引言
疫苗接种的目标是通过产生高亲和力抗体来引发持久的保护性免疫。虽然抗体由B细胞产生，但其质量取决于被称为T滤泡辅助(T follicular helper, Tfh)细胞的特化CD4+ T细胞的帮助。这些Tfh细胞在周围淋巴器官（如淋巴结、扁桃体和脾脏）的生发中心(germinal centers, GCs)中与B细胞相互作用。在这些微环境中，B细胞增殖并分化为抗体分泌型浆母细胞(plasmablasts, PBs)和记忆细胞，共同提供持久的免疫力。尽管疫苗接种效果显著，但并非所有个体都能获得同等程度的保护，抗体反应存在显著的个体间差异。影响疫苗反应的最关键因素之一是衰老。与年轻人相比，老年人产生的抗体分泌B细胞较少，产生的疫苗特异性抗体数量也较少，这反映了免疫反应中的缺陷，但这些缺陷尚未被充分理解。
先前的研究主要基于小鼠模型，表明衰老对GC生物学的多个方面产生负面影响，损害了持久抗体反应的产生。与年轻小鼠相比，老年小鼠的GC-B细胞显示出类别转换重组和体细胞超突变受损，活化诱导的胞苷脱氨酶驱动程序减少，以及向长寿命浆细胞和记忆库的选择减少。同时，T细胞对B细胞的帮助质量也随着年龄增长而下降。这一现象曾被归因于Tfh细胞在GCs内的错位、功能性GC-Tfh细胞缺乏相应的前体Tfh状态积累、Tfh细胞发育后期受损，以及抑制性T滤泡调节(T follicular regulatory, Tfr)细胞与Tfh细胞群的不利比例。在人类中，衰老同样与较弱的疫苗特异性抗体反应和免疫后抗体分泌细胞减少相关，但衰老对Tfh细胞的直接影响尚不明确。循环和淋巴组织Tfh细胞亚群的分析结果相互矛盾，一些研究报道老年人中频率增加，而其他研究则显示减少。值得注意的是，通过高分辨率纵向追踪外周血中免疫细胞亚群组成的免疫衰老指标IMM-AGE，确定了循环CD4+ Tfh细胞的减少是免疫衰老轨迹中的一个关键特征。Tfh细胞生物学在不同物种间并不完全相同。例如，一些人类GC-Tfh细胞独特地表达趋化因子CXCL13，这与GC活性和抗体质量密切相关。然而，这些细胞在小鼠中不存在，小鼠的CXCL13仅由滤泡树突状细胞产生。总体而言，这些发现强调了B-Tfh轴在衰老过程中的脆弱性，但B细胞和Tfh细胞对人类抗体反应受损的相对贡献仍未解决。
扁桃体来源的免疫类器官提供了一个独特的平台来探索人类特异性免疫功能。它们使我们能够直接在人类淋巴组织中研究调控B细胞和T细胞相互作用的细胞和分子机制。免疫类器官重现了GC反应的关键特征，包括B-Tfh细胞相互作用、浆母细胞分化、体细胞超突变、亲和力成熟和类别转换，同时保留了人类淋巴组织的免疫多样性。该系统已提供了关于早期免疫发育、调节性T细胞类型的作用以及流感抗原的疫苗诱导反应的见解，突显了其在识别适应性免疫机制方面的效用。此外，免疫类器官使我们能够独立于小鼠模型测试假设和定义机制，这对于理解人类特异性现象至关重要。
在本研究中，我们使用5-73岁供体的扁桃体样本，深入分析了衰老如何塑造人类免疫反应。老年人来源的类器官引发了较弱的抗体反应，我们将此归因于Tfh细胞缺陷。单细胞RNA测序(scRNA-seq)揭示了CXCL13+ GC-Tfh效应细胞的选择性减少。轨迹分析和阵列式CRISPR扰动研究表明，衰老阻断了Tfh细胞的成熟，并确定了在老年供体中受损的关键转录调节因子。这些发现共同揭示了一种人类特异性机制，说明衰老如何影响高质量抗体反应的产生，并揭示了可能用于恢复老年人体液免疫的途径。
结果
人类衰老期间体液反应受损
人类免疫系统显示出显著的个体间差异，适应性免疫反应最强的预测因素之一是年龄。为了探索衰老如何塑造体液免疫，我们分析了402名8-90岁健康个体对季节性流感疫苗的抗体反应。外周血在接种前(第0天)和接种后28天收集，并使用血凝抑制(HAI)测定法定量了针对血凝素(HA)的中和抗体。
在这个队列中，疫苗接种引发了血清抗体滴度的增加，大多数个体在第28天显示出可测量的HAI反应。针对H1、H3和B疫苗成分的抗体滴度，以复合几何平均滴度(GMT)表示，从基线平均增加了3倍。年龄成为疫苗反应性的主要决定因素。年龄与第28天GMT的倍数变化呈负相关，对应于每十年HAI降低约4%(β = -0.006每年，p < 0.001)。为进一步了解衰老如何影响体液免疫的质量，我们检查了血清转化(SC，定义为≥4倍升高且第28天GMT ≥40)和血清保护(SP，第28天GMT ≥40)作为补充指标，它们捕捉了疫苗免疫原性的不同方面。先前的人类研究表明，预先存在的抗体是后续疫苗反应的重要决定因素，而尽管老年人保持基线抗体水平，但他们显示出接种后抗体滴度升高的能力降低。与此一致，血清转化的概率随年龄下降(p < 0.001，每十年的比值比[OR] = 0.86)，而血清保护仅受到轻微影响(p = 0.017，OR = 0.88)。总的来说，这些结果支持这样一个观点：老年人可能保留预先存在的抗体分泌细胞，但增强现有或产生全新抗体反应的能力有限。抗体维持和诱导之间的这种区别表明，衰老并非均匀地损害体液免疫的所有方面，而是影响产生和放大抗体反应所需的复杂细胞相互作用。
为了进一步探索衰老对人类周围淋巴组织中体液免疫反应的直接影响，我们使用了最近描述的扁桃体免疫类器官模型，并将其适应为96孔板格式以提高通量，方法是将细胞嵌入水凝胶基质中。用减毒活流感疫苗(LAIV)刺激免疫类器官后7天，诱导了HA特异性IgG抗体的强烈分泌。生物层干涉测量显示，在14天的培养过程中，多克隆HA特异性抗体的亲和力不断增加，证实了持续的亲和力成熟。
接下来，我们组装了来自跨越近70年生命的扁桃体供体(n = 16，16-73岁)的免疫类器官，并测量了它们对LAIV的反应。与我们的人体流感疫苗接种研究一致，类器官免疫反应随年龄显著降低。来自年轻人(<30岁)的类器官对LAIV产生了强烈的反应，与未刺激的对照组相比，HA特异性IgG显著增加。相比之下，来自老年人(>50岁)的类器官显示出显著降低的疫苗反应。
先前的工作将衰老过程中体液免疫反应的降低与Tfh细胞与抑制性Tfr细胞的比例变化联系起来。与此一致，我们发现与年轻供体相比，老年人的扁桃体含有更高频率的Tfr细胞和更低频率的GC-Tfh细胞。尽管这些定量变化表明T细胞景观发生了变化，但它们对人类组织中GC活动的功能影响仍不明确。为了测试Tfr活性是否需要减弱B细胞分化为抗体分泌浆母细胞的能力，我们使用从年轻和老年供体分选的CXCR5hiPD-1hi GC-Tfh细胞和自体扁桃体B细胞建立了Tfh-B细胞共培养，输入比例经过标准化。细胞用LAIV刺激，7天后，我们通过流式细胞术测量了向CD38hiCD27hi浆母细胞的分化。在年轻供体中，向B细胞添加Tfh细胞引发了强烈的辅助反应，与单独培养的B细胞相比，浆母细胞频率增加了4-9倍。引人注目的是，即使在没有Tfr细胞的情况下，等量化Tfh细胞输入也未能完全恢复老年供体的反应。浆母细胞诱导显著降低，仅增加了3倍。这些结果共同表明，衰老对体液免疫的影响不能仅通过Tfh与Tfr亚群的变化来解释。相反，衰老似乎削弱了Tfh细胞帮助在促进强大B细胞反应中的关键作用。
B细胞在人类衰老期间对T细胞帮助的反应性保持不变
由于来自老年人的免疫类器官未能引发强烈的抗体反应，而且标准化B细胞和Tfh细胞的频率未能恢复缺陷，我们接下来询问衰老是否损害了B细胞对T细胞衍生信号的反应性。为了解决这个问题，我们从外周血单核细胞(PBMCs)中分离出B细胞，这些PBMCs来自老年人和年轻人(n = 20，22-72岁)。我们在有或没有B细胞受体(BCR)激活信号(IgA/IgG/IgM交联剂)和/或模拟Tfh细胞帮助的信号(IL-21和CD40L)的情况下培养纯化的B细胞，以评估B细胞的年龄相关变化。7天后，我们使用流式细胞术测量了分化B细胞亚群的频率。有趣的是，来自老年人和年轻人的B细胞对体外BCR和T细胞衍生信号的反应相似。与未刺激条件相比，GC样B细胞和浆母细胞的频率均显示出类似的增加。同样，在测试的任何条件下，CD138上调和IgD/CD95表达在年龄组之间均无显著差异。这些结果表明，抗体诱导的年龄相关下降主要不是由于B细胞活化或分化的内在缺陷。相反，这些数据表明T细胞在体液免疫随年龄衰减中起主导作用，与小鼠研究一致。
CXCL13+ GC-Tfh细胞在人类衰老期间减少
由于来自老年人的B细胞对体外T细胞衍生信号的反应正常，我们假设与体液免疫相关的缺陷可能起源于Tfh细胞本身。为了研究衰老如何影响人类扁桃体T细胞的组成和分子特征，我们从广泛年龄范围的供体中纯化CD3+ T细胞并进行了scRNA-seq。在初步质量控制后，我们鉴定了20,657个单细胞转录组，这些转录组聚类为15个不同的群体，代表典型的CD4+、CD8+和非常规T细胞亚群。CD4+ T细胞主要由初始和中央记忆亚群组成，较小比例为效应记忆和活化细胞。一个独特的部分表现出Tfh细胞的特征，以BCL6、CXCR5和PDCD1的高表达为标志，与在GCs中的定位和功能一致。
重要的是，我们识别出三个转录上不同的扁桃体Tfh细胞群体，包括初始Tfh细胞(具有较低的CXCR5、TOX和BCL6表达)、经典的GC-Tfh细胞(具有高BCL6、CXCR5和PDCD1表达)，以及一个独特但较小的CXCL13+ GC-Tfh细胞亚群，其特征是BCL6和IL6ST的最高表达以及强大的CXCL13转录水平。为了确定这些群体如何受年龄影响，我们比较了年轻和老年供体之间的Tfh亚群组成，揭示了老年人中CXCL13+ GC-Tfh细胞的显著减少。在年轻供体中，CXCL13+ GC-Tfh细胞占所有CD4+ T细胞的1%-8%，而在老年人中，它们占<1%。
为了验证年龄与CXCL13+ GC-Tfh细胞之间的关系，我们接下来分析了一个独立的扁桃体供体队列(n = 10，年龄5-61岁)，使用细胞内细胞因子染色(ICS)，使用CXCR5和PD-1作为先前建立的Tfh细胞成熟的标志物。CXCL13表达仅限于CXCR5+PD-1hi GC-Tfh群体，而非Tfh(CXCR5-)、前体Tfh(CXCR5+PD-1lo)和CXCR5+PD-1mid Tfh亚群中不存在。值得注意的是，只有部分GC-Tfh细胞表达CXCL13(4%-23%)，这表明这些细胞可能代表GC-Tfh谱系中的一个独特效应状态。与我们之前的scRNA-seq数据一致，CXCL13+ GC-Tfh细胞的频率随年龄显著下降(R² = 0.73，p = 0.0018)。通过ELISA测量的CXCL13分泌显示与年龄有类似的但较弱的负相关(R² = 0.34，p = 0.0783)，而关键Tfh效应细胞因子IL-21的分泌保持不变(R² = 0.0998，p = 0.3740)，这表明其调节与CXCL13+ GC-Tfh程序分离。
作为最终验证，使用公开的人类扁桃体图谱数据集，我们识别了对应于CXCL13表达的群体(注释为GC-Tfh-SAP)，并确认其随年龄减少(儿童：n = 6，3-5岁；年轻成年人：n = 8，19-35岁；老年成年人：n = 3，56-65岁)。有趣的是，IL21与CXCL13的调控不同，在一个不同的Tfh群体中观察到IL21表达增加(注释为GC-Tfh-OX4)。
总的来说，这些数据揭示了CXCL13+ GC-Tfh细胞的损失与衰老相关，这些细胞以高BCL6和IL6ST表达和独特的效应潜能为特征，从而将这种独特的人类群体确定为Tfh依赖性体液免疫的可能关键介质。
CXCL13+ GC-Tfh细胞构成独特的Tfh效应程序
Tfh细胞的成熟是一个多步骤过程，由发育中的GCs中与树突状细胞和B细胞的相互作用塑造。小鼠模型为理解Tfh细胞发育提供了基础框架；然而，物种之间存在关键差异。在小鼠中，成熟的GC-Tfh细胞上调CXCR5和PD-1，但不表达CXCL13。相比之下，我们的数据表明，人类Tfh细胞的成熟更为复杂，涉及一个由CXCL13表达表征的额外效应阶段。
为了更好地定义这些CXCL13+ GC-Tfh细胞，我们分析了我们的scRNA-seq扁桃体T细胞数据集，并比较了所有CD4+ T细胞群集的基因表达谱。有趣的是，与发育中的Tfh和GC-Tfh细胞相比，CXCL13+ GC-Tfh细胞表现出独特的转录组特征。与其它GC-Tfh细胞相比，CXCL13+ GC-Tfh细胞上调的差异表达基因(DEGs)包括生存和代谢的调节因子(GIMAP5、GIMAP7、GIMAP2、BCL2L11、SESN1和BCAT1)、活化和GC驻留的标志物(ITGAE、LAG3和CD38)、T细胞信号分子(IL6ST、IL7R和FYB)，以及转录调节因子(AFF3、ARID5A和TCF7)。相比之下，经典的GC-Tfh细胞富集了TIGIT、EGR1、EGR2、CD40LG、BTLA4和NFKB1，反映了GC-Tfh区室内的转录分歧。这进一步得到了关键效应基因(ICOS、IL6ST和ITGAE)的逐步增加的支持，CXCL13+ GC-Tfh细胞显示出这些活化和Tfh信号相关转录本的最高表达。
为了确定CXCL13+ GC-Tfh效应程序是否对应于任何已建立的小鼠Tfh亚群，我们将已发表的小鼠Tfh细胞基因特征与CD4+ T细胞转录本进行了比较。小鼠Tfh特征通常与非Tfh CD4+ T细胞重叠最小，其富集在传统GC-Tfh细胞中最高，这表明CXCL13+ GC-Tfh亚群代表了一个独特的人类特异性效应状态。
接下来，我们在体外研究了维持CXCL13+ GC-Tfh效应程序的功能需求。我们将不同的Tfh亚群分选并培养在有或无自体扁桃体B细胞的情况下。与我们之前的ICS实验一致，只有CXCR5+PD-1hi GC-Tfh细胞产生可测量的CXCL13。然而，在没有B细胞的情况下，CXCL13的产生完全被消除，表明CXCL13+效应状态的维持需要持续的B细胞相互作用。
为了功能上验证CXCL13分泌是由核心Tfh编程驱动的，我们接下来对原代扁桃体细胞中的Tfh相关转录因子(TFs)进行了靶向CRISPR敲除，随后用LAIV刺激7天。BCL6、BATF、TCF7和LEF1的破坏与对照相比显著降低了CXCL13的分泌，确认它们在维持CXCL13+ GC-Tfh效应表型中的重要作用。
总之，这些结果确立了CXCL13+ GC-Tfh细胞作为人类Tfh谱系中晚期B细胞依赖性效应群体的地位。这个亚群在转录上与其他GC-Tfh细胞不同，并独特地适应于在体液免疫反应期间在GC中表达趋化因子分子CXCL13。
GC-Tfh细胞成熟在人类衰老期间受损
既然我们已经确定CXCL13+ GC-Tfh细胞代表一个在老年供体中表示不足的独特效应状态，我们接下来询问衰老是否改变了产生这些细胞的发育编程。流式细胞术分析显示，代表Tfh成熟最早阶段的前体Tfh细胞(CXCR5+PD-1lo)随年龄显著增加。这一发现与Webb等人的研究一致，他们表明在病毒感染后，老年小鼠淋巴结中前体Tfh细胞过度表示。相比之下，更高级的Tfh亚群随年龄下降(CXCR5+PD-1mid和GC-Tfh)。值得注意的是，ICOS表达也与年龄呈负相关，与CXCL13+ GC-Tfh细胞的损失和介导T细胞对B细胞帮助的这种CXCL13+效应程序基因的表达受损一致。这些发现表明，前体状态的积累是以成熟GC-Tfh细胞频率为代价的。
为了进一步探索这一发育途径，我们使用扁桃体scRNA-seq数据集从初始CD4+ T细胞到CXCL13+ GC-Tfh细胞构建了伪时间轨迹。沿着这一连续体，我们观察到转录因子(BCL6和TOX)、共抑制受体(TIGIT)和Tfh效应分子(IL-21和CXCL13)的协调上调。比较年龄组之间的伪时间分布显示，尽管初始CD4+ T细胞的表示相似，但老年人在活化CD4+ T细胞状态处积累细胞，而在成熟GC-Tfh端点处减少。累积分布分析(显示达到特定细胞状态的细胞比例)证实了年轻和老年供体之间从活化CD4+ T细胞阶段开始并持续到后期成熟的分歧。这些数据共同表明，衰老限制了沿着Tfh发育途径的进展，在早期T细胞活化和前体Tfh细胞状态处产生瓶颈。
敲除年龄依赖性转录因子揭示人类Tfh细胞成熟调节因子
为了识别衰老过程中Tfh细胞发育受损的分子特征，我们比较了年轻和老年个体在伪时间箱之间的基因表达。引人注目的是，大多数年龄相关差异出现在早期分化状态，甚至在GC-Tfh承诺之前。这一发现表明，在老年人中观察到的效应GC-Tfh细胞频率降低可能是由于招募到淋巴组织的初始CD4+ T细胞中已经存在的变化。
为了更好地理解这一点，我们检查了早期伪时间阶段中年轻和老年供体之间的DEGs。老年人早期转录程序富集了应激和效应相关基因，包括编码BLIMP-1(PRDM1)的基因，它与BCL6功能相拮抗；多个AP-1家族转录因子(FOSB、JUNB、JUND和JUN)；以及AP-1家族结合伙伴IRF4。相比之下，年轻人的早期转录程序过表达了促进CD4+ T辅助细胞可塑性和维持的转录因子，如BACH2、SOX4、LEF1和STAT1。
为了功能上评估这些年龄相关转录因子在早期Tfh细胞极化中的作用，我们开发了一个使用初始CD4+ T细胞的阵列式CRISPR极化模型。在CRISPR-Cas9介导的选定年龄相关转录因子敲除后，初始CD4+ T细胞在Tfh极化条件下培养7天。选择用于敲除的转录因子包括经典的Tfh调节因子(BCL6和TCF7)以及从我们的轨迹分析中识别出的年龄相关转录调节因子。显示高编辑效率以及对BCL6敲除的非Tfh表型的样本被保留用于下游分析。
我们还通过靶向关键转录因子验证了CRISPR敲除平台，这些转录因子对其他CD4+ T辅助细胞命运至关重要。STAT1和BATF的敲除分别选择性地破坏了Th1和Th17极化，证实该检测能够捕捉谱系特异性分化。
在Tfh极化条件下测试的转录因子中，BACH2和SOX4的敲除显著降低了Tfh细胞分化，而SP110敲除产生了类似但不显著的趋势(p = 0.07)。LEF1或TCF7的敲除(初始到Tfh细胞转变的经典调节因子)显示了预期方向的效果，但未达到显著性。总的来说，这些结果确定了BACH2和SOX4是早期人类Tfh细胞极化的关键调节因子，这些因子随年龄下调。这些发现表明，衰老改变了从活化前体到承诺Tfh细胞的转录开关，导致向效应CXCL13+ GC-Tfh细胞状态的进展受损。
讨论
持久的抗体反应源自生发中心B细胞和T细胞的相互作用，但我们对这些相互作用如何受人类衰老影响的理解是不完整的。在这里，我们发现人类Tfh细胞发育包括一个成熟CXCL13+效应状态，这在近交系小鼠中不存在。这种独特的功能状态特征是记忆和组织驻留基因IL6ST、IL7R、ITGAE和TCF7等的表达增加。最重要的是，我们表明这些特殊的CXCL13+ GC-Tfh细胞在老年供体中显著减少，原因是成熟过程中的早期阻滞。这种成熟Tfh细胞的损失很可能是老年人抗体反应不佳的原因。通过将缺陷归因于成熟而非B细胞或Tfh细胞频率的普遍下降，我们提供了一个框架来理解为什么疫苗在老年人中效果较差，并突显了一种人类特有的免疫衰老机制，这是仅从动物模型无法推断出来的。
长期以来一直存在的问题是，老年人疫苗反应受损主要是由于B细胞内在功能障碍还是Tfh细胞帮助缺陷。小鼠研究强调了衰老B细胞中类别转换重组和体细胞超突变的缺陷，但人类的治疗干预表明，当提供足够的Tfh细胞信号时，来自老年人的B细胞仍能做出反应。我们的发现支持这一点，因为来自老年人的外周B细胞对Tfh细胞帮助信号的反应与来自年轻人的B细胞相似。这些发现将Tfh细胞定位为关键的限制因素。重要的是，Tfh细胞存在于表型和功能不同的状态中，但这些状态对GC功能的相对贡献以及它们在整个生命周期中的稳定性尚未解决。在Tfh细胞亚群中，CXCL13+ GC-Tfh细胞正成为一个特别重要的调节因子。CXCL13传统上由滤泡树突状细胞表达，并通过CXCR5受体作为趋化剂，建立经典的明区和暗区结构。然而，人类Tfh细胞也可以表达CXCL13，而小鼠T细胞不能。在人类研究中，CXCL13+ GC-Tfh细胞的丰度与疫苗反应性相关，接种后血液中CXCL13水平与GC活性和抗体质量高度相关。鉴于CXCL13+ GC-Tfh状态以记忆和组织驻留基因TCF7、IL7R和ITGAE(编码CD103)的显著增加表达为特征，可以推测这些细胞是长期抗体介导免疫的特别重要驱动因子。我们的研究现在将这些CXCL13+ GC-Tfh细胞定位为人类Tfh分化连续体中的一个关键成熟亚群，并表明这种成熟过程在衰老过程中被破坏。这些结果有助于澄清为什么先前关于Tfh频率在衰老中的报告不一致，表明缺陷不在于总体丰度，而在于无法有效产生成熟的GC-Tfh细胞，特别是那些表达CXCL13的细胞。
此外，我们的研究表明，通过结合对人与人之间变异的彻底分析与体外模型进行实验干预，可以发现新的生物学现象。虽然Tfh细胞先前被确定为纵向人类免疫衰老指标IMM-AGE的关键贡献者，但外周血在作为进行机制研究的相关组织方面存在局限性。在这里，通过检查随年龄下调的转录因子，我们发现了人类Tfh细胞成熟的人类特异性调节因子。Tfh细胞分化的转录调控已被很好地表征，主要是通过在小鼠模型中识别调节因子，然后在人类细胞中验证。这些研究确定了经典Tfh调节因子如BCL6、IRF4和BATF的作用。我们的研究扩展了人类Tfh细胞极化的这一框架，揭示了保守和不同的特征。例如，BACH2在小鼠中被描述为抑制Tfh命运的负调节因子，而在我们的人类系统中，它表现为早期向CXCL13+ GC-Tfh阶段进展所必需的正调节因子，突显了潜在的阶段和物种特异性差异。SOX4先前被暗示在慢性炎症期间驱动T外周辅助细胞中的CXCL13表达，被证明对淋巴组织中的Tfh细胞分化是必需的，将与病理相关的程序与正常的疫苗诱导体液免疫联系起来。SP110最好被描述为NF-κB信号的共调节因子，以前与Tfh生物学无关，但在我们的研究中，它被确定为人类Tfh成熟的潜在调节因子。值得注意的是，SP110突变与原发性免疫缺陷相关，表现为正常成熟的B细胞频率，但缺乏浆细胞和记忆细胞。这些发现不仅扩展了调控人类Tfh细胞发育的转录网络，还突显了研究调节通路的重要性。通过结合人类扁桃体的体外模型与CRISPR扰动，我们建立了一个机制平台，用于剖析人类淋巴组织内运作的调节通路。通过这种方式，我们的系统为分析人类对疫苗接种的免疫反应提供了框架，并提供了一个多功能工具，用于发现适应性免疫中的人类特异性检查点。
我们的发现对在免疫缺陷状态下测量疫苗功效具有转化潜力。血浆CXCL13已经在临床疫苗研究中被表征为GC活性的生物标志物。未来的工作将有必要确定CXCL13+ GC-Tfh细胞对系统性CXCL13水平的贡献，以及衰老是否也直接影响外周中的CXCL13+ Tfh细胞。血浆CXCL13可能不仅作为GC完整性的标志物，还作为Tfh成熟能力的替代物，能够在可访问的组织隔室中根据产生有效疫苗反应的可能性对老年人进行分层。BACH2和SOX4等转录调节因子的鉴定也指向了旨在恢复Tfh细胞成熟的直接分子靶点，无论是通过佐剂配方、细胞因子操作还是转录网络的药理学改变。
总之，我们的研究确定了一种人类特有的成熟CXCL13产生GC-Tfh细胞群体，该群体因衰老相关的Tfh成熟阻滞而减少，重塑了我们对老年人抗体反应受损机制的理解。通过强调早期Tfh细胞成熟中的缺陷并确定分子调节因子，我们为未来旨在恢复老年人群强大免疫力的策略奠定了基础。
研究局限性
扁桃体组织是粘膜次级淋巴B细胞和T细胞的可获取来源；然而，它们可能无法完全反映淋巴结或脾脏的生物学特性。此外，我们的类器官系统重现了许多GC功能特征，尽管它无法捕捉体内发生的系统性转运或长期回忆效应。尽管我们的全扁桃体敲除研究支持BCL6、BATF、TCF7和LEF1的T细胞内在效应，但我们不能排除B细胞也可能对这些实验中观察到的CXCL13表达降低有贡献。虽然初始CD4+ T细胞中单个转录因子的扰动提供了重要见解，但Tfh谱系承诺可能源于多个转录因子的相互作用。因此，我们的方法仅捕捉了部分情况，因为多个转录因子的组合敲除可能加剧或抵消我们观察到的效果，揭示尚未被发现的调控层次。最后，我们的CRISPR筛选是针对而非无偏的，可能还有其他调节因子对体内Tfh成熟有贡献。尽管存在这些局限性，人类免疫类器官、单细胞分析和遗传扰动的整合为揭示在动物模型中无法获取的适应性免疫机制提供了强大框架。
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