摘要
造血干细胞和祖细胞(HSPC)的衰老导致免疫功能障碍和与年龄相关的疾病，但其调控机制仍不清楚。在此，我们展示了迄今为止规模最大的人类循环HSPCs单细胞多组学图谱，包含77名捐赠者中超过38万个配对的RNA和ATAC谱型。除了重现HSPC衰老的已知标志外，我们重建了高分辨率基因调控网络，并确定了一种全局重布线现象，其中应激反应和髓系转录因子(TF)程序扩展，而自我更新和淋巴系谱系定义的调控回路崩溃。我们将这些表型与增加的顺式调控熵相关联，包括升高的转录组噪声、减弱的峰-基因耦合以及染色质峰拓宽。这种重布线具有选择性，其中具有GC丰富、启动子近端架构的TFs被保留或放大，而复杂的远端增强子依赖性身份网络被侵蚀。因此，这些发现表明，基因调控架构的渐进性熵不稳定同时驱动了衰老HSPCs中的应激高激活、髓系偏向和身份丧失。
衰老是生物学中最基本的未解问题之一，目前仍缺乏对其机制的理解，通常被定义为其效应——功能性进行性下降以及疾病发病率和死亡率的增加。由于人体内几乎每个细胞都位于距离血管50-100微米范围内，造血系统是机体健康和长寿的核心调节器。因此，造血系统的退化可能作为系统性放大器加剧与年龄相关的病理，表现为慢性炎症、免疫衰老、贫血、克隆性造血潜能不明状态(CHIP)增加以及髓系恶性肿瘤。这些级联功能障碍最终可追溯到造血干细胞和祖细胞(HSPCs)，它们维持所有血液和免疫谱系。因此，与年龄相关的HSPC功能障碍既是造血疾病的驱动因素，也是干预衰老的高杠杆点。
将这些机体层面的表型追溯到细胞水平，多项研究表明，衰老的HSPCs经历了自我更新能力的丧失、表型干细胞池的扩张以及向髓系谱系的偏向分化。虽然这种与年龄相关的"髓系偏向"传统上被视为均匀的谱系转移，但近期的高分辨率克隆追踪和单细胞分析支持更精细的模型：淋巴系潜能不成比例地丧失，同时髓系室内部发生克隆补偿。此外，虽然慢性炎症重塑骨髓微环境等细胞外因素被认定为上游触发因素，但有证据表明，由此导致的功能下降最终被深刻的细胞内表观遗传和转录重布线锁定。在此，我们使用细胞内衰老来指代在表型匹配的HSPC群体内观察到的与年龄相关的分子变化，同时考虑了细胞类型组成和测量的供体协变量的变化。
先前的多组学研究已经绘制了这些表观遗传变化，一致发现应激反应通路的高激活，特别是由AP-1转录因子(TF)复合物驱动的通路。最近提出的"SIPHON"模型提出了这一现象的机制，表明AP-1过激活劫持了基本的转录共因子，导致细胞身份相关基因座的染色质关闭。此外，AP-1激活已被证明诱导持久的表观遗传状态，使HSPCs易受功能障碍影响，并在谱系间内在遗传。虽然SIPHON模型部分解释了衰老HSPCs的选择性脆弱性，但尚不清楚为什么AP-1激活会选择性地降解自我更新和淋巴系程序，同时保留甚至增强髓系轨迹，而髓系轨迹本身也依赖于谱系特异性TFs。因此，目前仍缺乏对衰老如何重塑基因调控网络(GRNs)并导致后续表型下降的全面、无偏见的理解。
为解决这一差距，我们使用单细胞多组学(配对的scRNA-seq和scATAC-seq)分析对跨越成年期的人类循环HSPCs的偶联表观遗传和转录状态进行了图谱绘制。这种多模态方法使我们能够在单个调控子水平上重建与年龄相关的GRNs，调控子在此处被定义为转录因子及其推断的目标基因。这使我们能够量化网络重布线和TF活性变化，具有单细胞分辨率。通过这一框架，我们证实了与年龄相关的应激相关(TF)活性稳健增加，同时身份程序下降。我们还发现髓系和红系TF活性增加，伴随着核心程序的全局下降，这些核心程序调控淋巴系分化和HSC以及自我更新。
整合这些发现，我们发现与年龄一起保留或放大的TFs与下降的TFs共享不同的调控架构特征，表明调控子的结构特性(而非其谱系作用本身)决定了其对衰老的脆弱性。我们提出，造血衰老是由调控架构的熵不稳定驱动的，其中复杂的远端调控程序随年龄逐渐退化，而稳健的近端程序被保留或扩展。
结果
人类循环HSPCs的单细胞多组学图谱捕捉了造血衰老的标志
为绘制人类造血衰老中的细胞内变化，我们生成了据我们所知迄今为止规模最大的循环CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的单细胞多组学图谱，跨越77名健康捐赠者，年龄在17-81岁之间(图1a)。从白细胞减少系统室中分离PBMCs并富集CD34+细胞后，经过质量控制，我们保留了385,509个高质量的配对RNA和染色质可及性谱型。
该图谱在两种模态中均显示出高质量，具有较强的细胞水平RNA和ATAC指标，前体室中高CD34表达，且几乎没有与年龄相关的技术混杂证据(扩展图1a-d)。我们观察到回收的HSPCs随年龄略有下降，这与先前报道一致且可能是生物学原因(扩展图1e-f)。由于我们的队列中男性捐赠者比女性年长(中位数57岁对43岁，p=0.03；扩展图1e-f)，在所有与年龄相关的分析中，性别被纳入为协变量。
我们的细胞类型注释基于聚类、标记基因和外部参考映射，解析了预期的早期造血层次结构。我们恢复了HSPC细胞类型：造血干细胞(HSCs)、多能祖细胞(MPPs)、淋巴系偏向多能祖细胞(LMPPs)、普通淋巴祖细胞(CLPs)、巨核红系祖细胞(MEPs)、红系祖细胞(ERYPs)、粒单核祖细胞(GMPs)、嗜碱性粒细胞/肥大细胞祖细胞(BMCPs)以及自然杀伤细胞/T细胞/树突状细胞祖细胞(NKTDPs)。我们还捕获了一小部分更分化的、低CD34+的群体，包括浆细胞、B细胞及其前体(原B和前B)、T细胞、浆细胞样树突状细胞(pDCs)和单核细胞(Mono)(图1b-c，扩展图1b)。细胞状态与外部数据集显示出强烈的一致性，证实了我们注释的准确性(扩展图2a-d)。
总体流形重现了经典的人类造血过程，具有连接下游祖细胞的中央HSC节点和分叉的髓系分支(图1b)。标记基因和谱系定义TF梯度与淋巴系、原始系和髓系室中的预期谱系结构相匹配(图1c-d)。由于循环HSPCs与骨髓驻留对应物可能存在细微差别，主要在静止性方面，我们将我们的数据集投影到包含循环和骨髓来源HSPCs的匹配参考上。如预期，我们的细胞与外周CD34+区室最强烈地对齐，并且比骨髓来源的HSPCs具有更低的细胞周期活性(扩展图2e-i)，尽管细胞周期活性与年龄呈正相关(扩展图2j)。
利用队列的连续年龄分布，我们观察到成年期HSPC区室的渐进性重塑，髓系偏向祖细胞(特别是MEPs)扩展，而原始系和淋巴系相关区室(包括HSCs和LMPPs)下降(图1e-f)。我们还发现B细胞和B细胞前体随年龄减少(扩展图3a-c)，与淋巴系输出减少一致，尽管CD34+富集限制了解释分化细胞类型中的变化。这些模式在补充的、无聚类的差异丰度分析中是一致的(扩展图3d-e)。
这些分析确立了我们的循环HSPC多组学图谱作为人类造血的代表性模型，捕捉了造血衰老的主要组成标志，并为剖析潜在的调控变化提供了基础。
HSPCs中共享的转录组衰老特征
为定义HSPC衰老的转录特征，我们生成了所有HSPCs的供体级伪批量谱型，并进行了差异表达分析，将年龄建模为连续变量，同时控制性别。这确定了1,004个与年龄相关的基因(FDR<0.05)，包括594个随年龄增加和410个随年龄减少的基因(图2a)。
年龄上调基因在炎症、应激反应和EMT相关程序中富集，与已知的衰老HSPCs炎症重塑一致，并以PTGS2为例(图2b-c)。年龄下调基因在干扰素-α反应和胆汁酸代谢中富集。为区分细胞内衰老和组成变化，我们在各个细胞类型内重复了分析。大多数HSPC细胞类型也显示出稳健的转录衰老特征，表明这不是纯粹的组成解释。仅HSCs就包含530个差异表达基因，尽管跨细胞类型的显著基因重叠适度，但年龄效应在方向和幅度上高度一致，所有HSPC两两相关性均超过0.5(图2d)。每个细胞类型中最强的年龄上调和年龄下调基因显示出显著的重叠和一致的方向变化(图2e，扩展图4a)。
HSPC衰老特征在很大程度上与性别无关，没有基因在多重测试校正后显示出显著的年龄×性别交互作用(扩展图4b)。然而，这一分析可能对检测微小效应的统计能力不足，性别连锁转录本表现出一些性别依赖性轨迹(扩展图4c-d)。在男性捐赠者中，Y连锁基因表达随年龄下降，与衰老血液中染色体Y的镶嵌性丢失一致(扩展图4e-f)。
转录组衰老遵循不同的时间轨迹
使用捕捉非线性年龄效应的框架，我们确定了3,151个与年龄相关的基因。对其平滑轨迹进行聚类揭示了四个主要的动态模块——两个随年龄增加和两个随年龄减少——表明尽管HSPC衰老看起来大致线性，但其潜在的分子程序在成年期的不同时间加速(图2f)。炎症基因在35-55岁之间显示出最陡峭的增加，EMT和细胞周期相关基因在约50岁左右后期加速，DNA修复和应激反应稳态基因在35-45岁左右早期下降，而代谢信号基因在50-65岁左右后期下降(图2g，扩展图4g-h)。这种时间错位表明，应激反应下降和炎症上调在成年期早期出现，而细胞周期、EMT和代谢变化在后期出现，尽管纵向采样是排除队列效应所必需的。
单细胞转录组衰老时钟捕捉到稳健的内在衰老信号
为量化年龄在HSPC转录状态中编码的强度，我们在均匀分布的队列上训练了衰老预测器(扩展图5)。在77名捐赠者上使用留一捐赠者交叉验证(LOOCV)，HSPC转录组预测器估计捐赠者年龄的平均绝对误差(MAE)为7.8年(图2h)。按细胞类型特定的预测器显示整体相似的性能。值得注意的是，HSC和LMPP预测器具有最低的误差，并与全HSPC时钟性能匹配，尽管它们是在更少的细胞上训练的(图2i)，支持跨造血谱系的细胞内衰老信号，对细胞类型组成变化的贡献有限。为直接测试这一点，我们在7,768个HSPC限制性Milo KNN邻域上训练了一个HSPC组成时钟，结果显示，最多约三分之一的衰老HSPC信号可以由组成变化解释(R²=0.26，MAE=13.8年；扩展图5d)。最后，我们将我们的HSPC转录组预测器应用于外部scRNA-seq图谱(123名捐赠者)，观察到强烈的转移性能(R²=0.67，MAE=8.6年；图2j)，表明该特征不是由特定于研究的批次效应驱动的。
染色质可及性捕捉到HSPC衰老的独特且可预测的层面
为补充转录组发现并询问相同的年龄相关重布线是否在调控DNA水平上可见，我们接下来分析了染色质可及性模态。峰水平差异可及性分析确定了1,269个在HSPCs中与年龄显著相关的峰(图3a)，包括一个距离PTGS2基因2.5 kb的峰，该峰在整个生命周期中可及性逐渐增加，与PTGS2表达的年龄依赖性增加相匹配(图2b；图3b)。
我们将差异峰与推断的目标基因联系起来，使用峰-基因相关性，默认使用最近基因分配，当没有检测到强相关的局部基因时。中位基因与10个峰相关联，尽管分布高度偏斜，1.2%的基因与超过100个峰相关联(扩展图6a)。与年龄相关峰相关联的基因在相同的通路中富集，包括炎症和应激反应程序(图3c)，并且可及性变化的方向与相关基因的表达变化方向相匹配。分配给年龄上调基因的峰倾向于打开，而与年龄下调基因相关的峰倾向于关闭(图3d，扩展图6b)。值得注意的是，远端峰比启动子近端峰更可能随年龄关闭(图3e，扩展图6c-d)，与优先侵蚀增强子相关调控元件一致。
可及性衰老特征也在HSPC细胞类型之间相关，尽管在分化群体中相关性较弱，与可及染色质景观更大的细胞类型特异性一致(图3f)。在RNA和ATAC中，年龄上调特征比年龄下调特征更广泛地在细胞类型之间共享，表明应激反应程序在谱系间广泛重新部署，而年龄相关下降更受谱系限制(图2e；图3g)。
为量化年龄在表观基因组中的编码强度，我们训练了基于可及性的衰老预测器(扩展图5)。ATAC预测器的表现优于RNA时钟，在HSPC伪批量样本上实现R²=0.83和MAE=6.1年，而RNA的R²=0.76和MAE=7.8年，在各个细胞类型中表现同样更强(图3h-i)。此外，结合表现最佳的RNA和ATAC细胞类型特异性预测器的嵌套岭堆栈在全HSPC水平(图3j)和各个细胞类型内(图3k)实现了卓越的预测性能(R²=0.91，MAE=4.6年)。这些结果表明转录组和表观基因组捕捉到衰老过程的部分互补维度，配对多组学分析提供了比任一模态单独更高的细胞衰老表示分辨率(扩展图5)。
衰老HSPCs中应激和髓系程序的扩展以及淋巴系和身份程序的侵蚀
跨两种模态的强烈、协调的衰老特征促使我们明确建模HSPC衰老的基础基因调控网络(GRN)。使用SCENIC+将配对的RNA和ATAC信息整合并推断跨细胞类型和供体的TF-基因调控链接，我们重建了包含367个调控子的GRN，覆盖146个TFs。推断的网络重现了已知的细胞类型特异性TFs和造血谱系定义的调控因子(图4a-b)，支持GRN的有效性。
为识别与衰老最直接相关的调控程序，我们专注于年龄相关差异表达基因(图2a)及其上游TFs(图4c)。随年龄增加的基因优先被活性也随年龄增加的TFs靶向，特别是AP-1家族成员和其他应激反应因子，如NFKB1和ELF1，而随年龄减少的基因主要由核心HSC自我更新和身份相关TFs调控，包括GATA2、RUNX1、ERG和ETV6。年龄增加的TFs也显示出更强且更有选择性的与年龄上调目标的链接，而年龄减少的TFs更广泛地连接到上调和下调基因(扩展图6e)。这种模式表明，虽然应激相关TFs驱动特定的年龄上调程序，但身份相关TF活性的丧失导致更广泛的被动去抑制和转录控制的不稳定。
一致的是，基序可及性分析显示了相同的向应激反应调控和远离核心造血身份程序的转变，其中应激反应基序随年龄增加可及性，而ETS/GATA基序随年龄减少(扩展图6f-i)。为在谱系背景下评估这些动态，我们将SCENIC+年龄相关TFs分为HSC自我更新、淋巴系、髓系/红系、应激/反应或其他类(补充表1)。这些类别显示出不同的年龄相关行为：应激/反应和髓系/红系TFs的活性显著随年龄增加，而HSC自我更新TFs和淋巴系TFs下降(图4d)。LOWESS平滑轨迹显示，这种分歧在约40-60岁之间最大，与转录轨迹分析中的中年加速平行(图4e)。
值得注意的是，这些变化不仅限于TFs通常定义身份的细胞类型(图4f)。在单个细胞类型内，应激和髓系TF程序在淋巴系和髓系室中广泛增加，而HSC自我更新TFs在多个祖细胞状态中下降，支持跨谱系、细胞内的调控重塑随年龄发生。在供体中，应激和髓系TF程序在HSCs中正相关，而HSC自我更新和淋巴系程序与应激/髓系轴呈负相关(图4g)。这表明反应性/髓系扩展和原始身份丧失是HSC衰老的耦合但不完全互逆的特征。
细胞身份转录因子随年龄下降
在按细胞类型分析TF活性变化时，我们观察到规范的细胞身份因子通常随年龄失去活性，甚至在原始HSC室之外。为形式化这一点，我们将细胞身份TFs定义为每个群体中最具细胞类型特异性的十个TFs，并将它们的年龄相关活性变化与所有其他网络TFs的活性变化进行比较。在HSCs中，这些身份定义TFs与HSC自我更新类别显著重叠，并且如预期的那样，相对于网络其余部分随年龄下降(图4h)。引人注目的是，这种模式扩展到几乎整个HSPC层次结构：在除ERYP外的所有细胞类型中，核心身份TFs随年龄相对于背景TF集合下降(图4i)。基序可及性分析的补充分析显示跨细胞类型的类似身份丧失，与染色质水平重塑支持这一调控转变一致(扩展图6j-k)。这种模式与年龄相关的髓系TF活性增加一致，因为身份TFs是分别在每个细胞类型内定义的；因此，即使共享的髓系程序在层次结构中扩展，对每个细胞状态最特异的TFs通常随年龄下降。这表明HSPC衰老伴随着造血层次结构中细胞类型特异性调控身份的广泛侵蚀。
调控熵随年龄增加
身份调控程序的广泛下降促使我们询问衰老是否伴随着基因调控系统中更普遍的组织性丧失。我们使用监管熵作为总称，指基因调控系统中有序、可重现结构的丧失，我们在此使用几种正交测量来量化：细胞间变异性、顺式调控连贯性、染色质峰锐度和供体特异性网络架构(图5a)。由于这些测量捕捉调控组织的不同层次并具有不同的技术敏感性，它们之间一致的年龄相关变化支持共同的不稳定，而非单一模态的人工产物。
首先，我们量化了RNA表达中的细胞间变异性，发现HSPC区室中转录组异质性的显著年龄相关增加。将相同的分析扩展到染色质，我们观察到基序可及性异质性在细胞类型中类似增加，HSCs在两种模态中显示出最清晰和最一致的生物噪声增加(图5b-c)。
其次，我们检查了供体特异性峰-基因景观作为顺式调控连贯性的测量。随年龄，峰-基因相关性的平均强度下降，表明可访问调控元件与其推断目标基因之间的耦合减弱(图5d)。同时，罕见峰-基因链接(在不到10%的供体中观察到的相关性)在老年供体中变得更加频繁，即使每个供体的链接总数保持稳定。
第三，我们发现了年龄相关峰拓宽的证据。在中位对数倍变化接近零且每个供体平均至少150个片段的5,000个随机选择的峰上，峰顶可及性在老年供体中倾向于下降，而侧翼可及性增加，导致开放染色质的空间扩散增加(图5e-f)。尽管平均效应大小适中，平均峰顶可及性仅下降2%，但67%的峰显示出随年龄增加的扩散(图5g)，且具有更高基线可及性的峰倾向于更广泛地拓宽(斯皮尔曼ρ=0.13，p<0.0001)。这种拓宽与染色质可及性的精确性降低一致，可能反映了TF结合、核小体定位或染色质维持随年龄的约束减少。
这些分析表明随年龄增加的调控不稳定性，表现为更高的转录和染色质异质性、更弱且更不可重现的峰-基因耦合，以及开放染色质定位的丧失。
衰老重布线并简化调控网络
为测试这些熵特征是否反映在调控网络架构中，我们分别为每个供体推断SCENIC+网络。尽管供体特异性网络的统计功效低于组合网络，并非所有TFs都在每个供体中恢复，但年龄相关的TF活性变化比平均TF-目标重要性变化更强烈地跟踪目标基因数量的变化，表明衰老主要改变调控子大小而非均匀加强或削弱现有交互。与全局网络结果一致，应激和髓系TFs倾向于随年龄获得目标，而HSC自我更新和淋巴系TFs倾向于失去目标(图5h-i)。
在网络层面，每个供体的TF节点数量随年龄下降，而基因和边的总数保持相对稳定(图5j，扩展图7c)，表明在老年供体中，更少的TFs占相似量的推断转录连接。平均区域-基因重要性也随年龄下降，与上述峰-基因耦合减弱相呼应。这些变化表明供体特异性调控网络随年龄逐渐简化和整合。
TF的基础调控架构预测其随年龄的变化
接下来，我们询问TF调控子的内在特性是否可以解释为什么某些TFs随年龄增加活性而其他则崩溃。测试广泛的调控子级别特征，揭示了几个与年龄相关TF行为显著相关的预测因子(图6a；扩展图7d)。随年龄增加的TFs优先调控GC丰富的目标启动子，并在其自身基因座上具有GC丰富的启动子。这些年龄弹性TFs也显示出更高的基础可及性，并倾向于靶向与相关顺式调控区域更可及的基因。相比之下，随年龄下降的TFs更依赖远端调控元件，反映在TF年龄斜率与连接峰与目标基因转录起始位点的平均距离之间呈负相关。尽管这些特征在TF目标基因处最强，但在TF基因座本身的顺式特征也适度预测(图6b)。
TF目标基因启动子的GC含量在应激和髓系/红系TFs中较高，而在HSC自我更新和淋巴系TFs中较低(图6c)，表明一些TF谱系差异可能由这些基础TF特征解释。重要的是，目标启动子GC含量与TF年龄斜率之间的关系在谱系类别内持续存在(图6d)，表明基础架构特性(而非谱系身份本身)塑造了年龄相关TF变化的幅度。
跨TFs，这些特征仅弱到中度相关，表明它们捕捉调控架构的部分独立特性(图6e；扩展图7d)。与此一致，结合这些特征的留一交叉验证Elastic Net模型比任何单个特征更好地预测年龄相关TF活性斜率(图6f；扩展图7e)。
为测试这些关系是否依赖于SCENIC+推断，我们应用了基于CollecTRI的正交TF活性框架。这种独立方法恢复了细胞类型特异性TF标记物和谱系定义活性模式(扩展图8a-b)，并再次显示应激反应和髓系相关TFs随年龄活性增加，以及HSC自我更新和淋巴系相关TFs相对下降(扩展图8c-d)。它还揭示了基础TF活性与年龄相关轨迹之间的显著关系，高度活跃的TFs倾向于随年龄保留或上调(扩展图8e-f)。
总体而言，我们的发现支持一个模型，其中细胞内HSPC衰老可以由调控架构对衰老的选择性脆弱性来解释，其中基因调控架构的渐进性熵不稳定优先侵蚀增强子驱动的身份相关网络，同时保留本质上稳健的启动子近端应激和髓系程序(图6g)。
讨论
配对的RNA和ATAC分析跨越均匀分布的成年队列使我们能够超越造血衰老的描述性特征，并询问调控架构如何被重塑。这在HSPCs中特别相关，其中髓系偏向、应激激活和干细胞功能丧失是已知的与年龄相关的表型，其机制关系一直不明确。
年龄相关的造血中谱系偏向通常被解释为髓系偏向区室或克隆的扩展，但我们的数据显示更广泛的模型。虽然我们恢复了预期的衰老组成特征，但年龄相关的调控特征在单个细胞类型和整个造血层次结构中持续存在，表明协调的细胞内重塑。应激激活、髓系偏向、淋巴系下降和身份侵蚀似乎是单一GRN级重布线过程的耦合输出，而非独立现象。
我们提出了一个架构依赖性调控熵的框架。衰老增加GRN中的调控噪声，但每个TF程序的脆弱性由其基础架构塑造。启动子近端、GC丰富、高度可及的调控子抵抗熵衰减并被保留或放大，而复杂的增强子依赖性调控子崩溃并逐渐下降。TF脆弱性因此跟踪调控稳定性轴而非谱系身份(图6g)。
该模型统一了通常被视为独立过程的造血衰老标志。应激反应和髓系/红系程序(富含启动子近端架构)随年龄活性增加，而淋巴系、HSC自我更新和细胞身份程序(富含远端增强子架构)下降。年龄相关的髓系偏向因此可能反映了在个体衰老细胞内髓系相关调控架构的优先保留，而不仅仅是髓系偏向克隆的扩展。
架构依赖性熵框架解释了调控变化的模式而不承诺特定的上游原因。启动子近端程序可能更具弹性，因为它们需要更少的协调染色质调控，而远端增强子依赖性电路依赖于复杂、持续维护的交互，这些交互更容易被破坏。多种过程可能提高调控噪声，包括染色质维护系统的失败、累积的DNA损伤、复制相关的染色质漂移、辅因子耗竭和持续的炎症信号。每种都将优先使最不稳健的程序不稳定，该模型不需要区分它们。与此一致，HSPCs中染色质维护机制的扰动产生类似衰老的表型：EZH2敲除表型模拟AP-1过表达，SWI/SNF丢失损害谱系输出，H3.3缺失导致过早衰竭，H3K4甲基化耗竭导致造血衰竭。
该框架还将先前的应激中心模型置于更广泛的背景中。先前的工作提出，瞬时应激反应随年龄不完全解决，留下持久的染色质状态，侵蚀细胞身份。例如，SIPHON模型提出AP-1过激活劫持转录辅因子并关闭身份相关染色质。我们的结果扩展了这一观点，表明AP-1激活是更广泛调控不稳定的体现之一，而非其主要原因。在熵框架中，应激获得和身份丧失不需要因果链接；两者都可以从同一不稳定化过程中出现，应激程序上升是因为它们架构稳健，身份程序下降是因为它们不是。
该框架做出了几个可检验的预测。首先，调控子架构应在跨组织中预测衰老脆弱性，不仅在造血中。身份依赖于复杂远端增强子网络的细胞类型应在调控水平上比由更简单的启动子近端电路控制的细胞类型衰老更快。与此一致，肠干细胞中染色质维护的破坏选择性地侵蚀远端增强子程序，同时保留启动子近端调控。其次，衰老组织中的谱系偏向应部分反映竞争命运程序之间的架构差异。第三，持久的再生将需要抑制应激TFs以及恢复身份电路，以及维持这些程序的染色质维护机制。
应注意到几个限制。我们的分析主要是相关的，扰动将需要建立调控熵、染色质架构和TF衰老轨迹之间的因果关系。一些结论依赖于计算GRN推断，这可能引入方法特定的偏见，尽管主要TF趋势得到正交方法的支持。我们的横断面队列还包括有限的捐赠者表型，超出年龄和性别的未测量协变量(如克隆性造血状态、BMI和药物使用)可能有助于观察到的特征。最后，虽然我们确定了细胞内衰老特征，但我们不能排除组成变化、衰老骨髓微环境或克隆选择的贡献，这些可能与内在调控不稳定相互作用。
我们的图谱将HSPC衰老的规范标志减少到一个基本逻辑：随着年龄增长，调控网络经历结构熵衰减。应激和髓系程序持续存在，因为它们的启动子近端架构在调控噪声下易于维护，而身份和自我更新程序因它们的远端、增强子依赖架构难以维持而退化。如果这种熵原则超越造血，它将为年龄相关的细胞状态脆弱性、应激高激活和谱系扭曲提供机制解释。
【全文结束】