA转录本斑点的识别和丰度在相同生物样本的截面之间显示出高度相关性，证实了伪批量转录计数的高度可重复性（补充图1a）。平均而言，在所有时间点，我们在每平方毫米心脏组织中检测到980,000个RNA转录本斑点，梗死组织中的转录本密度较低，这是由于梗死区域中存活细胞较少（补充图1b）。伪批量转录谱的主成分分析(PCA)显示样本根据相对于诱导梗死的时间分离，证实了对急性梗死的强烈转录变化（补充图1c）。对于每个时间点（对照、4小时、2天和4天），我们使用分子地图学检测了两个生物重复，并使用我们内部开发的开源计算管道nf-core/molkart处理数据（图1b）。尽管深度学习方法取得了进展，但由于心脏细胞在细胞大小、形状、方向、多核性和RNA含量方面的差异，从显微镜图像中分割心脏细胞仍然极具挑战性。比较四种不同的细胞分割方法（DeepCell Mesmer的"核"和"全细胞"模型、Cellpose细胞质模型（"cyto"）和自定义Cellpose 2模型），我们发现Cellpose与人工参与训练的模型在我们的小鼠心脏组织样本上表现最佳，与独立标注的真实分割进行评估时；它还显示出分配给细胞的RNA斑点总体百分比更高（扩展数据图2）。跨所有图像的细胞转录谱的细胞分型（总共69,028个细胞，每个样本平均细胞数=8,629）识别了急性MI期间的所有主要心脏细胞类型（图1c）。我们发现了健康和受应激的心肌细胞，由它们表达的心房利钠肽(Nppa)和脑利钠肽(Nppb)区分，血管细胞（周细胞、平滑肌细胞和内皮细胞）、心脏成纤维细胞以及浸润的髓系和淋巴细胞（图1d）。急性MI期间左心室的缺氧环境导致左心室内大量细胞死亡和组织组成及结构的变化。符合这些预期和文献中已知的细胞动态，我们观察到从健康到梗死左心室组织的细胞类型组成在MI后的前4天发生强烈转变（扩展数据图3a,b）。健康的左心室组织由心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞组成，显示出向坏死和受应激心肌细胞(Nppa+)周围由细胞外基质(ECM)产生的心脏成纤维细胞和侵入髓系细胞的环境转变。由于我们选择的ROI包含大面积的梗死组织，健康心肌细胞的数量从对照中识别细胞的平均57.9%大幅减少到第4天处理区域中仅约10%。随着ECM产生和早期瘢痕形成的增加，心脏成纤维细胞从6.6%增加到ROI中细胞的30.8%。值得注意的是，我们观察到髓系细胞（中性粒细胞、Mo/Mɸ和树突状细胞）从对照中的4%增加到第4天成像ROI中的近28%，表明髓系细胞广泛浸润到梗死区域（扩展数据图3b）。对免疫细胞类型的深入分析允许对中性粒细胞、不同类型的Mo/Mɸ以及淋巴细胞和树突状细胞进行分类（扩展数据图3c,d）。总体而言，我们的分析揭示了急性MI的细胞景观，在空间背景下重现了许多已知的细胞动态。
图1：急性MI的分子地图学能够对左心室梗死组织进行空间细胞分型
a，研究设计的示意图概述。为分子地图学选择了两个生物重复，跨越两个技术重复载片。为SeqIF使用了两个或三个生物重复。b，空间转录组学数据生成（分子地图学）和处理（nf-core/molkart）的示意图。c，显示来自八个样本（每个时间点两个生物重复）跨越急性MI四个时间点的69,028个细胞的联合嵌入的UMAP。d，MI后2天样本的代表性空间细胞类型分布。左侧显示所有细胞类型的复合图像，右侧显示每种细胞类型的单独分布。a和b中的示意图由BioRender.com创建。d，天；h，小时；LV，左心室。
空间转录组学数据的细胞邻域分析突显急性MI期间的动态时空变化
为了全局理解急性MI组织中的组织结构和细胞间关系，我们将多视图细胞间空间(MISTy)建模框架应用于我们的数据集。MISTy以无偏方式捕获整个载片和数据集中的细胞类型关系模式。在稳态心脏对照组织中，大多数细胞类型分布均匀，心肌细胞与心脏成纤维细胞、血管内皮细胞和周细胞交错排列。因此，大多数细胞类型的位置对其它细胞类型定位的预测信息并不重要。然而，MISTy确实识别出Nppa+心肌细胞的空间特征，其空间定位最佳预测因子是心内膜细胞（图2a）。对照组织中的髓系细胞很少，在稳态和MI后4小时期间在整个组织中分布相对均匀，表明这些可能是常驻白细胞。为进一步探索细胞类型之间潜在的共定位和相互作用，我们使用LIANA+在细胞类型对之间进行了局部双变量分析。对照中内皮细胞和Nppa+心肌细胞之间的这种局部分析将这些细胞类型之间的相互作用定位到靠近左心室腔的亚心内膜区域（图2b）。这与Nppa在发育过程中小梁心室区域的已知定位一致，这在稳态成年心脏中得以维持。相比之下，在对照中未识别出髓系细胞和心内膜细胞之间的空间相互作用（图2c）。该区域内RNA信号的可视化证实了靠近内皮/心内膜细胞(Pecam1)标记物的强烈Nppa表达（图2d）。MI后2天，MISTy分析揭示了在对照条件下未识别的相互作用。除了心内膜细胞和Nppa+心肌细胞之间仍然存在的强烈关系外，MISTy还识别出心内膜细胞和髓系细胞之间的空间背景（图2e）。这两种空间相互作用都清晰地描绘了围绕梗死核心的（亚）心内膜梗死区域（图2f,g）。与此发现一致，我们在心内膜和亚心内膜层（由Nppa界定）中观察到强烈的髓系标记物RNA信号（图2h）。MI后4天，心内膜细胞和髓系细胞之间的局部关系与心脏成纤维细胞和髓系细胞之间的信号一起被识别（图2i）。MI后4天的髓系细胞位置还受到Nppa+心肌细胞、心脏成纤维细胞和心肌细胞的预测（图2j）。有趣的是，髓系细胞和成纤维细胞之间的相互作用在边界区域和心外膜梗死区域富集（图2k）。心脏成纤维细胞的大幅增加及其与髓系细胞的空间共定位进一步通过编码ECM成分（如Col1a1）的RNA分子的大幅增加得到突出（图2l）。由于多种空间分析突显了心内膜细胞和髓系细胞之间意外但可能重要的相互作用，我们旨在使用简单测量来验证和量化这种增加的局部关系。因此，我们计算了二维组织空间中每个心内膜细胞与其最近邻髓系细胞之间的欧几里得距离，以量化急性MI期间心内膜细胞对髓系细胞的接近程度（图2m）。心内膜细胞和髓系细胞之间的平均距离在MI时间过程中显示出显著差异（图2n）。MI后第2天和第4天，心内膜细胞与髓系细胞的距离显著短于对照，而心内膜细胞与髓系细胞的平均距离在第2天和第4天之间没有显著变化（图2n）。我们进行了相同的距离分析，以查看髓系细胞在梗死核心界面处是否与心脏成纤维细胞表现出类似的关系，并发现MI后两种细胞类型之间的接近程度增加（图2o）。总之，我们的细胞邻域分析识别并突显了心内膜细胞和髓系细胞之间意外的空间关系，表明免疫浸润至梗死区域可能通过心内膜和亚心内膜Nppa+梗死区域（统称为心内膜梗死区域）介导。
图2：MI期间分子地图学细胞组成的空间分析突显髓系细胞与心内膜层的相互作用
a，通过MISTy计算的心脏对照组织中的空间细胞类型关系。重要性指标跨载片显示突出的两种细胞类型之间的空间相互作用。对于所有MISTy分析，仅显示重要性>0.4且仅显示R²增益>5%的细胞类型。R²表示包含空间背景（副视图，半径=125 µm）时方差的变化。b,c，心内膜细胞和心肌细胞Nppa+（b）以及心内膜细胞和髓系细胞（c）之间的局部双变量分析。颜色表示通过LIANA+计算的局部乘积。d，对照组织中心内膜区域的RNA斑点定位，突显内皮/心内膜细胞(Pecam1)、心肌细胞(Pln和Nppa)、成纤维细胞(Pdgfra和Col1a1)和髓系细胞(Cd74, Lyz2和C1qa)的标记基因的空间共定位。e，MI后2天左心室组织的MISTy分析显示心内膜细胞和髓系细胞之间的相互作用。f,g，局部相互作用分析显示心内膜细胞与心肌细胞Nppa+（f）和髓系细胞（g）在心内膜梗死区域中的相互作用。h，RNA标记物表达确认髓系标记物在心内膜梗死区域中的局部表达。i，MI后4天的MISTy分析突显了围绕梗死核心的心脏成纤维细胞和髓系细胞之间的空间关系。j,k，局部相互作用分析显示髓系细胞与心肌细胞Nppa+（j）和心脏成纤维细胞（k）之间的相互作用。l，MI后4天梗死组织内的RNA斑点定位。m，计算了所有细胞类型对之间的欧几里得距离。计算了所有细胞类型对之间的欧几里得距离，并使用心内膜细胞和心脏成纤维细胞到最近髓系细胞的距离。n，心内膜细胞到髓系细胞的欧几里得距离在MI后的前4天显著不同（所有组n=2个生物重复，II型ANOVA P=0.0095）。事后分析显示MI后2天与对照相比存在显著差异（Bonferroni校正的事后t检验，P=0.022），但2天和4天之间无差异（P=0.084）。o，MI后4天，心脏成纤维细胞和髓系细胞之间的欧几里得距离显著降低（n=2，与n中相同的生物样本，Bonferroni校正的事后t检验，P=0.038）。条形表示微米为单位的平均距离，点表示单个测量值。d，天；h，小时；LV，左心室。
高度多重抗体成像证实急性MI中心内膜层的免疫细胞浸润
为进一步研究MI后髓系细胞的区域分布并在整个心脏切片中捕获时空模式，我们在急性MI阶段的样本上进行了SeqIF，独立于分子地图学样本（对照生物三重复；MI后4小时、24小时和2天生物双重复）（图3a）。我们优化了抗体面板，以识别健康和受应激的心肌细胞(Tnnt2和Ankrd1)、内皮细胞(CD31)、平滑肌细胞(αSMA)、心脏成纤维细胞(Pdgfra)、髓系细胞(CD45, CD68, CCR2, Trem2和Mpo)以及DAPI和小麦胚凝集素(WGA)以分别捕获细胞核和细胞膜（图3b和补充表2）。我们使用MCMICRO处理SeqIF数据，这是一个基于Nextflow的管道，执行从每个抗体通道中减去自发荧光信号、细胞分割和荧光强度量化（图3a）。基于我们对分子地图学数据分割的经验，我们应用了相同的策略，使用WGA和DAPI训练自定义Cellpose 2模型来分割SeqIF数据集中的细胞。为了给细胞分配表型，我们使用了Pixie工作流程，该工作流程使用自组织映射(SOMs)执行像素聚类，以生成组织的像素图（有关更多细节，请参见方法部分）（扩展数据图4a）。在这些像素图中，跨SeqIF数据集具有相似标记物强度谱的像素组被聚类在一起，允许对急性MI整个时间过程中不同细胞类型和组织区域进行分类（扩展数据图4b）。与分子地图学结果一致，我们发现心肌细胞标记物Tnnt2的像素表型簇在MI后的前2天持续减少，而髓系细胞（Mo/Mɸ和中性粒细胞）的像素表型簇增加（扩展数据图4b,c）。我们还发现受应激和死亡的心肌细胞对Ankrd1像素簇呈阳性，从MI后4小时起就清晰地界定了梗死核心（扩展数据图4a）。我们使用像素图通过对Cellpose细胞掩模进行第二次聚类来执行细胞表型（图3c,d和扩展数据图4d）。这种像素级表型工作流程使我们能够基于高度多重成像数据，以前所未有的规模对整个心脏横截面，对梗死心脏内心脏细胞的空间定位进行分析。为进一步研究和独立验证我们在分子地图学数据中发现的心内膜和髓系细胞之间潜在的关系，我们重复了这两组细胞之间的距离分析。与分子地图学的发现一致，髓系细胞和心内膜细胞之间的距离在MI后的前2天减少（图3e）。有趣的是，髓系细胞仅在梗死后24小时最接近心内膜细胞（中位距离=24 µm），表明这些免疫细胞通过心内膜层的附着和浸润可能是一个快速过程。为量化髓系细胞进入梗死区域的不同浸润途径的程度，我们根据Tnnt2、Ankrd1、WGA和CD31的表达模式，将梗死心脏图像划分为区域隔间（心内膜梗死区域、心外膜、梗死核心和边界区域），随后进行细胞量化（图3f，补充图2和3以及扩展数据图5a）。使用SeqIF和常规免疫荧光染色，我们在心内膜梗死区域中发现了特异性表达CCR2的Mo/Mɸ(CCR2+ Mo/Mɸ)的强烈增加，在MI后24小时达到峰值（图3g和扩展数据图5）。MI后2天，心内膜梗死区域内的髓系细胞相对数量保持较高。然而，我们还发现心外膜梗死层内CCR2+ Mo/Mɸ的密度增加。CCR2+ Mo/Mɸ绝对数量随时间的量化将边界区域确定为2天后的主要入侵途径。对心内膜层中CCR2+ Mo/Mɸ分布的仔细检查显示，CCR2+ Mo/Mɸ在MI后4小时已附着于心内膜，偶有浸润事件（图4a-c和扩展数据图6）。值得注意的是，在MI后的前24小时内，我们未在心内膜梗死区域中CCR2+ Mo/Mɸ密度高的区域观察到非心内膜内皮细胞的高丰度（扩展数据图6）。
图3：在急性MI的前2天使用SeqIF和常规免疫荧光进行的高度多重成像证实髓系细胞通过心内膜层的浸润
a，SeqIF数据生成和处理的实验设计示意图。对于SeqIF，对照选取了三个生物重复，其余时间点选取了两个生物重复。所有SeqIF重复都是与分子地图学实验不同的小鼠。b，使用10种抗体的小鼠心脏横截面代表性SeqIF，显示梗死前（左）和MI后24小时（右）。右侧的放大图突显梗死中的心内膜生态位，其特征是存在受应激的心肌细胞（Ankrd1+，橙色）和免疫细胞附着于心内膜细胞（CCR2+绿色，Mpo+紫色和CD31黄色）。ROI，50 µm。c，来自Pixie的细胞表型热图，突显跨整个数据集不同细胞掩模中的标记物表达。图例表示缩放的标记物表达，上限为3。d，每个时间点一个代表性样本的Pixie细胞表型。每个像素根据其细胞像素簇着色，该簇由Pixie计算。细胞类型颜色对应于c中热图分组颜色。e，从SeqIF图像中量化四个不同时间点的心内膜细胞到最近髓系细胞的微米距离。距离显示在测量时间点发生显著变化（所有时间点n=2个生物重复，II型ANOVA P=0.0279）。条形显示生物重复的平均距离，点表示每个生物重复的平均距离。f，用于计算髓系细胞浸润的解剖标注示意图。g，从SeqIF横截面中不同空间区域的Ccr2+CD68+ Mo/Mɸ量化。相对细胞类型丰度以每平方毫米细胞数表示。条形显示平均丰度，点表示生物重复的单个测量值（每个时间点n=2）。a和f中的示意图由BioRender.com创建。CM，心肌细胞；d，天；EC，内皮细胞；FB，成纤维细胞；h，小时；Leuko，白细胞；SMC，平滑肌细胞。
图4：Mo/Mɸ通过心内膜浸润至梗死心脏
a-c，显示选定标记物的代表性SeqIF染色，包括CD31（黄色）、CCR2（品红色）、CD68（绿色）和DAPI（蓝色）。梗死后4小时（a）、24小时（b）和2天（c）的切片染色表明附着（星号）和转细胞迁移（箭头）增加，导致（亚）心内膜梗死区域中CCR2+CD68+细胞密度高，以及CCR2+细胞向梗死核心移动。中间和右侧面板表示左侧面板中标记框的放大图。d，天；h，小时；LV，左心室。
在心外膜层中，CCR2+ Mo/Mɸ要么直接附着于心外膜，要么靠近心外膜血管（补充图4a-c）。总之，我们的结果—跨越多种技术和量化方法—清楚地表明，在非再灌注背景下，急性MI阶段期间，髓系细胞通过不同细胞层进行渐进性浸润，并突显了此前未描述的途径，即免疫细胞可通过心内膜梗死区域浸润至左心室以到达梗死区域。
心内膜层的空间蛋白质组学突显vWF在免疫细胞浸润中的作用
在发现早期免疫细胞浸润至心内膜梗死区域后，我们旨在使用超灵敏质谱蛋白质组学识别介导髓系细胞通过心内膜的募集、粘附和浸润的潜在因子。因此，我们使用激光捕获显微切割从健康小鼠心脏（对照）和MI后24小时的心脏中切除心内膜区域。对于MI心脏，我们将心内膜细胞分为两组：位于梗死区域内的（MI IZ）和远离梗死区域的（MI远程）（图5a）。不同心内膜组织样本的蛋白质组在质量控制过滤后平均包含3,274种蛋白质（补充图5a）。尽管输入组织材料量非常少，但蛋白质组数据质量很高，缺失蛋白质值很少（样本间4-16%）（补充图5b）。蛋白质组样本的PCA显示对照心内膜样本与梗死样本的心内膜细胞明显分离，表明MI后24小时心内膜层蛋白质特征的可重复扰动（图5b和补充图5c）。有趣的是，梗死心脏的远程心内膜层特征（MI远程）与对照心内膜细胞足够不同，以在PCA中区分它们，但这两个条件之间显著差异表达的蛋白质非常少（补充图5d）。相比之下，与远程心内膜区域（MI远程）相比，梗死区域（MI IZ）中心内膜区域观察到许多蛋白质的显著差异表达（图5c）。使用标志性基因集对MI IZ和MI远程之间差异表达蛋白质(DEPs)进行通路分析，揭示了与免疫细胞激活（补体系统、炎症反应和IFNγ反应）相关的上调通路，以及与能量代谢（氧化磷酸化和脂肪酸代谢）相关的下调通路（图5d）。有趣的是，我们发现与MI远程区域相比，凝血通路基因在MI IZ样本中强烈上调（图5d）。我们使用已发表的snRNA-seq数据集研究了这些通路结果的细胞特异性，并发现vWF是心内膜特异性最高的蛋白质，在MI IZ中相对于MI远程显著上调，类似于已知的内皮粘附分子如Vcam1（图5e,f）。vWF是一种多聚体蛋白质，在血管稳态中起核心作用，并参与炎症过程。有趣的是，与对照心脏的心内膜区域相比，vWF在梗死心脏的远程心内膜区域中未显著上调（图5f）。为确认vWF蛋白质在心内膜梗死区域的增加定位，我们在梗死心脏中进行了vWF的常规免疫荧光染色，并在心内膜梗死区域发现显著更强的信号，在远程区域几乎不存在信号（图5g和扩展数据图7a,b）。有趣的是，vWF+染色的分布在整个梗死相邻心内膜层中并不均匀，而在心室组织形成袋状的区域比平滑区域更强。MI后24小时缺血/再灌注损伤的鼠心的免疫荧光染色也显示出类似的染色模式，vWF表达增加（扩展数据图7c,d）。为研究vWF是否也在人类MI中发挥作用，我们重新处理了Amrute等人关于供体和急性MI患者移植心脏的细胞索引转录组和表位测序(CITE–seq)数据集（图5h）。该数据集包括健康供体、急性MI患者以及慢性缺血性和非缺血性心肌病患者，我们重点关注健康供体（n=6）和急性MI患者（n=4）。差异基因表达分析证明，与健康供体相比，急性MI后患者的心内膜vWF表达显著增加（图5i）。总的来说，我们的DVP分析在急性MI期间揭示了同一心脏内心内膜区域之间的局部空间差异，并突显vWF上调作为心内膜对梗死区域局部炎症信号的特异性反应。
图5：MI后1天激光捕获显微切割与超灵敏蛋白质组学揭示心内膜细胞中vWF的局部上调
a，实验设计示意图，比较对照（绿色）、梗死区域(IZ，紫色)和远程区域（橙色）的心内膜。b，三个指示实验组的PCA（n=3-4个生物重复）。c，梗死心内膜和远程心内膜之间蛋白质组差异比较的火山图。显著差异表达的蛋白质显示为紫色（在梗死心内膜中上调）和橙色（在梗死心内膜中下调）。差异表达通过经验贝叶斯调节t检验（limma-voom）进行评估。d，MI IZ和MI远程之间DEPs的标志性基因集通路富集分析结果。e，MI IZ和MI远程之间DEPs的心内膜细胞特异性分析。x轴显示基于snRNA-seq数据的基因表达特异性（由差异标记基因表达近似），y轴显示来自c中所示差异蛋白质表达分析的log2FC。f，基于超灵敏蛋白质组学的三个感兴趣蛋白质的表达图。Cdh11是心内膜细胞的标记物且不差异表达，而Vcam1和vWF在急性MI期间显示显著差异表达（对照组n=3，MI远程和MI IZ组n=4；P值来自通过经验贝叶斯调节t检验（limma-voom）评估的差异表达）。线表示平均表达，点表示单个测量值。g，鼠MI后24小时vWF（品红色）和CD31（黄色）的代表性常规免疫荧光染色。h，Amrute等人snRNA-seq数据中鉴定的人类心脏细胞类型的UMAP。用于差异基因表达分析的心内膜细胞簇用虚线圆圈突出显示。i，来自Amrute等人snRNA-seq数据的标准化RNA表达的小提琴图，汇总到所有供体样本（n=6）和急性MI样本（n=4）的伪批量，急性MI样本中人类心内膜细胞的vWF显著上调（伪批量表达值的DESeq2分析；P=1.4 × 10−5）。a中的示意图由BioRender.com创建。AMI，急性MI；FC，倍数变化；NK，自然杀伤；PC，主成分；Pval，P值。
vWF的功能阻断改变免疫细胞浸润和梗死恢复
CCR2和vWF的免疫荧光共染色突显了vWF在心内膜梗死区域中的存在与MI后局部附着或已浸润的CCR2+ Mo/Mɸ之间的强烈相关性，以及心肌缺血/再灌注（图6a,b，扩展数据图7d,e和补充图6a,b）。值得注意的是，血小板的免疫荧光共染色显示它们存在于一些但并非所有具有vWF表达的浸润区域中（补充图6c）。我们得出结论，在此背景下vWF依赖性免疫募集至少部分是血小板非依赖性的。为研究vWF在急性MI期间通过心内膜的髓系细胞募集和浸润中的功能作用，使用了一种特征明确的多克隆抗体（针对人vWF，也与鼠vWF高度交叉反应）来阻断鼠MI中vWF的功能（图6c）。在基线条件下，抗vWF阻断在健康小鼠中未导致心脏特异性表型（补充图7a-d）。在MI后0小时和24小时静脉注射对照IgG或抗vWF抗体。vWF的阻断导致MI后2天通过流式细胞术量化的梗死心肌中募集的Mo/Mɸ显著减少，而血液中Mo/Mɸ水平保持不变（补充图7e,f）。免疫荧光染色表明，这种效应主要由心内膜梗死区域中Mo/Mɸ的大幅减少解释（图6d）。有趣的是，通过心内膜处vWF阻断介导的Mo/Mɸ募集阻断导致MI诱导后2周愈合受损和长期结局恶化，如超声心动图所示（图6f-j）。此外，组织病理学评估显示，与对照小鼠相比，抗vWF治疗小鼠的梗死变薄更为明显（图6k-m）。我们使用DVP和功能实验的发现，因此揭示了心内膜在促进髓系细胞浸润中可能的关键作用，这可能由vWF介导。
图6：vWF阻断导致Mo/Mɸ募集减少和梗死愈合受损
a，MI后24小时vWF、CCR2、CD31和DAPI的代表性免疫荧光染色。b，心内膜梗死区域内CCR2+细胞和vWF平均荧光强度(MFI)的相关性。在心内膜上添加了164个类似大小的注释，以评估每个注释内vWF MFI和CCR2+细胞的存在（n=3个样本；虚线表示95%置信区间）。R表示相关系数。c，急性MI期间功能vWF阻断的实验设置示意图。d，基于MI后2天不同区域（BZ，边界区域；core，梗死核心；endo，心内膜IZ；epi，心外膜IZ）的常规免疫荧光对心脏Mo/Mɸ的量化分析。方框表示平均值±标准差（每组n=3个样本）。P值通过双因素方差分析后跟Sidak多重比较确定。e，MI后2天IgG和抗vWF治疗后心内膜IZ中CCR2+细胞（绿色）的代表性免疫荧光染色。f，MI诱导后14天的代表性B型模式图像。绿线描绘左心室心内膜位移。g-j，MI诱导后14天通过超声心动图确定的全局纵向应变（g）、左心室射血分数（h）以及收缩末期（i）和舒张末期容积（j）。k，MI后14天器官切除后的体重(HW)与体重(BW)比值。l，基于MI后14天组织病理学评估的梗死厚度量化。数据显示平均值±标准差；点显示单个测量值（每组n=8个样本）。P值使用双尾Student t检验计算。m，MI后14天IgG治疗和抗vWF治疗小鼠的Masson三色染色代表性图像。h，小时；IF，免疫荧光；LV，左心室。
讨论
本研究揭示了小鼠MI急性期单核细胞免疫细胞浸润的此前未描述的途径。使用分子地图学、SeqIF和DVP等最先进的空间组学方法的组合，我们确定心内膜是免疫细胞附着和浸润的重要区域，由vWF的局部上调介导。
目前有大量临床试验正在测试免疫调节预防MI后不良重塑的潜力。更好地理解白细胞积累以及在此背景下有益和有害参与者的分化可能会导致改善MI愈合的新型和改进策略。高分辨率空间测定使我们能够在急性MI的关键早期时间框架内观察和识别通过左心室心内膜层的髓系细胞附着和浸润。随着时间的推移，愈合的心脏似乎发展出不同的局部炎症中心：早期，大量单核细胞通过心内膜层积累，而在后期阶段，主要焦点集中在边界区域。根据时间点，还应考虑额外的浸润可能通过亚心内膜微血管发生。尽管大多数实验是在永久性冠状动脉闭塞后进行的，但我们在心脏缺血/再灌注背景下也观察到了这种效应。
左心室内单核细胞附着的中枢介质被确定为vWF，由梗死区域中心内膜细胞释放。vWF已知参与血小板粘附和聚集，尽管我们确实观察到一些vWF细胞簇存在血小板，但许多髓系细胞-心内膜细胞相互作用在没有血小板的情况下发生，表明vWF对免疫细胞浸润的影响至少部分是血小板非依赖性的。vWF的体内阻断导致亚心内膜单核细胞积累显著减少。最近的研究表明，vWF可能对免疫细胞有直接影响，独立于血小板。vWF不仅可能影响迁移能力，还可能通过p38依赖方式修饰其促炎激活或将巨噬细胞代谢转向糖酵解。尽管我们在治疗动物中未观察到任何出血或出血迹象，但vWF的阻断也可能影响初级止血，从而影响单核细胞积累。观察到CCR2+单核细胞减少积累（通过vWF阻断）导致左心室功能受损的结果令人惊讶，这可能表明该特定亚群在梗死愈合背景下发挥有益作用，并且可能与梗死心脏边界区域存在的单核细胞亚群不同。浸润途径或局部微环境是否指导髓系细胞的特性仍有待探索。
我们观察到vWF仅在梗死区域中心内膜细胞中局部上调，表明来自梗死区域空间邻域中死亡心肌细胞和其他细胞的潜在信号效应。似乎vWF主要从左心室运动减弱或无运动区域中心内膜细胞释放，这也可能表明改变的血流对该细胞层分泌组的影响。尽管我们没有任何数据证实这些假设，但未来研究可能会调查到达心内膜细胞的信号分子，并尝试分离哪些因素导致vWF上调。
尽管我们的发现基于多种实验方法，并且无论使用何种技术，我们一致观察到通过心内膜梗死区域的免疫细胞浸润，但我们的研究有几个局限性。首先，我们为分子地图学选择的转录本面板仅限于100个不同转录本，并且是手动策划的，因此缺乏许多可能对免疫细胞类型进行详细描述的有趣和重要标记物。此外，一些转录本在我们的靶向组织中未被我们选择的探针可靠检测到，因此可能导致在表达这些RNA的细胞中观察到丢弃效应。我们面临的另一个局限性是缺乏高质量的心脏细胞分割参考数据。尽管我们使用Cellpose 2训练了自定义细胞分割模型，尽可能减少偏见，但这种分割并不代表真实的真实情况，而仅仅是近似值。希望随着更多高分辨率空间组学数据集的可用，未来研究将可获得具有代表性的心脏细胞分割掩模的公共数据集。
我们尝试使用公开可用的数据源进行额外验证，以寻找急性MI期间心内膜免疫细胞浸润的特征。不幸的是，大多数已发表的研究要么不匹配观察此效应的关键时间窗口，要么使用分辨率不足的空间方法。尽管我们在其中一些数据集上使用了细胞反卷积方法，但无法以足够的灵敏度识别心内膜区域来使用此类数据集验证我们的发现。
总之，我们在急性MI中通过心内膜梗死区域的免疫细胞浸润的发现为调节梗死后免疫反应开辟了新的激动人心的途径，并提供了用于治疗和药物递送的新机会。
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