引言
在早产儿中，极度低胎龄(ELGA，胎龄小于28周)出生的婴儿面临严重并发症的最高风险，特别是在肺和脑发育方面。支气管肺发育不良(BPD)是一种影响早产儿的慢性肺病，在ELGA人群中的发病率高达45%。BPD由早产和为支持这些脆弱婴儿而进行的强化治疗(如机械通气)引起的肺部发育受损所致，这些因素使发育中的肺部暴露于包括氧化应激和炎症在内的有害因素。这些因素干扰正常肺生长，导致BPD的发展。尽管围产期护理已取得进展，预防肺损伤仍然具有挑战性，BPD的发病率要么停滞不前，要么呈上升趋势。BPD不仅影响儿童期，还带来终身呼吸和神经发育后果，导致医疗成本增加。报告显示，年长儿童肺泡生长受阻、10岁时认知发育和生活质量评分较低、年轻人出现早期肺气肿以及肺动脉高压。在这一阶段的有效干预将提供卓越价值，因为它们可以预防终身疾病。目前，BPD尚无治愈方法。BPD的管理主要是支持性的，包括优化正压通气、营养、产后类固醇和利尿剂。考虑到BPD的多因素性质，针对单一途径的传统药物疗法不太可能显著改善结果。因此，迫切需要更有效和安全的治疗方法，这些方法能够提高无发病生存率，促进肺生长和发育，并预防进一步肺损伤。
间充质基质细胞(MSCs)因其多效性作用而成为BPD的一种有前景的治疗方法。临床前研究表明，MSCs可预防BPD动物模型中的肺损伤。概念验证研究表明，骨髓来源的MSCs可预防新生啮齿动物BPD模型中的肺泡发育受损。我们还证明，人类脐带血来源的MSCs和脐带组织来源的血管周围细胞的气道递送可保护肺泡和肺血管生长，恢复已建立肺损伤后的肺功能和结构，并产生长期治疗益处而无不良反应或肿瘤形成。此外，这项工作证明了MSCs的低植入潜力。与最初假设相反，没有证据表明MSCs可以在组织中植入并持续存在。越来越多的证据表明，MSCs通过旁分泌活性和细胞-细胞接触发挥其有益作用，解释了它们的多效性作用，如抗炎、抗纤维化和抗氧化特性。关于实验性新生儿肺损伤中MSCs的临床前系统评价虽然指出了几个不足之处，但支持了这些发现，并为使用MSCs预防BPD提供了进一步的生物学合理性。此外，实验性新生儿肺损伤和缺氧缺血性脑损伤或脑室内出血的临床前研究表明，MSCs具有神经保护作用。
包括早产儿在内的MSC临床研究展示了良好的安全特性。人同种异体MSC已在成人临床试验中广泛测试，多项系统评价证实了其临床安全特性，仅报告短暂发热而无免疫排斥或其他不良反应。一项专注于使用脐带来源MSCs(UC-MSCs)的临床试验的系统评价显示，无长期不良反应、肿瘤形成或细胞排斥。最近的一项系统评价证实了MSC静脉给药的安全特性，虽然发热风险增加，但无急性输注毒性、感染、血栓/栓塞事件、死亡或恶性肿瘤。最后，五项临床研究，包括我们的I期研究(HULC-1，尚未正式发表)，已评估MSC在ELGA早产儿中的安全性。未报告剂量限制毒性或严重不良事件(AEs)，证明MSC治疗在早产儿中的安全性和可行性。
我们的试验假设是，在出生后最初几周内给予多次人同种异体UC-MSC静脉注射，将减少有BPD高风险ELGA早产儿的机械通气持续时间并改善总体生存率。本研究设计为II期多中心随机对照试验，以评估该脆弱人群中UC-MSC治疗的疗效和安全性。
方法与分析
有关制定本临床试验方案所用理由的详细信息，请参阅《HULC2临床试验设计考虑的问题》在线补充材料2。本文按照干预性试验标准方案项目：试验建议(SPIRIT)指南起草；SPIRIT检查表见在线补充材料3。
研究设计
HULC-2是在加拿大三级新生儿重症监护病房(NICUs)进行的II期多中心双盲随机对照试验。预计参与者招募将于2026年秋季开始，持续3年，预计包括长期随访(长达10岁)在内的研究完成时间为2039年。研究流程图见图1。
研究问题
我们使用人群、干预、对照和结局(PICO)框架制定的主要研究问题是：在机械通气的ELGA早产儿中，与无UC-MSC注射(对照组，每周一次模拟程序，持续3周)相比，多次静脉注射人同种异体UC-MSCs(每周一次10×10^6细胞/kg，持续3周)是否增加考虑死亡因素的机械通气自由天数(VFDs)？
次要研究问题包括确认静脉注射人同种异体UC-MSC在此人群中的安全特性，以及在ELGA患者中多次静脉注射UC-MSCs是否影响(改善或恶化)所有原因住院死亡率、呼吸结局、早产并发症、24个月校正年龄时的神经发育以及长期健康结局。
研究人群
我们的研究将针对仍依赖机械通气且氧需求升高的ELGA婴儿，旨在确定BPD风险最高且最可能从早期干预中受益的婴儿。
A. 纳入标准
一旦父母或替代决策者提供书面知情同意，婴儿即可参与。婴儿必须符合以下所有纳入标准：
- 胎龄小于28周。
- 出生后年龄在4-14天之间。选择4-14天的纳入窗口是为了识别持续依赖呼吸机的婴儿，这是后续BPD的强烈且一致的预测指标。
- 机械通气且吸入氧浓度(FiO2)≥0.3。气管插管患者需满足以下任一通气模式：常规通气、高频通气(震荡或喷射)，且在过去24小时内至少12小时FiO2≥0.3。
B. 排除标准
- 先天性异常，包括遗传和染色体综合征、重大先天性异常和先天性代谢错误。
- 休克，定义为血流动力学不稳定伴有终末器官灌注受损(代谢性酸中毒伴乳酸升高和/或尿量减少)，需要液体推注、正性肌力药或血管加压药物。
- 严重败血症，定义为血流动力学不稳定(至少需要一次液体推注)且血或脑脊液培养阳性。
- 气胸伴有胸腔引流管。
- 严重肺出血，定义为活动性肺出血，至少伴有以下一项：血流动力学不稳定和/或需要血液制品输注。
- 计划在接下来24小时内拔管。
- 预期无法生存(重新定向护理或临终状态)。
入组过程和随机化
预计参与者招募将于2026年秋季开始，持续3年，预计包括长期随访在内的研究完成时间为2039年。入组过程包括在NICUs中识别潜在参与者，通过健康记录和医师评估确认其资格。使用专门的动画信息视频向替代决策者寻求同意。家长和家庭可获取更多研究网页上的信息。使用伦理批准的表格获得书面同意(参与者同意表格见在线补充材料4)。渥太华医院研究所的渥太华方法中心将生成计算机生成的随机化列表。参与者将以1:1比例随机分配，使用大小为4和6的置换随机变量块，以避免显著的组间不平衡。基于妇女和儿童健康研究所的REDCap门户网站将用于确认研究资格并生成治疗分配。由于细胞制造过程和运输，我们预计随机化和首次注射之间有48-72小时的时间。因此，给药前将重新评估排除标准，如有安全问题，将不进行给药。入组过程和随机化的不同步骤见在线补充材料5。
干预组
分配到干预组的参与者将每周(每7天±1天)接受一次新鲜人同种异体UC-MSC静脉注射，剂量为10×10^6细胞/kg，持续3周。基于临床前和临床数据选择每周给药，以在持续肺损伤的关键时期维持MSC的抗炎和修复作用。
与我们的I期试验(HULC-1)相比，我们的II期试验将使用新鲜细胞产品和多次给药。表1概述了我们干预组选择的依据，包括细胞组织来源、给药途径、多次注射和使用新鲜细胞产品。细胞制造过程和细胞产品的更多信息见在线补充材料6。细胞产品的特性和制造将按照MSC试验的临床报告指南进行报告。
UC-MSC溶液(5 mL)将通过外周静脉导管以注射泵在15分钟内输注，并在15分钟内输注额外体积的生理盐水以冲洗静脉管路死腔。
尽管成人群体和早产儿群体的临床数据显示MSC具有良好的安全特性，但已识别出与UC-MSC静脉给药相关的潜在风险，并制定了监测和风险缓解策略，见表2。最常报告的不良反应是与MSC输注相关的发热。报告的发热是短暂的、自限性的，且与败血症或神经损伤无关。此外，不良事件将根据我们特定的研究输注反应方案进行管理，见在线补充材料7。
对照组
最初考虑使用安慰剂，即静脉输注细胞载体。然而，仅为了生理盐水输注而重复外周静脉导管插入引发了对父母接受度和潜在对入组影响的严重担忧。我们调查了父母，发现近一半人不太可能参与要求外周静脉插入进行生理盐水输注的研究(未发表数据)。因此，对照组参与者将每周接受一次模拟程序，持续3周，以维持双盲，同时不损害入组。随机分配到对照组的患者不会进行外周静脉导管插入；相反，我们将模拟程序(外周静脉导管插入和细胞产品输注)，并在假定的插入部位应用绷带。在评估早产儿程序性干预的随机对照试验中已成功应用模拟程序以维持盲法。
盲法
为维持父母和医疗保健提供者对研究程序(UC-MSC注射vs模拟)的盲法，我们将与盲法和非盲法研究团队合作，并实施以下协议。细胞产品或模拟材料将以密封的研究盒形式递送到床边。然后，由非盲法团队(一名护士和/或医师)在隐私屏风后执行程序。包括在非盲法团队中的个人将签署保密协议，并不参与任何其他研究活动，包括数据收集(除收集程序期间和之后的生命体征外)或不良事件报告，也不参与参与者的临床护理。为评估盲法的有效性，床边工作人员将在每次程序后完成问卷，表明其角色(例如，护士、医师、呼吸治疗师)、其对所执行程序的猜测(干预、对照或未知)及其理由。
结局
A. 主要结局：考虑死亡因素的机械通气自由天数
本研究的主要结局是机械(侵入性)通气自由天数，在随机化后120天测量并考虑死亡因素。VFDs将计算如下：
- 如果患者在120天内死亡或在此时间点后仍需要通气，则VFD=0天。
- 如果患者成功脱机并在120天窗口内存活，则VFD=120减去机械通气天数。
主要结局将在随机化后120天测量，以使最年轻的潜在参与者达到足月校正年龄。此外，根据Dassios等人的研究，99%以上胎龄低于28周出生的存活患者应在出生后第100天前脱离机械通气。研究新生儿医师认为7天的机械通气自由差异是观察到的临床重要差异，需要进行III期试验。选择此结局是因为其临床相关性以及能够同时捕获通气持续时间和生存率：
临床相关性：VFD是成人和儿科急性呼吸窘迫综合征(ARDS)临床试验中常用的首要结局。在早产儿中，机械通气持续时间与BPD风险增加、脑室内出血和更差的神经发育相关。延长机械通气也与更高的死亡风险、家庭氧疗需求和出院时通气相关。缩短机械通气在临床上和经济上都有意义，因为它减少了护理级别和相关的潜在痛苦程序。机械通气也是NICU中父母压力的关键因素。
可行性：考虑死亡因素的VFDs是适当的复合结局，如果干预可能同时减少通气持续时间和死亡率。MSC的多效性作用支持假设，即UC-MSC在ELGA早产儿中的给药可能会减少早产并发症的发生，从而降低总体死亡率。
B. 次要结局
次要结局旨在评估静脉注射人同种异体UC-MSC的安全性、这些UC-MSC对呼吸状态、早产主要并发症和我们ELGA早产儿研究人群中24个月校正年龄时神经发育的影响。次要结局还包括使用父母报告问卷每年评估的长期参与者安全性和呼吸健康，直到10岁(表3)。参与者时间线见在线补充材料8。
样本量计算和数据分析
先验样本量计算确定将招募168名参与者(每组84名)，以实现80%的把握度和0.05的α值。此计算考虑了非参数分布，并旨在检测机械VFDs增加7天。研究新生儿医师认为7天的机械通气自由差异是需要观察到的临床重要差异，以便进入III期试验。此外，根据Dassios等人的数据，我们预计90%以上的潜在参与者将在出生后50天内脱离机械通气，使50天期间7天的机械通气自由差异在临床上相关。根据美国大型研究的推断，胎龄<28周新生儿的通气自由天数的标准差估计为15。样本量已通过15%(Lehmann方法)增加，以考虑非参数分布。主要结局将使用Mann-Whitney U检验进行分析。将计算中位数差异和95%置信区间。将使用考虑中心、性别、胎龄、出生体重和入组出生后天数的分位数回归进行调整分析。将使用未调整的χ²检验和log-binomial logistic回归分析次要二分疗效结局，以产生未调整和调整的相对风险及95%置信区间。将使用适当的参数或非参数检验以及广义线性模型比较连续结局。统计分析计划见在线补充材料9。
安全性、不良事件和试验监测
参与者安全是HULC-2试验的首要优先事项。尽管临床前研究和早期临床试验支持MSC治疗的良好安全特性，包括UC-MSC的静脉给药，但已识别出与静脉细胞输注相关的潜在风险，并进行密切监测。
所有参与者均在NICUs中管理，并接受包括心率、呼吸率、血氧饱和度、血压、体温和呼吸机设置在内的连续标准护理监测。此外，在每次研究程序(干预或模拟)期间和之后进行特定研究的监测。预先定义的剂量限制毒性包括死亡、过敏反应、给药后24小时内呼吸或血流动力学支持的显著升级，或无替代解释的严重意外不良事件(SAEs)。
不良事件和SAEs从第一次研究程序开始到医院出院、转院或死亡，进行前瞻性收集。研究"操作手册"包括早产儿在NICU中常见的事件列表(即呼吸暂停、心动过缓、呕吐)，这些不会被记录为AEs和SAEs。在研究CRF上捕获的任何数据也不会被视为AE或SAE。事件由现场调查员或委托医师评估严重程度、预期性和与研究产品的相关性。预期的早产并发症被记录为研究结局，并由数据和安全监测委员会(DSMC)审查，但除非被认为是意外或严重，否则通常不被归类为AE。
一个由新生儿临床试验、细胞治疗和试验方法学专家组成的独立DSMC在整个研究过程中监督参与者安全。DSMC定期审查SAEs，并在完成每10名参与者(最多50名入组参与者)的研究给药(干预或模拟)后，以及随后每25名参与者直到研究完成，进行计划的安全性审查。DSMC独立于研究调查员运作，如有必要，可访问未盲法的治疗分配，以充分评估安全信号。调查员、临床团队和结局评估者保持盲法，除非出于参与者安全原因需要解盲。DSMC可能会根据其安全评估建议继续、修改或终止试验。
伦理与传播
伦理
已获得渥太华健康科学网络研究伦理委员会(OHRN-REB #20250378-O1T)和安大略省临床试验(CTO #5391)的伦理批准。
注册和数据可用性
本临床试验于2025年7月10日注册于ClinicalTrials.gov(NCT 07058025)。
传播
本研究遵循渥太华医院研究所出版政策，并在ClinicalTrials.gov上注册，其方案已发表。本研究结果将在ClinicalTrials.gov上共享，并在主要国家和国际会议上展示，根据我们团队最近开发的使用MSC的临床试验报告指南在科学期刊上发表。为确保公众理解和参与，患者合作伙伴将帮助创建便于广泛传播的材料。外展工作将包括论坛、学生活动、慈善机构、医学协会、医院基金会和在线网络研讨会。研究参与者将能够通过研究网页(www.hulc-2.ca)获取结果。此外，我们的实验室网站(xplorelab.ca)将提供定期更新和教育内容，以提高对MSC生物学及其改善早产儿结局潜力的认识。
患者和公众参与
极度早产儿的父母和加拿大早产儿基金会代表(www.cpbf-fbpc.org/)从HULC-2试验设计开始就参与其中。两名家长合作伙伴参与了结局选择、研究程序审查和参与者面向材料(包括同意表和动画信息视频)的开发。他们的反馈影响了关键设计决策，包括使用模拟程序以提高接受度同时维持盲法。家长合作伙伴将在试验实施和传播过程中继续参与，包括研究结果的通俗语言摘要开发。家长合作伙伴不会参与招募或干预交付。
新颖性、临床相关性、普遍适用性和局限性
HULC-2是一项多中心、双盲、随机II期试验，旨在评估重复静脉注射新鲜UC-MSC在有BPD高风险ELGA婴儿中的有效性和安全性。试验的新颖方面包括使用多剂量方案、新鲜细胞产品和以考虑死亡因素的VFDs为主要结局，这是一个临床上有意义的测量，同时捕获生存和恢复，与新生儿实践直接相关。
如果证明有效和安全，本试验的结果将为未来III期研究的设计提供信息，并为细胞治疗在新生儿肺疾病中的可行性和潜在临床影响提供重要证据。减少对延长机械通气的暴露可能对这一高风险人群的呼吸、神经发育和医疗结局产生直接影响。
在加拿大多中心NICU环境和基于持续呼吸机依赖的实用性纳入标准增强了在类似三级护理环境中的普遍适用性。然而，在无法获得专门细胞制造或基线疾病严重程度较低的人群中，适用性可能有限。
关键局限性包括II期试验固有的局限性，包括对罕见或长期结局的把握力有限。为优化可行性和父母接受度而选择的模拟程序尽管有缓解策略，但仍可能引入解盲风险。此外，VFDs可能受中心特异性通气实践的影响。尽管如此，HULC-2代表了UC-MSC治疗预防严重新生儿肺疾病的转化评估的重要一步，也可能预防其他相关的新生儿并发症。
伦理声明
患者同意出版
不适用。
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