老化的特征是出现具有类淀粉样行为的蛋白质积累。然而，这些蛋白质产生的分子机制尚不清楚。在此，我们证明在包括干细胞、脑类器官和完全分化的神经元等多种人类细胞类型中，信使 RNA 分子中的错误会产生类淀粉样蛋白。其中一些错误会产生已知可导致疾病的突变蛋白，而另一些则产生以前未观察到的蛋白质。此外，我们表明当细胞暴露于 DNA 损伤时，这些错误会增加，这是人类衰老的一个主要标志。综合来看，这些实验表明了正常衰老过程与年龄相关疾病之间存在机制联系。
尽管长期以来一直怀疑转录错误在这些结构的形成中起作用，但由于与错误检测相关的技术限制，很难验证这一假设。为解决此问题，我们最近优化了一种称为圆环测序的 RNA 测序工具，它能够对 mRNA 分子进行高保真测序。在此，我们使用圆环测序证明转录错误在人类细胞中普遍存在，并且确实导致具有类淀粉样和朊病毒样特性的蛋白质。我们通过各种细胞、生化和生物物理实验支持了这些观察结果，这些实验表明这些错误产生的蛋白质能够成功地将野生型蛋白质转化为类淀粉样状态，然后自我组装成具有各种结构的蛋白质聚集体。最后，我们表明由于 DNA 损伤，导致启动大规模蛋白质聚集所需的突变蛋白数量通常会超过阈值，这是衰老细胞的普遍标志。因此，我们的实验在 DNA 损伤和蛋白质聚集这两个与人类衰老和年龄相关疾病（包括阿尔茨海默病）相关的主要标志之间建立了合理的机制联系。通过这样做，我们的观察为诱变在人类衰老和疾病中的作用提供了新的见解，并提出了类淀粉样和朊病毒样疾病发展的合理机制。
结果：
- 转录错误在人类细胞中普遍存在
为了测试转录错误是否产生类淀粉样或朊病毒样蛋白，我们使用大规模平行测序方法 circ-seq 检测了人类胚胎干细胞（H1 ESCs）、脑类器官、神经元和成纤维细胞的转录组。脑类器官和神经元由 H1 ESCs 直接生成，因此这些模型之间的遗传背景保持一致，结果可以相互比较。此外，我们对 H1 ESCs 进行了 300 倍覆盖度的测序，以生成定制的参考基因组，并确保排除单核苷酸多态性或低水平突变。总之，这些测序工作在所有三种模型中产生了超过 160,000 个影响超过 11,000 个基因的转录错误。每个模型显示出相似的错误率和频谱，表明转录错误率在很大程度上与细胞命运、增殖率和分化状态无关。不过，我们确实观察到 H1 ESCs 细胞中 A→G 错误明显增加，这反映了 A 到 I RNA 编辑对转录组的影响。
- 转录错误产生与疾病相关的蛋白质
然后，我们使用两种方法来确定这些错误是否导致类淀粉样或类淀粉样蛋白：基于文献的方法和生物信息学方法。在基于文献的方法中，我们关注了 70 种直接与各种类淀粉样和类淀粉样疾病有关的蛋白质，包括 PRNP（克雅氏病和格斯特曼 - 施特劳斯勒 - 谢克尔综合征）、APP（阿尔茨海默病）、SOD1、FUS（肌萎缩侧索硬化症）和 TTR（转甲状腺素蛋白淀粉样变性）。在过去的 30 年中，这些蛋白质中的数百个突变已被确定导致家族性蛋白质病病例。在大多数情况下，这些突变极大地增加了受影响蛋白质的类淀粉样和朊病毒样潜力。我们推断，如果转录错误产生相同的突变蛋白，它们也可能导致致病性蛋白质。为了识别这些错误，我们将检测到的错误与编目与蛋白质聚集疾病有关的种系突变的各种数据库（包括 Clinvar 和人类基因组突变数据库）进行交叉引用。在影响类淀粉样和类淀粉样蛋白的 1936 个错误中，我们确定了 38 个产生在临床上已见过的突变蛋白的错误。例如，我们检测到的两个错误产生了 SOD1 和 FUS 蛋白的突变版本，这两种蛋白在家族性肌萎缩侧索硬化症病例中均被鉴定，而另一个错误产生了导致格斯特曼 - 施特劳斯勒 - 谢克尔综合征的人类朊病毒蛋白（PRNPA133V）的突变版本。其他错误产生了 TTR（淀粉样变性转甲状腺素蛋白淀粉样变性）、CSTB（进行性肌阵挛性癫痫）、TGFBI（角膜营养不良）、APP（阿尔茨海默病）、CRYGD（珊瑚状白内障）、TP53（癌症）、Medin（自然衰老）等的病理版本。此外，我们确定了 75 个影响与疾病直接相关的关键氨基酸的错误，尽管这些错误将这些氨基酸突变为与临床不同的残基。例如，其中一个错误产生了 PRNP（PRNPV210A）的突变版本，与家族性克雅氏病相关的 PRNPV210I 突变非常相似（丙氨酸和异亮氨酸都是脂肪族氨基酸）。在编码 APP、CSTB、HNRNPA1（包含体肌病伴额颞叶痴呆）、TGFBI、TP53、TTR 和其他 10 种蛋白质的转录本中也存在类似的错误。这些错误中的很大一部分可能也会影响这些蛋白质的类淀粉样行为。
- 转录错误产生与疾病相关的类淀粉样蛋白
为了证实通过我们基于文献的方法确定的错误确实导致具有类淀粉样或类淀粉样行为的蛋白质，我们选择了两个候选者进行后续实验。其中一个错误产生了 SOD1（SOD1G142E）的突变版本，第二个错误产生了 FUS（FUSR521H）的突变版本。这些突变蛋白先前在家族性肌萎缩侧索硬化症病例中被鉴定。我们通过慢病毒转染在原代人成纤维细胞、HEK293 细胞和胶质母细胞瘤细胞中表达这些蛋白质，然后通过共聚焦显微镜对其进行成像。与转录错误产生显示类淀粉样行为的突变蛋白的观点一致，我们发现 SOD1G142E 和 FUSR521H 在所有三种细胞类型中均聚集，而野生型蛋白质则没有。此外，我们发现突变的 SOD1 和 FUS 蛋白定位错误。野生型 FUS 主要存在于细胞核中（在那里它有助于 RNA 剪接、基因表达和 DNA 修复），而突变蛋白被排除在细胞核外，并在整个细胞质中形成大的点状沉积物。类似地，SOD1 通常分布在细胞质和细胞核中，但我们发现 SOD1G142E 被排除在细胞核外，并在细胞质中形成大的蛋白质沉积物。重要的是，FUS 和 SOD1 的核排除和蛋白质聚集是与肌萎缩侧索硬化症相关的病理学的关键组成部分。当我们通过用来自 SOD1_G142E 模板的 mRNA 转染 3T3 细胞来模拟转录诱变时，我们观察到了相同的定位错误和聚集。这些 mRNA 产生的蛋白质聚集体至少在 7 天内（我们在该实验中的最新时间点）仍然可见，表明它们在合成后持续存在很长时间。最后，我们使用慢病毒转导在同一细胞中共表达野生型和突变型 SOD1 并监测它们的行为。我们发现当与 SOD1G142E 共表达时，野生型 SOD1 不再均匀分布在细胞中，而是被排除在细胞核外，并与 SOD1G142E 组装成相同的类淀粉样沉积物，这表明野生型 SOD1 被 SOD1G142E 招募并转化为类淀粉样状态。对于野生型和突变型 FUSR521H，我们也有类似的观察。野生型 FUS 在 FUSR521H 存在的情况下几乎总是被排除在细胞核外，并与 FUSR521H 一起隔离在细胞质沉积物中，尽管也有罕见的例外。与 SOD1G142E 具有类淀粉样特性的观点一致，透射电子显微镜表明突变型 SOD1 可以在体外形成类淀粉样纤维。综合来看，这些实验为转录错误产生类淀粉样蛋白的观点提供了重要的原理证明。此外，由于 RNAPII 在细胞内不断产生新的 mRNA 分子，并且 RNAPII 的转录相对容易出错（转录错误率约比突变率高 100 倍以上），我们得出结论，转录错误在人类细胞中产生了连续的类淀粉样和类淀粉样蛋白流。
- 转录错误产生未表征的类淀粉样蛋白
除了与疾病直接相关的蛋白质外，我们想知道转录错误是否也能产生其类淀粉样特性尚未表征的突变蛋白。为了测试这个假设，我们使用了一种无偏的生物信息学方法来分析错误对类淀粉样和类淀粉样蛋白的影响。首先，我们使用 AmyPred-FRL 分析影响类淀粉样和朊病毒样蛋白的错误，发现 457 个被预测会增加其类淀粉样潜力。其次，我们使用 PAPA 分析影响具有朊病毒样结构域的蛋白质的错误。尽管 PRNP 基因编码人类中的典型朊病毒蛋白，但现在已知许多蛋白质都含有朊病毒样结构域。这些结构域中的突变可以在包括蛋白毒性疾病在内的各种情况下增加这些蛋白质的朊病毒样行为。通过将此算法应用于我们的数据集，我们发现 393 个转录错误被预测会表现出增加的类淀粉样和朊病毒样行为。
接下来，我们从 Prionscan、PLAAC 和淀粉样蛋白数据库中提取信息，构建了一个有可能显示类淀粉样和朊病毒样特征的蛋白质的综合数据库。然后，我们将此数据库与我们检测到的转录错误进行交叉引用，以识别可能增强这些特征的错误。为了测试这些预测的准确性，我们更详细地检查了影响 TP53 蛋白的错误。TP53 是一种参与 DNA 修复、转录、细胞衰老和凋亡的重要肿瘤抑制蛋白，在 15％的人类癌症中聚集。使用上述生物信息学工具，我们确定了 5 个可能增加 TP53 淀粉样倾向的转录错误：TP53S149F、TP53G245S、TP53G279A、TP53S315F 和 TP53P318L。当我们将这些突变映射到 TP53 的晶体结构时，我们注意到 S149F 突变（图 3A）位于 TP53β夹心核心边缘的一个环（环 146-WVDSTPPPGTR-156）中。基于其位置和引入的结构变化（图 3B，C），我们预测该突变可能会增加局部肽序列（146-WVDSTPPPGTR-156 环）的类淀粉样倾向，并增强单独 TP53 单体的β夹心核心之间的相互作用，从而导致形成类淀粉样蛋白特有的扩展β片层结构。TTR 蛋白β夹心核心边缘环中的突变先前已被证明通过类似的基于结构的机制促进淀粉样形成。为了验证这一假设，我们在细菌细胞中表达了野生型和突变型 TP53（aa 92-292）的核心结构域，并通过透射电子显微镜分析了这些蛋白质的行为。与我们的预测一致，我们发现 TP53S149F 确实聚集为大的蛋白质沉积物，而野生型 TP53 则没有。这些聚集体在偏振光下显示刚果红双折射，这是淀粉样形成的有力指标。我们得出结论，除了直接与疾病相关的类淀粉样蛋白外，转录错误还可以产生具有类淀粉样行为的未表征的突变蛋白。
- 少量错误即可导致淀粉样形成
接下来，我们决定测试 TP53S149F 是否能像 SOD1G142E 和 FUSR521H 一样将野生型 TP53 转化为类淀粉样状态，如果可以，启动这一过程需要多少 TP53S149F。为了回答这个问题，我们向野生型 TP53 溶液中添加了极少量的 TP53S149F，通过透射电子显微镜发现 1％的 TP53S149F（v/v）足以启动野生型蛋白质的聚集（图 3H）。我们在动态光散射实验中证实了这些发现（图 3I-K），该实验表明野生型 TP53 的大小与 TP53 单体一致，而 TP53S149F 聚集成比其大 100 倍以上的沉积物。此外，当我们向野生型溶液中添加 2％（v/v）的 TP53S149F 时，我们观察到 TP53 聚集体不成比例地增加，这只能用突变型诱导的野生型蛋白质聚集来解释。最后，我们使用原子力显微镜（AFM）进一步表征野生型和突变型 TP53 之间的交叉播种行为。首先，我们通过超声和离心制备了 TP53S149F 聚集体的播种溶液（图 3L），其由多角形和螺旋形结构组成，通过多角度光散射（MALS）和 AFM 测定的平均粒径为 0.1μm。大小为 0.1μm 的颗粒大致相当于约 800-1000 个分子，这一数量可能由 1 个或几个突变转录本的翻译产生（图 3M）。然后，我们将这些颗粒以 2％v/v 的比例混入野生型 TP53 溶液（图 3N）中，并观察到野生型 TP53 纤维的显著种子依赖性生长（图 3O）。给予足够的孵育时间，突变型与野生型蛋白质 1:50 的混合物产生了肉眼可见的沉积物（图 3P）。考虑到这些聚集体的大小，这些沉积物几乎完全由野生型蛋白质构成，突变型蛋白质作为初始种子。
为了扩展这些观察结果并确保这种现象不是由诸如 AFM 样品制备（涉及在云母表面干燥样品）等人为因素引起的，我们开发了一种悬滴法来表征溶液中的播种过程（图 4A-C）。首先，我们制备了平均大小为 0.1μm 的从细菌中收获的 TP53S149F 颗粒的播种溶液，通过 MALS 和 AFM 测定（补充表 3）。然后，我们设置了一个 4×6 的筛选托盘，其中有一个 1ml 的含有蛋白质缓冲液和递增浓度的 NaCl（分别为 0.3、0.5、0.7、0.8、1.0、1.2M，对于第 1-6 列）的储存溶液。最后，我们将 10μl 的野生型 TP53 溶液（60μM）添加到硅化盖玻片上，并将 1μl 的不同浓度（从 A
