记忆T细胞是一群经历过抗原刺激的高度异质性细胞，在抗原再次接触和环境信号的影响下会发生动态适应。这种异质性为研究记忆T细胞的持久性和与年龄相关的功能障碍带来了挑战。通过慢性EB病毒感染和条形码标记抗原追踪技术，本研究评估了年龄对抗原特异性单个CD8⁺ T细胞记忆状态的影响。在年轻成人（<40岁）中，识别不同抗原肽的EBV特异性CD8⁺ T细胞展现出不同的优先分化表型；而在老年成人（>65岁）中，这些抗原特异性细胞则显示出显著不同的表型和转录组老化轨迹。许多抗原特异性群体共同表现为维持TCR多样性、获得自然杀伤细胞样先天特征以及失去干细胞样特性，但未见细胞衰老或耗竭的证据。TCR亲和力对这些表型差异和与年龄相关的变化有贡献。总体而言，这些数据揭示了由抗原引导的记忆T细胞表型的不同老化转变，这对优化疫苗设计和过继性T细胞治疗中的抗原选择具有重要意义。
抗原特异性记忆T细胞的老化轨迹
为了控制记忆T细胞生成和稳态的主要混杂因素——年龄，我们聚焦于针对特定病原体的抗原特异性记忆T细胞。研究了人类外周循环记忆CD8⁺ T细胞在多种EB病毒（EBV）抗原上的异质性和老化特征。这种方法使我们能够检查具有不同抗原特异性但在生命早期同时被启动的记忆T细胞的老化轨迹。
EBV记忆T细胞反应是一个合适的模型系统，因为它利用了T细胞异质性和老化的重要特性：(i) EBV感染全球超过90%的人口，主要发生在25岁之前。在原发性EBV感染解决后，EBV病毒DNA作为潜伏的慢性感染在记忆B细胞中终生保留。(ii) 淋巴细胞，特别是CD8⁺ T细胞，对于病毒控制和急性EBV感染的解决至关重要。一部分EBV反应性T细胞作为记忆T细胞终生保留。(iii) 尽管平行启动，针对裂解期和潜伏期抗原的CD8⁺ T细胞在感染后的前几年内表现出不同的轨迹，无论是在频率还是CD45同工型表达上。(iv) 与其他疱疹病毒如水痘-带状疱疹病毒（VZV）类似，EBV在免疫抑制条件下重新激活，包括与正常老化相关的条件。分子水平上，EBV病毒DNA可以在50岁以上成人的外周血中检测到。虽然与年龄相关的再激活在大多数老年人中保持亚临床状态，但EBV相关恶性肿瘤（包括淋巴增生性疾病如弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和鼻咽癌）在年龄增长时更频繁地被诊断出来。(v) EBV记忆T细胞数量在老年时基本稳定。关于其功能特征和表型是否易受年龄相关功能障碍影响的数据存在冲突。(vi) 针对EBV的体液免疫反应的老化并不重要，因为EBV血清状态不随年龄变化。
为了确定抗原特异性CD8⁺ T细胞如何老化，我们采用了基于条形码的抗原追踪方法来研究针对不同EBV蛋白的记忆CD8⁺ T细胞。我们发现，根据所识别的抗原，细胞在年轻成人中有偏好的不同分化状态，并随着年龄的增长经历不同的命运轨迹。尽管一些老化特征在抗原特异性中是共享的，但许多老化变化是非均匀的或在程度上有所不同。具体来说，识别潜伏期EBV蛋白的一些克隆显示出更大的年龄相关变化，表明这些特异性占了与年龄相关的T细胞记忆缺陷。
结果
年轻成人EBV特异性CD8⁺ T细胞的分化状态
Hislop等人检查了EBV感染后记忆反应的演变，得出结论认为，在原发感染期间和无症状病毒持续的第一年至十年间看到的抗原特异性CD8⁺ T细胞群体是不同的。原发反应主要由裂解表位特异性主导，这些特异性在急性感染解决后比最初较少的潜伏表位特异性收缩更多。重要的是，抗原的性质也决定了这些群体的表型变化演变，裂解抗原特异性T细胞向CD45RA阳性表型的转变更大。为了识别CD8⁺记忆T细胞的老化轨迹，我们决定控制所识别抗原的类型，并首先在一个年轻成人队列中进行横断面的广泛表型分析。我们纳入了8名HLA-A*02:01+个体，他们具有可检测的EBV特异性T细胞，可能由于临床上无症状的感染，这种情况经常在儿童时期发生。我们使用4种加载EBV肽的四聚体（针对EBV裂解周期中的BMLF1、BRLF1或潜伏周期中的LMP2、EBNA3C）以及20种细胞表面标记物进行了多重光谱流式细胞术分析，以识别经典T细胞亚群、表型和细胞状态。我们首先对四聚体阴性、整体CD8⁺ T细胞进行了高维聚类分析，生成了一个无偏倚参考图，再现了CD8⁺ T细胞亚群，如多个幼稚和干细胞样记忆细胞（SCM）、中央记忆（CM）、效应记忆（EM）和表达CD45RA的终末效应记忆细胞（TEMRA）。为了评估EBV特异性细胞的表型和异质性，我们将EBV四聚体阳性细胞映射到整体参考图上，发现抗原特异性T细胞之间以及每个抗原特异性内部的表型状态存在显著差异。与Hislop等人的观察一致，平均而言，针对裂解抗原BMLF1和BRLF1的T细胞更为分化且包含终末分化的TEMRA细胞，而针对潜伏抗原LMP2和EBNA3C的T细胞则缺乏TEMRA细胞并含有更多的EM细胞。然而，个体间的差异相当大。
表观遗传学分析区分抗原特异性特征
ATAC-seq分析开放染色质景观是一种强大的工具，可以描述甚至是稀有的抗原特异性T细胞的表观遗传状态。我们对新鲜、FACS纯化的针对BMLF1、BRLF1或LMP2的EBV特异性CD8⁺ T细胞以及排序的经典CM（CD45RA– CCR7+）、EM（CD45RA– CCR7–）或TEMRA（CD45RA– CD28–）细胞群体进行了ATAC-seq分析。我们纳入了先前发表的ATAC-seq数据集中的幼稚CD8⁺ T细胞数据作为参考点。整体亚群的逐步分化与PC1增加相关，解释了50%的方差。裂解BMLF1特异性细胞显示出TEMRA样偏好，而潜伏LMP2特异性细胞显示出CM样聚集。尽管是裂解EBV抗原，BRLF1特异性细胞在PC1上分布广泛，表明其表观遗传命运更具可塑性和较少固定的细胞状态。基于ChromVar得分的K均值聚类以及差异峰的K均值聚类证实了BMLF1的表型优势为TEMRA和EM样，LMP2为CM样。再次，BRLF1特异性细胞谱最少约束，显示出CM样细胞以及TEMRA和EM样的特征。TF motif富集分析提示关键TF协同作用促进各K均值聚类中的T细胞分化状态和特征。对于每个聚类，我们识别出与附近启动子和基因内峰对应的基因，并确定了它们的潜在生物学贡献。簇1的峰在针对裂解EBV抗原BMLF1和BRLF1的T细胞中共有；其相关基因的功能属性包括细胞毒性、细胞因子信号传导和TCR信号传导以及NK细胞样和先天免疫特征。
不同的分化和老化特征
为了研究记忆T细胞老化同时考虑抗原特异性和异质性，我们首先比较了年轻成人（<40岁）和老年成人（>65岁）中EBV特异性CD8⁺ T细胞的表型适应性，采用四聚体染色和多重光谱流式细胞术。正如预期，随着年龄的增长，整体CD8⁺ T细胞群体中的幼稚和干细胞样记忆细胞显著减少，而终末分化的TEMRA细胞积累。与之前描述一致，没有一个EBV特异性T细胞群体在总体频率上有显著变化。有趣的是，只有部分抗原特异性T细胞，尤其是针对潜伏EBNA3C的细胞，改变了其表型。无偏倚的参考映射显示，潜伏EBNA3C特异性T细胞在老年阶段获得了TEMRA群体，而潜伏LMP2特异性T细胞在各个年龄段基本上保持了其主要的EM表型。裂解BMLF1和BRLF1特异性细胞在年轻和老年成人中始终保持较高分化和TEMRA样。统计分析通过比较每个抗原特异性在年轻和老年样本中的概率向量，仅针对EBNA3C达到显著性。有针对性的流式细胞术门控经典终末分化标记物、TFs和效应分子强调了潜伏EBNA3C特异性细胞中与年龄相关的终末分化特征的获得。
BEAM-T捕捉抗原特异性细胞的异质性
为了全面且无偏倚地了解抗原特异性T细胞的老化轨迹，我们对7名年轻成人（<40岁）和7名老年成人（>65岁）的CD8⁺ T细胞进行了单细胞测序，涵盖了4种模式。我们利用了一种新方法，条形码启用的抗原映射T细胞（BEAM-T），以捕获抗原特异性数据以及无偏倚的基因表达数据、表面蛋白质组染色和TCR序列。对于每个HLA-A*02:01阳性的个体，我们扩展了分析范围，收集了针对4种裂解EBV抗原（BMLF1、BRLF1、BMRF1、BALF1）、4种潜伏EBV抗原（LMP1、LMP2、EBNA1、EBNA3C）和2种来自相关水痘-带状疱疹病毒（VZV；IE62、IE63）抗原的BEAM-T阳性T细胞。CD8⁺整体T细胞群体用于对比。我们获得了29,304个通过质量控制标准的抗原特异性T细胞数据。BALF1和IE63产生的细胞太少，无法进行下游分析。抗原特异性T细胞被分为17个集群，代表8个广泛的经典T细胞亚群，并包括具有NKT样和MAIT表型的罕见T细胞类型。我们发现了针对5种EBV抗原的先前已知TCR CDR3序列，支持我们方法的有效性和潜力。
记忆T细胞受体多样性在老化过程中得以保持
老化减少了CD8⁺ T细胞区室的T细胞多样性，主要是由于幼稚或干细胞样表型CD8⁺ T细胞的丧失，同时增加了克隆性。与整体T细胞中的这一观察结果一致，年轻成人中存在的抗原特异性T细胞的干细胞样区室在老化过程中基本丧失，导致多样性的收缩。相比之下，对于大多数特异性，表达记忆标记的抗原特异性T细胞的TCR多样性在老化过程中基本保持不变。根据Gini指数测定的克隆性在6种被评估的抗原特异性群体中的2种（EBNA1、VZV-IE62）中增加，而在其他抗原中保持不变甚至减少。同样，大T细胞克隆的比例仅在相同的2种特异性中增加。为了更直观地说明T细胞多样性，我们绘制了按克隆大小排名的克隆数与它们占据的累积空间的关系图。在针对VZV-IE62、EBNA1和EBNA3C的反应中，随着年龄的增长，占据给定空间的克隆数减少，即克隆性增加。相反，在BMLF1、BRLF1和LMP1抗原中观察到库的多样化，可能表明干细胞样细胞在整个成人寿命期间被招募到记忆T细胞库中。总的来说，老化耗尽了抗原特异性干细胞样细胞的来源，而抗原特异性记忆细胞的库多样性没有太多变化或甚至有所增加，这取决于抗原。
转录特征区分T细胞老化轨迹
最后，我们调查了影响抗原特异性T细胞表型多样性和老化轨迹的因素。考虑到下游TCR信号强度可以塑造T细胞分化和功能性，我们探索了TCR和TCR亲和力的贡献。TCR V段使用在每种抗原特异性中高度多样，年龄相关变化较小。TCRβ CDR3区域中的motif富集识别出了抗原特异性T细胞群体内的共享motif，但这些motif通常只存在于一小部分克隆中，并且往往在年轻和老年个体之间共享。为了测试相同的TCR是否驱动相同的T细胞表型，我们识别了在我们的数据集中两个独立个体中具有相同TCR氨基酸序列的克隆。我们识别了14个这样的克隆，并将其投影到UMAP上以评估其表型。相同的克隆显示出偏好的T细胞表型，具有相似但非完全相同的特征。在年轻和老年个体之间共享的相同克隆中观察到最显著的差异，表明年龄相关变化独立于TCR序列促成表型转移。考虑到单个克隆可以获得一系列表型，我们对每个抗原的T细胞亚群进行了TCR克隆型追踪。实际上，所有被评估的抗原特异性T细胞群体都包括跨越多个T细胞亚群的克隆，这表明即使具有相同的TCR序列也会出现表型多样化，与单一幼稚T细胞可以生成多种表型状态的报告一致。
老化导致未分化抗原特异性T细胞储备的丧失
接下来，我们在考虑三个层次的情况下探讨了老化轨迹：表型、转录组谱和克隆多样性。最显著的年龄相关表型变化是干细胞样区室的丧失，包括大多数抗原特异性T细胞中的假定幼稚和干细胞样记忆细胞。基于子集频率的PCA清楚地分离了年轻和老年样本。专注于仅记忆T细胞区室的PCA显示了与抗原相关的分化状态变化。具体而言，那些在年轻成人中低TEMRA贡献的潜伏抗原特异性T细胞群体（尤其是EBNA1和EBNA3C），在老年阶段积累了这种终末分化的细胞类型，导致显著不同的概率向量。裂解EBV特异性记忆T细胞的表型比那些针对潜伏抗原的记忆T细胞更为稳定，BMRF1除外，因为它们通常是年轻成人中的MAIT样细胞，随着年龄的增长而丢失。潜伏LMP2特异性细胞是个例外，因为它们在其整个生命周期中惊人地保持了表型状态。
(全文结束)
