摘要
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其能产生乙醇、醋酸等多种产品而长期作为工业面包酵母使用。有趣的是，这种酵母也是研究真核细胞中包括衰老、自噬、线粒体反应等生物机制的重要工具。由于其实验操作简便、工作流程快速以及拥有广泛的遗传突变文库，酿酒酵母已成为一个强大的化学和遗传筛选平台。热量限制（CR）即减少营养摄入，可通过多种途径促进酵母长寿，如抑制营养感应靶标雷帕霉素（TOR）、丝氨酸-苏氨酸激酶（SCH9）、蛋白腺苷酸环化酶（AC）、蛋白激酶A（PKA）和Ras，减少乙醇、乙酸和凋亡过程。此外，CR还诱导抗氧化蛋白、沉默信息调节因子2（Sir2）、自噬和线粒体酵母适应性反应的表达。已开发出三种方法——点样测试、时序寿命（CLS）和复制寿命（RLS）测定——用于研究酿酒酵母中的衰老。本文介绍了酵母中抗衰老药物筛选的策略，讨论了常见陷阱，并总结了使用酵母进行药物发现的研究。
关键词：酿酒酵母、抗衰老、热量限制、点样测试、时序寿命、复制寿命
作者信息
苏迪亚尼·亚尼*、穆罕默德·埃卡·普拉斯塔亚、罗尼·玛丽亚娜、埃卡·特里瓦尤尼、穆里安托
*印度尼西亚科学院化学研究中心，南唐格朗塞尔蓬，万丹省，印度尼西亚
*通讯地址：sudiyani@gmail.com
1. 引言
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种通过出芽进行无性繁殖的单细胞真核真菌。这种酵母细胞个体大小为5-10微米，表面生长的菌落呈奶油色（图1）。从分类学上讲，酿酒酵母属于子囊菌门、酵母纲、酵母科和酵母属。酿酒酵母在有氧条件下通过有氧呼吸分解培养基中的葡萄糖。如果缺氧，酵母则会进行无氧发酵。这种酵母广泛分布于自然环境中，包括土壤、水、植物、动物和昆虫中。值得注意的是，酿酒酵母是含有细胞核、线粒体、内质网、液泡、高尔基体、细胞骨架等所有主要细胞器的真核细胞，这些细胞器在动物细胞中也很常见。
科学家指出，酿酒酵母是1996年首个完成全基因组测序的真核生物。事实上，酿酒酵母的染色体紧凑地组织在16条染色体上，基因组约有12,156,677个碱基对，包含6,275个基因，其中约5,800个被认为是功能性基因。有趣的是，据估计这种酵母至少有31%的基因与人类同源。单倍体细胞必须交配才能回到二倍体状态。单倍体和二倍体阶段在形态上相似，但二倍体细胞较大。在无性繁殖中，芽体生长到与母细胞相当的大小，同时发生核分裂。当细胞核传递给较小的女儿细胞后，分离过程完成。酿酒酵母在食品加工领域有着悠久的使用历史，作为面包的发酵剂和葡萄酒及酒精饮料的发酵剂，同时也作为维生素补充剂，因为它含有50%的蛋白质，是烟酸、叶酸和B族维生素的丰富来源。此外，酿酒酵母也被明确指出是进行生物学研究的最理想真核细胞。酵母遗传学的惊人力量已成为传奇工具，令那些研究更高等真核生物的人羡慕不已。
衰老是细胞、分子和器官损伤累积的多方面过程，导致功能丧失和疾病易感性增加，最终导致死亡。事实上，影响衰老的细胞和分子通路与那些与神经退行性疾病、癌症、代谢综合征和心血管疾病相关的通路有着深刻的重叠。因此，最近的研究努力集中在识别能够减缓衰老过程的化合物上，这些化合物可能作为预防措施，共同改善与年龄相关的疾病。事实上，哺乳动物细胞中的衰老研究受到常见模式生物寿命长的限制。大鼠和小鼠寿命为3-5年，灵长类动物可达40年。尽管如此，特别是在啮齿动物中的衰老研究已经非常有价值，有助于了解调节长寿的遗传因素。另一种显著加速衰老研究的方法是使用无脊椎动物模式生物，它们衰老更快，更容易进行环境和遗传操作。尽管已经研究了各种生物，但大多数研究使用了线虫（Caenorhabditis elegans）、果蝇（Drosophila melanogaster）或酵母（Saccharomyces cerevisiae）。使用模式生物至少部分是由于它们在所有这些生物中保守的一些通路，以及在细胞或分子事件中的相似性。最流行的保守通路之一是营养感应通路，即雷帕霉素靶标（TOR），它存在于从酵母到哺乳动物的所有模式生物中。
酿酒酵母作为生物体和细胞衰老的模型已经服务了50多年。在这种特定酵母中，许多与人类衰老和疾病相关的通路都得到了很好的保守，包括营养信号传导、DNA修复机制、细胞周期调控、蛋白质折叠、脂质稳态、线粒体稳态、应激反应、分泌、蛋白质稳态和受调控的细胞死亡。此外，细胞衰老的分子机制也从酿酒酵母保守到人类，主要是在培养基中营养耗尽的特定条件下，这会延缓衰老并延长寿命。保守的蛋白激酶TORC1（雷帕霉素靶标复合物1）由营养物质和胰岛素激活，是真核生物寿命的关键调节因子。TORC1抑制剂雷帕霉素减缓衰老并延长从酵母到哺乳动物的各种物种的寿命。此外，这种酵母具有快速、简单、低成本和良好的可重复性等优势。此外，基因组DNA不复杂且与哺乳动物具有高度同源性。事实上，所有DNA序列都已知，分子机制研究处理相对容易进行。最近的一些研究报道了利用酿酒酵母作为有希望的模式生物来揭示来自各种来源的化合物的抗衰老机制。Carmona-Gutierrez等人展示了黄酮类化合物4,4-二甲氧基查尔酮在酿酒酵母中通过促进自噬机制表现出抗衰老活性。Lin等人报告了葫芦素B通过调节酿酒酵母中的自噬和氧化应激表现出抗衰老活性。此外，Sudharsan等人还成功地通过减少氧化应激和凋亡机制，揭示了虾青素在这种酵母中的抗衰老机制。
在这简短的一章中，我们讨论了酿酒酵母作为药物发现研究中的模式生物的利用，以及这种简单的真核生物如何不仅被用作生产工具（由于其能够生产葡萄酒、酒精饮料和蛋白质等产品），而且还被用作理解生物衰老的宝贵工具。事实上，酿酒酵母作为制药发现研究的主力军有着悠久的历史。本章中解释的酵母用途包括属于促衰老或抗衰老机制的酵母衰老的主要途径，以及通过先前研究人员已经使用的方法来阐明抗衰老化合物的部分。为此，我们要指出，在我国印度尼西亚，关于使用酵母作为模型生物来阐明抗衰老化合物的抗衰老研究或评论仍然有限。同时，该国拥有丰富的来自陆地到水生区域的药用化合物来源。因此，我们希望本章能够为专注于发现具有抗衰老特性的活性化合物的制药研究提供新的替代见解。
2. 酿酒酵母中的衰老干预机制
酿酒酵母中的生物衰老涉及复杂的机制，包括细胞、生理和分子机制，以及受生长环境条件的影响。有趣的是，几乎所有酵母模型，特别是酿酒酵母，在热量限制（CR）条件下都表现出复杂的反应，科学家们经常利用这种现象来学习酵母模型中的衰老通路。热量限制（CR），即在不营养不良的情况下减少营养可用性，已知可以延长从酵母到灵长类动物等多种生物的寿命。值得注意的是，已经投入了大量努力来理解介导饮食限制益处的通路，因为针对这些通路的干预可能对人类对抗衰老相关疾病有效。在酵母抗衰老测定中，饮食限制通常通过将生长培养基中的葡萄糖浓度从2%降低到0.5%或0.05%来实现，氨基酸限制也被报道可以延长寿命。
最终，CR据报道可以影响酵母细胞中的某些独特通路。第一条通路是营养感应通路，由于CR条件，减少两个主要营养感应通路的活性可以延长酵母寿命。这两个营养感应通路都集中在氨基酸感应通路上，包括丝氨酸-苏氨酸激酶SCH9和雷帕霉素靶标（TOR）。值得注意的是，SCH9和TOR的缺失或抑制可使酵母寿命增加几倍。CR条件下减少营养和蛋白质合成的改变与通过降低TOR/SCH9延长酵母寿命密切相关。通过降低TOR通路活性延长酵母寿命取决于转录因子Gis1，它激活包括Mn-SOD在内的许多保护系统。
进一步，第二条通路包括三种蛋白：腺苷酸环化酶（AC）、蛋白激酶A（PKA）和Ras，它们在CR条件下被抑制。降低Ras-AC-PKA信号传导对酵母寿命延长的影响需要激活两个控制细胞保护系统的转录因子（Msn2和Msn4）。通过这些通路延长酵母寿命需要抗氧化酶Mn-SOD（超氧化物歧化酶），它可以清除超氧化物自由基。有趣的是，酵母衰老过程中超氧化物水平增加，在Tor-SCH9或Ras-AC-PKA信号传导缺陷的酵母突变体中降低。当酵母细胞在高葡萄糖培养基中生长时，可以产生乙醇或乙酸，这也促进时序衰老。有趣的是，SCH9或TOR1的缺失促进培养基中乙醇和乙酸的去除以及甘油的积累，并通过类似于饮食限制的机制进一步延长时序寿命。更重要的是，Tor-SCH9和Ras-AC-PKA通路信号降低对葡萄糖限制很重要，以及Msn2和Msn4转录活性增加，从而影响Pnc1[烟酰胺脱氨酶，促进烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性脱乙酰酶沉默信息调节因子2/Sir2]的表达。Sir2已被广泛研究，因为它在包括哺乳动物在内的各种生物中作为抗衰老的保守调节因子的潜在作用。Sir2活性促进酵母长寿的一种机制是通过抑制rDNA中的同源重组，这可以促进细胞外染色体rDNA环（ERCs）的形成。事实上，一般认为rDNA不稳定是导致衰老和细胞死亡的主要缺陷。
值得注意的是，另一个与酵母衰老密切相关的关键机制是自噬。据报道，这种细胞过程在从酵母到人类的生物体中高度保守，涉及受损细胞器、氨基酸、蛋白质和其他代谢物的降解。它还通过抑制CR条件下酵母的细胞分裂来调节基因组完整性。值得注意的是，自噬基因表达减少或功能障碍导致酵母和果蝇寿命缩短。相反，增强的自噬促进衰老模型中的长寿，并被认为可以保护免受衰老和年龄相关疾病。
另一个与酵母衰老密切相关的机制是线粒体适应性反应信号。线粒体细胞器在衰老和年龄相关疾病中具有基本作用。该细胞器有助于ATP产生、细胞稳态，以及不平衡的活性氧（ROS）创造细胞调节的基本作用。通常，线粒体作为呼吸过程的副产品产生有毒的ROS。然而，在CR条件下，由于从发酵到呼吸（CR）的代谢过程转变，线粒体会更加活跃，从而在初始生长阶段也产生ROS。因此，酵母细胞将从早期生长阶段开始适应（预先适应）ROS分子，从而可能在生长后期阶段激活防御机制，确保对更高剂量的ROS的保护。这些防御机制可能激活抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶，从而增加酵母寿命（图2）。
除了上述与CR条件相关的机制导致酵母寿命延长外，CR还据报道对酵母细胞有其他实质性影响，如加速衰老过程的凋亡过程、修复蛋白质损伤、NAD+稳态、液泡功能、基因组稳定性、核糖体生物发生、蛋白水解调节和细胞肥大。这些宝贵的见解表明，酵母细胞中的CR条件可以调节生物衰老机制中受影响的多种通路。作为前沿抗衰老方法策略，通常将酵母细胞在CR条件下生长用作阳性对照，而在含2%葡萄糖的正常生长培养基中生长的酵母细胞用作抗衰老化合物筛选的处理。如果化合物处理衍生的酵母细胞活力与阳性对照相似或更高，则表明相应化合物在酵母细胞中具有抗衰老活性。进一步的研究通常应用于调查这些有前景的抗衰老化合物在酵母细胞内调节的精确机制。
3. 研究酿酒酵母中抗衰老活性的方法
根据当前文献，已经建立了各种潜在方法，通过使用酿酒酵母作为模式生物来研究化学化合物衍生的抗衰老活性。包括点样测试、使用总平板计数（TPC）分析的时序寿命（CLS）、使用显微镜观察的复制寿命（RLS）测定、碘化丙啶-流式细胞术分析（PI-FCA）分析、Bac-light方法、亚甲蓝或品红B染色、生理测定以及高通量快速时序寿命（HTRCL）基于MTT测定。然而，在本节中，我们将重点介绍三种最常用的方法：点样测试、CLS和RLS分析。
3.1 点样测试
这种方法通常用于通过固体生长培养基表面上的表型点样形状来观察酿酒酵母细胞的活力。事实上，这种方法不仅应用于酿酒酵母，还用于其他酵母来测定化合物的抗衰老活性，包括裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、白色念珠菌（Candida albicans）和新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）。此外，微生物学家经常利用这种方法寻找对固体培养基中特定条件（如氧化应激、抗生素耐药性、热、渗透压、营养限制等）敏感的特定微生物突变体。
简而言之，点样测试是通过将新鲜对数期酿酒酵母细胞接种到试管中的酵母液体培养基中，初始OD600为0.05-0.1。随后，将相应化合物以一定浓度添加到相同的酵母液体培养基中，并将培养物在最佳生长温度下培养至稳定期（20-25天）。定期（通常在第5、10、15和20天）将酵母处理培养物点样到酵母固体培养基上。点样测试最初是通过在选定的培养时间对处理培养物进行连续稀释，直到10^-4稀释值，然后将每个稀释液点样到酵母固体培养基上。随后，将结果在最佳生长温度下培养3天后进行观察。每个点上生长细胞的密度被视为酿酒酵母细胞的活力（图3）。
据报道，点样测试在测定抗衰老化合物方面具有一些优势，包括简单、快速处理和相对低成本，与CLS或其他方法相比。然而，这种方法只能通过酵母细胞密度代表酵母细胞活力的定性结果，因此应由其他方法支持。对于大量化合物作为抗衰老的初步筛选，建议使用点样法。一些先前的研究报道了点样测试用于检查特定化合物在酿酒酵母中延迟衰老的有效性。Xiang等人成功地使用根皮苷（一种苹果多酚）处理在这种酵母中促进抗衰老机制。苹果提取物、青蒿素和玫瑰茄花瓣提取物也报道称可以使用点样测试方法增加酿酒酵母寿命。同时，酿酒酵母成功用于获得丁香花蕾提取物和一些药用植物提取物的抗衰老活性。
3.2 使用TPC分析的CLS方法
时序寿命（CLS）定义为非分裂细胞维持活力的时间长度，指其在长时间静止后重新进入细胞周期过程的能力。因此，CLS已被展示为后有丝分裂酵母细胞活力的模型。传统上，CLS通过将新鲜对数期酵母细胞培养在特定烧瓶中，直到在液体培养中达到稳定期（20-25天），初始OD600为0.05-0.1。化合物处理在酵母接种后不久应用于液体培养基。随后，酵母细胞存活率通过在定期时间（即每3天）稀释并在营养丰富的琼脂培养基上涂布来测量。随后，存活率根据营养平板琼脂上出现的菌落数量（菌落形成单位:CFUs）计算。据报道，酿酒酵母在培养20-25天后进入稳定/死亡阶段。因此，如果化合物处理可以将酵母寿命延长超过25天，则被认为是潜在的抗衰老材料。值得注意的是，CLS测定不仅广泛应用于酿酒酵母，还应用于其他酵母，如裂殖酵母或乳酸克鲁维酵母，用于观察潜在抗衰老化合物的生物活性（图4）。
最终，CLS方法需要相对大量的材料、研究人员时间和属于劳动密集型，因此不适合高通量筛选抗衰老化合物。然而，通过这种方法，可以获得定量结果，从而可以深入洞察酵母细胞活力的代表。许多研究已应用CLS方法测定来自多资源的抗衰老化合物，如Nakaya等人测定了从蘑菇中分离的棒束孢菌素I，或Sunthonkun等人检查了有色米的抗衰老作用。此外，二甲基查尔酮、葫芦素B和虾青素通过CLS分析在酿酒酵母中表现出抗衰老活性。
3.3 RLS方法
RLS测定在概念上很简单，并显示了酿酒酵母细胞通过不对称出芽分裂的优势，产生的子细胞比其衍生的母细胞小。子细胞在固体生长培养基上分离，一旦它们开始分裂，所有子细胞都被移除。Longo（2012）发现，单个细胞不会永远分裂，而是在有限次数的细胞分裂（约20-25次）后停止，随后进入短暂的复制后状态，然后细胞死亡。RLS方法确定单个母细胞在衰老前可以无性产生的子代数量。酿酒酵母细胞中母子细胞的不对称性可以在光学显微镜下轻松观察到，从而允许开发RLS测定。
对于RLS测定，将酿酒酵母细胞接种到5mL半乳糖或葡萄糖液体培养基中，并在最佳温度下在摇床培养箱中进一步培养48小时。随后，将1mL酵母细胞培养物离心，沉淀用蒸馏水或磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。使用血球计数板计数后，将4000-5000个细胞铺在含有需要测定抗衰老活性的化学化合物的琼脂平板培养基上，并将平板在最佳温度下进一步培养2天。在琼脂平板上形成的40个微菌落随机在显微镜下观察，子细胞数量被计数。最近，酿酒酵母细胞被报道为RLS分析最强大的模式生物。RLS测定的结果通常显示在特定图表中，指示酵母细胞每一代的活力数量。如果化合物处理后酵母细胞的活力高于对照处理，则表明具有潜在的抗衰老特性。
据报道，RLS方法有一些主要缺点，使其对高通量方法效果较差。它包括耗时、劳动密集且技术相对复杂，因为在测定过程中需要在平板培养基之前进行显微镜细胞观察。尽管如此，这种方法将提供精确的定量结果，从而可以表示对照和抗衰老化合物处理之间酵母细胞世代的数量。迄今为止，一些先前的研究报道使用酿酒酵母RLS方法来检测来自各种天然产物的抗衰老化合物，包括从蘑菇中分离的灵芝苷，或来自柑橘的橙皮苷。当前的研究还报告了使用酿酒酵母RLS方法对抗一些化合物如天麻素和葫芦素B的抗衰老测定。
4. 结论
酵母中的抗衰老研究在CR条件下很受欢迎，CR有多种反应来延长酵母寿命。CR中的衰老通路属于促衰老和抗衰老通路。促衰老包括TOR、SCH9、Ras蛋白、AC、PKA、乙醇积累和凋亡过程。另一方面，抗衰老通路包括抗氧化酶、沉默信息调节因子2、自噬和通过线粒体适应性ROS信号的适应性反应的诱导。CR条件通常用作阳性对照，而非CR/高2%葡萄糖培养基中进行处理。有多种抗衰老研究方法，其中最流行的是点样测试、CLS和RLS测定。
最近，酿酒酵母中的抗衰老研究已经发展得更加复杂，来自先前来源，包括来自陆地或水生生物的天然化合物。事实上，其他来源也可能有潜力开发，如半合成或合成化合物，作为抗衰老化合物的初步筛选。
尽管研究数据可以重新审视和挖掘潜在的生物活性物质，但从酵母获得的数据不应过度解释，当旨在应用于人类时，应在多细胞生物中验证化合物。到目前为止，酵母揭示针对衰老的新型药理学干预的潜力是深远的，然而它将继续不仅对药物发现，而且对其他领域如发酵食品、生化和生物能源生产做出重大贡献。
致谢
作者感谢印度尼西亚IPB大学生物学系Rika Indri Astuti博士允许使用图片。
利益冲突
我们代表所有作者声明无利益冲突。
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