由于 3D 类器官能够更好地代表生物学相关的组织架构、微环境和功能，其在疾病建模和药物发现中的应用越来越普遍。然而，3D 模型的复杂性可能是其在药物筛选和研究中更广泛应用的潜在障碍。
Molecular Devices LLC 旨在通过将自动化应用于劳动密集型的手动方案来克服这些障碍。因此，该公司为整个 3D 培养工作流程建立了自动化方案，并提高了类器官检测的准确性和通量。
这些自动化方法采用了一个集成的工作单元，促进了自动化的细胞接种、培养基交换、培养监测和高内涵成像。它们还促进了细胞染色、终点检测和化合物添加的自动化。
因此，自动化可以应用于两种最广泛使用的类器官工作流程：一是在基质（如基质胶）中培养的类器官，包括原代 iPSC 或组织来源的结直肠或肠道类器官；二是通过使用 U 形 ULA 实验室器具进行无基质培养的类器官，用于球体和患者来源的乳腺癌肿瘤类器官。
过程和自动化的好处
整合了几种仪器使类器官检测的工作流程自动化。这促进了 3D 细胞模型的类器官自动化培养、化合物处理、维护和终点检测。这种方法有助于 3D 生物学中复杂检测的自动化和规模扩大，也可用于疾病建模和化合物筛选。
材料和方法
细胞培养
生成 PDX 类器官（PDXO）和肿瘤类器官的过程此前已经建立（Matossian 等人，2021 年）。原发性肿瘤样本被植入 SCID/Beige 小鼠，并表现出快速的肿瘤生长，14 天达到最大肿瘤体积> 1000 mm³。
随后从该样本生成能够在 2D 培养中扩增的细胞系。肿瘤类器官由在 2D 中扩增的 4IC 细胞形成，将约 2000 个细胞/孔（在 U 形低贴附 384 孔板，Corning）分配，然后孵育 48 小时，直到形成紧密的肿瘤类器官。
这些 4IC 细胞在添加了 2 mM 谷氨酰胺、NEAA、葡萄糖和 120 µg/L 胰岛素、10％FBS（Gibco 12491-015）的 Advanced DMEM 中培养。
对于代谢检测，肿瘤类器官在含有 10％透析血清（2 mM 谷氨酰胺、5 mM 葡萄糖，不含酚红）的 DMEM 中培养。
3D 肠道类器官来源于原代小鼠肠道细胞或人 iPSCs（STEMCELL Technologies）。然后根据 STEMCELL Technologies 的方案对这些细胞进行培养和分化。
使用 IntestiCult™ 类器官生长培养基（STEMCELL Technologies）进行细胞培养。将细胞接种在 50％生长因子减少的基质胶（Corning）圆顶中，以 24 孔板形式培养。每隔一天提供新鲜培养基，培养 7 至 10 天。随后，肠道类器官进行传代 - 解离并重新接种到新鲜的基质胶圆顶中。
需要注意的是，该项目是在 HuB 研究所的许可下进行的。
细胞监测和成像
使用 MetaXpress 高内涵图像分析软件，利用 ImageXpress 共聚焦 HT.ai 高内涵成像系统（Molecular Devices）获得了透射光（TL）的荧光图像。
使用仪器的共聚焦模式，用 10X 或 20X 物镜在 TL 中获得肿瘤类器官图像，偏移约 60 µm。使用 IN Carta™ 或 MetaXpress 图像分析软件进行分析。
细胞培养和成像方案的自动化
类器官的自动化成像和分析对于定量评估类器官的表型变化以及提高测试和实验通量至关重要。
构建自动化、集成系统实现了监测和维护的自动化，类器官和干细胞生长和分化的表征，以及一系列化合物效果的测试。
自动化系统的特点包括 ImageXpress 共聚焦 HT.ai 系统和分析软件、Biomek i7 或 Hamilton 液体处理器、自动 CO2 培养箱、协作机器人和轨道。通过使用 Green Button Go Scheduler 实现了机器人自动化。
结果
在基质胶中自动化培养 3D 类器官
在基质胶或其他基质中培养 3D 类器官涉及一系列过程：
- 将原代或 iPSC 衍生的细胞与 Martigel 混合接种到“圆顶”中。
- 每隔一天进行培养基交换培养 8 至 10 天。通过透射光的自动化成像监测类器官的生长和成熟。
- 圆顶重悬后收获类器官，并通过酶处理或机械重复移液进行分解。
- 离心纯化的细胞沉淀与基质胶混合，然后重新接种到新板中。
- 自动化液体处理系统促进了在基质胶液滴中自动化接种结直肠、肠道或其他细胞到各种格式的板中。
- 然后进行自动化的培养基交换、传代和化合物添加。
监测 3D 类器官的发育和高内涵成像检测
通过使用透射光的自动化成像监测发育中的类器官。InCarta SW 首先用于找到类器官，然后定义其大小和复杂性。
在基质胶中生长的类器官自组织并形成复杂的结构、隐窝和腔。基于机器学习的图像分析有助于测量类器官的大小、密度和直径，并通过计数隐窝或腔来表征其复杂性。
对于终点测量，对类器官进行生存能力标记或分化的染色。共聚焦成像和图像分析的自动化促进了 3D 中类器官结构的复杂表型评估。
类器官表型通过数量、大小分布、细胞生存能力、每个类器官的细胞含量、类器官复杂性（腔或隐窝的数量）以及线粒体、细胞核和细胞骨架来表征。
培养和成像 3D 肿瘤类器官
3D 球体或肿瘤类器官的无基质培养通常包括允许在 U 形低贴附板中形成球体的步骤。通过自动化化合物添加和液体交换，可以处理未贴附的微组织培养物，而不会在处理过程中丢失或破坏它们。
3D 肿瘤类器官培养从原发性三阴性肿瘤开始，而细胞系通过在 SCID 小鼠中传代原发性组织，然后适应 2D 细胞培养而开发。
在 384 孔低贴附板中培养 2000 个细胞 48 小时形成肿瘤类器官。用来自 NCI（国家癌症研究所）批准的抗癌药物库的化合物处理这些肿瘤类器官。
使用五种浓度进行测试，并在化合物稀释、细胞处理和染色中使用 Biomek 自动化。随后通过自动化成像每天对肿瘤类器官进行培养和监测。
细胞培养、化合物处理和成像的自动化
对于终点检测，用 Hoechst、Calcein AM 和 EtHD 的组合对细胞进行染色。使用 Custom Module Editor 进行复杂的表型分析。通过基于 AI 的图像分析自动检测和表征肿瘤类器官的表型、大小和密度。
结论
通过整合几种仪器实现了类器官检测和化合物处理的自动化。这些仪器促进了 3D 细胞模型的细胞培养、维护和化合物处理的自动化。该过程可用于 3D 生物学的自动化和化合物筛选。
结合共聚焦成像技术和 3D 分析，可以对类器官的细胞内容进行复杂、定量的分析，以及对不同表型的细胞进行计数和测量。
这些方法可用于评估测试化合物和疾病建模引起的表型变化。
致谢
由 Molecular Devices LLC 的 Oksana Sirenko、Zhisong Tong、Krishna Macha 和 Angeline Lim 最初创作的材料制作。
关于 Molecular Devices UK Ltd
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最后更新：2024 年 9 月 24 日上午 5:05
