背景：尽管进行了根管清洁和成形，但根管内难以触及区域的残留微生物群以及各种根管冲洗液对牙本质矿物质含量的不利影响，仍然是根管治疗成功的主要挑战。本研究旨在开发一种具有良好润湿能力的治疗性和生物活性树脂基根管封闭剂（RCS）。
方法：合成了银聚多巴胺修饰的羟基磷灰石（HA-PDA-Ag-PDA）填料。使用X射线衍射（XRD）分析了羟基磷灰石颗粒，而最终制备的填料则通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和透射电子显微镜（TEM）进行表征。以树脂基RCS（Adseal®）作为对照组（G0）。与改性组（G1）和（G2）相比，银聚多巴胺修饰的HA填料分别以1%和2%重量比添加到测试RCS中。评估了未改性RCS（G0）和改性RCS（G1和G2）的抗菌性能、再矿化能力和润湿性。数据通过单因素方差分析进行分析，并进行事后检验进行两两比较。
结果：XRD、FT-IR、TEM表征确认了HA-PDA-Ag-PDA填料的成功合成。改性RCS显示出对粪肠球菌（E. faecalis）的强大抑制效果，且G1和G2之间无显著差异。改性RCS（G1和G2）还表现出良好的矿化潜力和牙本质表面润湿性的改善。
结论：HA-PDA-Ag-PDA填料显著提高了树脂基RCS的抗菌、矿化性能及润湿能力。
材料与方法：在获得曼苏拉大学牙科学院伦理委员会批准（批准号M0109023DM）后，收集了15颗单根牙齿用于根管封闭剂润湿性评估。研究使用了一种商业RCS，Adseal®（Meta Biomed，韩国清州）。
样本量计算：基于G Power软件版本3.1.9.7，效应值为0.864，采用双尾检验，α错误为0.05，功效为80%，确定每组至少需要6个样本。样本量增加到每组10个。
纳米羟基磷灰石粉末（nano-HA）的合成：采用湿化学沉淀法准备羟基磷灰石颗粒。用100毫升蒸馏水溶解2.35克四水硝酸钙，并用氨水溶液将pH调至约9-10。随后，用另一100毫升水溶解0.771克磷酸氢二铵，并将其逐滴加入硝酸钙溶液中，在室温下搅拌24小时形成凝胶状沉淀物。所得溶液再老化24小时，形成的HA粉末通过离心分离（TM1721，Fisher Scientific Company，美国）。用蒸馏水多次洗涤所得粉末，并在50°C烘箱中干燥过夜。
银聚多巴胺修饰的HA填料（HA-PDA-Ag-PDA）的合成：将纳米HA颗粒分散在100 mL Tris溶液中，并用盐酸将pH调至约8.5。随后加入多巴胺盐酸盐以生成2 mg/mL浓度的水溶液，在室温下搅拌24小时。溶液保持开放，使多巴胺盐酸盐氧化自聚合，在纳米HA表面形成PDA涂层。所得粉末通过离心分离并用乙醇和去离子水清洗三次，然后在室温下干燥24小时。HA-PDA分散在100 mL硝酸银溶液（50 mM）中并在室温下搅拌4小时以生成HA-PDA-Ag。PDA涂层上的儿茶酚和氨基促进了Ag+吸附到HA-PDA上，随后转化为金属银纳米粒子。产物通过离心分离并用乙醇和去离子水清洗三次，然后干燥。为了第二次PDA涂层，将HA-PDA-Ag重新分散在多巴胺盐酸盐水溶液中并连续搅拌4小时。最终产品按前述相同方法分离并干燥。
制备的HA-PDA-Ag-PDA填料的表征：通过确定其官能团使用傅里叶变换红外光谱仪（Jasco FT/IR 4100）确认了合成的（nano-HA）的制备，同时通过X射线粉末衍射仪（XRD，BRUKER Co.D8Advanced，德国）研究了其结晶相。通过FTIR确定了每个HA-PDA、HA-PDA-Ag和HA-PDA-Ag-PDA的官能团，而最终合成填料的形态和尺寸通过透射电子显微镜（TEM）（Talos L120C G2，Thermo Fisher Scientific，美国）检查。
标本的制备和分组：自固化环氧树脂基封闭剂Adseal®（Meta Biomed，韩国清州）作为对照组（G0）。与改性组（G1）和（G2）相比，银聚多巴胺修饰的HA填料分别以1%和2%重量比添加到树脂基封闭剂中。评估了每组的抗菌活性、再矿化潜力和润湿性。对于标本的制备，根据标准化协议将HA-PDA-Ag-PDA填料掺入Adseal RCS中，该协议基于颗粒的重量百分比。使用四位数敏感天平（RADWAG Wagi Elecktroniczne，型号AS 220R1，波兰，欧盟）测量每克RCS所需的基本纳米颗粒重量，以达到相对于RCS所需的纳米颗粒浓度。将HA-PDA-Ag-PDA填料加入RCS中，并用塑料平头牙科刮刀混合，直至形成均匀的奶油状混合物。
抗菌性能评价：微生物菌株和生长培养基：抗菌功效针对粪肠球菌（ATCC 29212）进行评估。将E. faecalis菌株接种到脑心浸出液肉汤（BHI）中，并在37°C下孵育24小时。通过观察孵育后的肉汤浑浊度来评估细菌增殖。通过目视将接种管与标准品进行比较以评估浑浊度。BHI琼脂用作改良直接接触试验的培养基。
改良直接接触试验（MDCT）：MDCT涉及在96孔微量滴定板中量化细菌增殖的菌落形成单位（CFU）。在每个孔底均匀涂覆测试密封剂（每组10个孔）。总共制备了60个样本，其中30个新鲜样本立即测试，另外30个样本在24小时后测试（每组10个）。将10 µL的细菌悬浮液（10^5 CFU/ml）应用于密封剂样品表面。样品在37°C和100%湿度下孵育至悬浮液体蒸发，留下一层薄薄的细菌膜与被测密封剂表面接触。每个含有材料的孔接收240 µL BHI肉汤。轻轻混合细菌悬液一分钟后稀释，并将10 µL部分应用于BHI琼脂板。将平板在37°C下孵育24小时后，计数平板上的菌落数。计算并比较CFU/mL。
矿化能力评价：实验RCS的矿化活性通过扫描电子显微镜配备能量色散X射线（SEM/EDX）（Quanta FEG250，Thermo Fisher Scientific（FEI））检测密封剂表面形成的羟基磷灰石来评估。每组制作一个代表性圆盘状样品，直径10毫米，厚度2毫米，并在环境温度下放置24小时，浸入模拟体液（SBF），每份样品10毫升，在37°C下每天更换一次。通过（SEM/EDX）在第14天和第28天检查表面形态和钙磷比例的变化。
润湿性评价：通过使用座滴技术测量它们之间的接触角来评估改性RCS对牙本质的润湿性。从曼苏拉大学牙科学院口腔外科诊所收集了15颗单根、健康的恒牙。这些牙齿此前因牙周原因被拔除。使用自来水和超声波洁牙器清除附着的碎屑，然后进行检查以排除有根龋或缺陷的牙齿。随后用0.1%百里酚溶液清洗24小时，并在生理盐水中保存直至使用。通过纵向将牙齿沿颊舌方向切割成两半，获得30片牙本质，每组10片。每半部分使用320、600和1200粒度的碳化硅纸进行平整和光滑处理。纵向牙本质切片用NaOCl和EDTA溶液冲洗，复制化学机械预备冲洗。使用根管扩锉器将直径约为1 mm的液滴应用于牙本质样品。使用高分辨率相机在密封剂滴落到牙本质表面后立即拍摄图像，并使用IC Measure软件（IC Measure 2.0.0.245；The Imaging Source，不来梅，德国）分析接触角。
统计分析：数据的正态性通过Kolmogorov和Shapiro-Wilk检验进行评估，并通过Levene检验确认其同质性。统计分析使用SPSS 20®（SPSS，IBM，美国）进行。组间比较通过单因素方差分析进行，随后进行Tukey事后检验。新鲜混合物和混合物24小时后的比较通过配对t检验进行。显著性水平设为_P_ < 0.05。
结果：制备的HA-PDA-Ag-PDA填料的表征
X射线衍射分析（XRD）：如图1所示，合成羟基磷灰石粉末的XRD图具有与联合粉末衍射委员会（JCPDS，PDF # 09-0432，Hydroxyapatite，syn）报告的标准数据相当的特征峰。出现在2Ɵ= 25.95°、31.85°、32.12°和49.61°的峰对应于结晶HAp的反射峰。
傅里叶变换红外光谱分析（FTIR）：FTIR光谱在400到4000 cm− 1范围内收集。HA-PDA-Ag-PDA填料形成每个阶段的FTIR光谱显示多个不同的带峰，对应于各种官能团和相互作用，如图2所示。首先，纯羟基磷灰石（HA）的FTIR光谱显示了其组成的特征峰。3430 cm− 1处的显著峰值表示O-H伸缩振动，表明HA表面上存在羟基。1037 cm− 1、603 cm− 1、567 cm− 1和478 cm− 1处的峰值与磷酸盐（PO43−）振动一致。此外，还在1429 cm− 1附近看到B型碳酸盐带，这表明存在碳酸磷灰石。这可能是由于从大气中吸收二氧化碳。涂覆HA后，PDA的FTIR光谱观察到显著变化。尽管O-H伸缩峰仍然存在，但该峰（3156.9 cm− 1）的展宽表明HA和PDA的羟基之间可能存在氢键或相互作用。1592 cm− 1和1508 cm− 1处的峰值表明PDA中的C = C伸缩振动和芳香环振动已显示出来，证明PDA涂层成功。随后在HA/PDA复合材料中添加银纳米粒子（Ag）产生了独特的FTIR光谱。3171 cm− 1处的显著峰值表明羟基的存在，可能来自PDA和Ag。与PDA相关的峰值（1590 cm− 1和1442 cm− 1）在HA-PDA-Ag中的持续存在表明PDA可能有助于稳定或与银纳米粒子相互作用。当PDA与银纳米粒子表面结合时，归属于C–O键的峰值从1286 cm− 1轻微偏移到较低波数1275 cm− 1。最后，在HA/PDA/Ag复合材料上应用第四层聚多巴胺。HA-PDA-Ag-PDA的FTIR光谱显示了额外的变化。3169 cm− 1处的峰值证实了羟基的存在，可能源自额外的聚多巴胺层。1502 cm− 1和1437 cm− 1处的峰值表明PDA的持续存在。1354 cm− 1处出现的峰值表明有机物质的参与。
透射电子显微镜分析（TEM）：通过TEM检查来研究填料颗粒的形状和尺寸。如图3所示，AgNPs在HA-PDA表面上表现为20到50 nm范围内的纳米级黑色球体，具有均匀分散，并被类似聚合物的材料包覆。聚合物涂层通过FTIR分析得到证实。
关于未改性RCS（G0）和改性RCS（G1和G2）对粪肠球菌的抗菌活性，表1显示了新鲜混合密封剂和24小时后的细菌菌落数量的平均值和标准偏差。MDCT表明，RCS（G1和G2）中包含HA-PDA-Ag-PDA填料在新鲜混合物和24小时后均表现出对粪肠球菌的统计学显著抗菌活性（p < 0.05）。
对于新鲜混合密封剂，第0组（对照组）显示出较高的菌落形成数量（198.57 ± 29.11），相比之下，第1组和第2组没有菌落生长（0.00 ± 0.0）。24小时后，第0组仍有最高的菌落数量（1142.86 ± 198.81），相较于新鲜混合物有所增加。第1组显示出有限的菌落数量（32.29 ± 2.69），第2组甚至更少（16.07 ± 3.49），且第1组和第2组之间差异不显著。此外，增加RCS中包含的填料百分比会导致菌落数量略有但统计学上不显著的减少，如图4所示。
关于生物活性测试的结果，经过14天的SBF浸泡后，SEM图像显示改性RCS组（G1和G2）表面的HA晶体形成并不明显，但使用EDX进行的表面元素分析显示与对照组（G0）相比，钙元素略有增加。相反，经过28天后，改性RCS组（G1和G2）表面覆盖了一层密集的HA层，通过EDX得以验证，因为其显示钙元素显著增加，而对照组（G0）表面没有变化（图5，图6）。
关于未改性RCS（G0）和改性RCS（G1和G2）的润湿性，表2显示了接触角的平均值和标准偏差。接触角测量测试证明，在RCS（G1和G2）中包含HA-PDA-Ag-PDA填料显著提高了RCS对牙本质表面的润湿性（p < 0.05）。第0组表现出最高的平均接触角（45.10° ± 0.61），表明在各组中润湿性最低。相反，第1组展示了降低的平均接触角（39.14° ± 0.24），第2组显示出显著降低的接触角（33.75° ± 1.15），表明润湿性最高（图7）。
讨论：在根管治疗中，可靠的微生物消除可以通过通常在可接近区域内的机械操作和冲洗来实现。然而，即使经过清洁、成形和使用强效抗菌治疗，根管微生物和生物膜仍常存在于难以触及的区域，例如副根管、峡部和牙本质小管中。此外，根管生物膜的特性使得细菌根除比浮游细菌更具挑战性。因此，诱导开发一种具有抗菌能力的新RCS，能够流入难以触及的区域并协助根除残留的根管微生物，从而提高根管治疗成功率。RCS增强和再矿化牙根结构的能力是另一个非常理想的特性。使用包括次氯酸钠（NaOCl）、洗必泰（CHX）和乙二胺四乙酸（EDTA）在内的不同冲洗液，虽然有助于溶解有机组织、消除细菌和去除碎屑，但也可能导致牙本质脱矿和硬度下降，从而增加根折裂的风险。此外，根管系统内部留下的微小间隙可能导致根管治疗失败，通过沉积再矿化离子填充这些间隙可以提高密封能力。
在之前的研究中，由于其出色的物理化学特性和生物反应性，树脂基RCS被通过掺入各种纳米颗粒来改进其抗菌和再矿化能力。因此，银纳米颗粒（AgNPs）已被证明对各种微生物具有抗菌活性。此外，先前的研究已经证明了纳米HA的再矿化潜力。本研究评估了一种包含三重生物活性剂AgNP、纳米HA和PDA的RCS。本工作的创新之处在于将这些成分组合成四层复合材料，然后将其纳入根管封闭剂中。这种组合增强了每种成分的效果，其中PDA可以促进仿生羟基磷灰石的发展。此外，PDA可用于银纳米粒子的原位合成，其强大的粘附能力提供了一种简单且环保的方法，将银纳米粒子与各种基材通过温和反应原位结合，这是一种有效防止银纳米粒子聚集、提高其稳定性和抗菌活性的方法。然而，尚未有关于这些三重组合剂对抗RCS的抗菌、再矿化和润湿性影响的报道。首先，使用湿化学沉淀法合成纳米羟基磷灰石，因为它是一种广泛使用的方法，因其低成本和能够合成大量HAp。XRD证实了成功合成结晶HA粉末，因为衍射峰位置与HAp的PDF卡片编号09-0432完全对应。然后，通过自氧化聚合过程在纳米HA颗粒上形成PDA涂层，该过程简单且可以在室温下进行。PDA原位还原硝酸银以生成银纳米粒子，利用邻苯二酚和胺基团通过聚多巴胺辅助的无电镀银金属化过程生成银纳米粒子涂层，由另一层PDA涂层稳定。
FTIR分析验证了这些多层填料的形成。如TEM图像所示，AgNPs具有较大的表面积。根据Ostwald-Freundlich方程，AgNPs的尺寸和形态影响银离子的生成。较小的、呈球形或准球形的AgNPs由于其较大的表面积，具有更高的银离子释放潜力。AgNPs的聚集限制了银离子的释放，而封端剂的使用可以防止这种聚集，增强AgNPs的溶解度并调节AgNPs的释放速率，提供可持续的抗菌活性。TEM图像还显示了充当封端剂的PDA涂层。
关于改性RCS的抗菌活性，本研究的结果表明，仅需1 wt%的浓度即可显著减少E. faecalis的生长，无需增加填料浓度。因此，将HA-PDA-Ag-PDA填料掺入RCS显著抑制了E. faecalis的增殖，E. faecalis是根管治疗失败和持续牙周炎的主要病因。改性RCS的抗菌活性可能归因于AgNPs。解释杀菌作用机制之一是它们释放银离子（Ag+）的能力。它们与核酸形成化合物并破坏它们。由于与含硫蛋白的亲和力和静电吸引力，银离子与细胞壁和细胞质结合，使其高度渗透并导致细菌外壳破裂。细胞对自由银离子的摄取抑制了呼吸酶，导致三磷酸腺苷（ATP）释放中断和活性氧（ROS）的产生，这是加剧细胞膜破坏和DNA改变的重要因素。此外，银离子能有效抑制蛋白质的生产，通过变性细胞质核糖体成分。而且，AgNPs干扰微生物信号传导可能会显著诱导细胞死亡并阻碍细胞增殖。
SBF浸泡试验广泛用于评估生物材料的生物活性。形成磷灰石的能力被认为是RCS生物活性的重要指标。在SBF中老化样品28天后，SEM图像显示实验组表面不同程度的HA沉淀，下面的密封剂不再可见。然而，对照组没有显示HA沉淀。SEM发现通过涂层化学成分的EDX元素分析得到验证，结果与SEM观察结果一致。EDX检查显示实验组表面钙元素显著增加，钙磷比高于羟基磷灰石（Ca/P = 1.67）的化学计量比。较高的钙磷比表明表面有钙沉积，这可能导致所需的生物活性。
实验RCS的生物活性可能归因于PDA和纳米羟基磷灰石颗粒。纳米HA颗粒作为晶核，通过不断吸引周围介质中的大量Ca和P离子来增强晶体形成和生长，从而导致相邻组织的仿生矿化，因为合成磷灰石的组成和结构与生物羟基磷灰石相同。此外，它们作为Ca和P的来源，导致局部过饱和状态以促进牙齿再矿化。然而，先前的研究表明，胶原基质无法启动HA的成核和发育，结果显示很少的再矿化。PDA可以有效促进牙本质再矿化。这一过程的机制是PDA表面有许多具有双重功能的邻苯二酚胺基团。这些基团有能力牢固地粘附在基材表面。然而，未粘附在基材上的邻苯二酚胺基团可以与Ca2+反应，增加表面Ca2+浓度，并有助于矿化晶体的生成。这种现象被称为聚多巴胺辅助的羟基磷灰石形成。因此，PDA通过结合胶原纤维并提供新的成核位点，增强仿生再矿化。
此外，基材表面的亲水性程度控制矿物成核和生长，因为基材的更高疏水性增加了它们与形成核之间的界面能量。成核和生长在亲水性表面上更快。因此，PDA的超亲水性使其成为矿物成核的合适基材。实现流体紧密密封依赖于RCS的润湿性能，以有效地作为牙本质壁和核心充填材料之间的粘合剂。为了实现牢固的粘附，密封剂必须与基材密切接触。这促进了分子吸引力，并有助于更多的化学或微观机械表面互锁。本研究结果表明，将HA-PDA-Ag-PDA填料掺入RCS显著提高了RCS对牙本质表面的润湿能力。这可能归因于PDA的超亲水性。其极高的亲水性与其富含胺和羟基的基团相关。将PDA掺入基质中增强了其亲水特性。
结论和建议：在本研究中，使用简单、温和且环保的方法成功制备了银-聚多巴胺修饰的羟基磷灰石填料。将这些填料混合到树脂基根管封闭剂中，希望开发一种生物活性材料。目前的研究结果表明，HA-PDA-Ag-PDA填料可以增强RCS对粪肠球菌的抗菌效果。此外，开发的RCS表现出再矿化潜力，并改善了牙本质表面的润湿性，形成了更稳定的牙齿-材料界面。
基于当前研究的结果，作者强烈建议在未来近期内进行进一步的体内研究，以评估所制备的实验性根管封闭剂的长期临床有效性。
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