引言
疫苗接种的目标是通过产生高亲和力抗体来建立持久的保护性免疫。尽管抗体由B细胞产生，但其质量取决于专业CD4+ T细胞的帮助，这些T细胞被称为T滤泡辅助(Tfh)细胞。这些Tfh细胞与外周淋巴器官（如淋巴结、扁桃体和脾脏）生发中心(GC)中的B细胞相互作用。在这些微环境中，B细胞增殖并分化为分泌抗体的浆母细胞(PBs)和记忆细胞，共同提供持久的免疫力¹⁻³。尽管疫苗接种效果显著，但并非所有个体都能得到同等保护，疫苗反应的个体间差异非常大。年龄是影响疫苗反应不佳的最关键因素之一。与年轻个体相比，老年人产生较少的抗体分泌B细胞，产生的疫苗特异性抗体数量减少，这反映了尚未完全了解的免疫反应缺陷⁴。
先前的研究主要基于小鼠模型，表明衰老对GC生物学的多个方面产生负面影响，从而损害持久抗体反应的产生。来自老年小鼠的GC-B细胞表现出受损的类别转换重组和体细胞高频突变、减少的活化诱导胞苷脱氨酶驱动程序，以及与年轻小鼠相比，向长寿命浆细胞和记忆库的选择减少⁵。同时，T细胞对B细胞的帮助质量也随着年龄增长而下降。这已被归因于Tfh细胞在GC内的错误定位⁶、没有相应增加功能性GC-Tfh细胞的前体Tfh状态积累⁷、晚期Tfh发育受损⁸，以及抑制性T滤泡调节(Tfr)细胞与Tfh细胞群体的不利比例⁹。在人类中，衰老同样与疫苗特异性抗体反应减弱以及免疫接种后抗体分泌细胞减少相关⁴,¹⁰⁻¹³，但衰老对Tfh细胞的直接影响尚不明确。对循环和淋巴样Tfh细胞亚群的分析得出了相互矛盾的结果，一些研究报告老年成年人频率增加，而其他报告频率减少⁷,⁹,¹⁴,¹⁵。值得注意的是，通过高分辨率纵向监测外周血中免疫细胞亚群组成确定的人类免疫衰老指标IMM-AGE，将循环CD4+ Tfh细胞的减少确定为免疫衰老轨迹中的关键特征¹⁶。
Tfh细胞生物学在不同物种之间并不完全相同。例如，某些人类GC-Tfh细胞独特地表达趋化因子CXCL13，这与GC活性和抗体质量密切相关¹⁷⁻¹⁹。然而，这些细胞在小鼠中不存在，其中CXCL13仅由滤泡树突状细胞产生²⁰。这些发现突显了B-Tfh轴在衰老过程中的关键脆弱性，但B细胞和Tfh细胞对人类抗体反应受损的相对贡献仍未解决。
扁桃体来源的免疫类器官为探索人类特异性免疫功能提供了一个独特平台。它们能够直接在人类淋巴组织中研究控制B细胞和T细胞相互作用的细胞和分子机制。免疫类器官重现了GC反应的关键特征，包括B-Tfh细胞相互作用、浆母细胞分化、体细胞高频突变、亲和力成熟和类别转换，同时保留了人类淋巴组织的免疫多样性²¹。该系统已对早期免疫发育²²、调节性T细胞类型的作用²³以及针对流感抗原的疫苗诱导反应²⁴提供了深入见解，突显了其识别适应性免疫机制的效用。此外，免疫类器官使我们能够独立于小鼠模型测试假设并定义机制，这对于理解人类特异性现象至关重要。
在此，我们利用来自5-73岁捐赠者的扁桃体样本进行了深入分析，以了解衰老如何塑造人类免疫反应。老年个体的类器官产生了较弱的抗体反应，我们将其归因于Tfh细胞缺陷。单细胞RNA测序(scRNA-seq)显示CXCL13+ GC-Tfh效应细胞的选择性减少。轨迹分析和阵列CRISPR基因编辑扰动表明，衰老阻碍了Tfh成熟并确定了在老年捐赠者中受损的关键转录调控因子。这些发现共同揭示了一种人类特异性机制，解释了衰老如何影响高质量抗体反应的产生，并揭示了可能用于恢复老年人体液免疫的通路。
结果
体液免疫反应在人类衰老过程中受损
人类免疫系统表现出显著的个体间变异，而适应性免疫反应最强的预测因子之一是年龄¹⁶,²⁵⁻²⁸。为探索衰老如何影响体液免疫，我们分析了来自402名健康个体（8-90岁）对季节性流感疫苗的抗体反应²⁴,³⁰。外周血在基线（第0天）和疫苗接种后28天采集，并使用血凝抑制(HAI)测定法定量针对血凝素(HA)的中和抗体。
在此队列中，疫苗接种诱导了血清抗体滴度的增加，大多数个体在第28天显示可测量的HAI反应。针对H1、H3和B疫苗成分的抗体滴度汇总为复合几何平均滴度(GMT)，显示从基线的3倍中位变化（图1A）。年龄成为疫苗反应性的主要决定因素。年龄与第28天GMT的倍数变化呈负相关，对应于每十年HAI减少约4%（β = -0.006/年，p < 0.001）。为更深入了解衰老如何影响体液免疫质量，我们检查了血清转化(SC，定义为≥4倍上升且第28天GMT ≥40)和血清保护(SP，第28天GMT ≥40)作为捕捉疫苗免疫原性不同方面的互补指标。先前的人类研究表明，预先存在的抗体是后续疫苗反应的重要决定因素，尽管老年人维持基线抗体水平，但他们表现出在疫苗接种后提升抗体滴度的能力降低³¹,³²。与此一致，血清转化概率随年龄下降（p < 0.001，每十年比值比[OR] = 0.86），而血清保护仅轻微受影响（p = 0.017，OR = 0.88；图1B和1C）。总体而言，这些结果支持这样的观点：老年人可能保留预先存在的抗体分泌细胞，但提升现有或产生新抗体反应的能力有限。抗体维持和诱导之间的这种区别表明，衰老并非均匀地损害体液免疫的所有方面，而是影响产生和放大抗体反应所需的复杂细胞相互作用。
为直接在人类外周淋巴组织内进一步探索衰老对体液免疫反应的影响，我们使用了最近描述的扁桃体免疫类器官模型，并通过将细胞嵌入水凝胶基质中将其改编为96孔板格式以提高通量（图1D）²¹。用减毒活流感疫苗(LAIV)刺激免疫类器官诱导了第7天HA特异性IgG抗体的稳健分泌（图1E）。生物层干涉测量显示在14天培养过程中多克隆HA特异性抗体亲和力不断增加，证实正在进行亲和力成熟（图1F和1G）。
接下来，我们从跨越近70年寿命的扁桃体捐赠者（n = 16，16-73岁，表S1）组装了免疫类器官，并测量了它们对LAIV的反应。与我们在体内的流感疫苗研究一致，类器官免疫反应随年龄显著降低⁴,¹⁰⁻¹³。来自年轻捐赠者（<30岁）的类器官对LAIV产生强烈反应，与未刺激对照相比，HA特异性IgG强烈诱导（图1H）。相比之下，来自老年人（>50岁）的类器官显示出显著降低的疫苗反应。
先前的研究将衰老中体液免疫反应降低与Tfh细胞与抑制性Tfr细胞的比例降低相关联⁹。与此一致，我们发现与年轻捐赠者相比，老年人的扁桃体含有增加频率的Tfr细胞和减少频率的GC-Tfh细胞（图S1A和S1B）⁹。尽管这些定量变化表明T细胞景观发生了改变，但它们对人类组织中GC活性的功能影响仍未明确。为测试Tfr活性是否需要在衰老中削弱B细胞向抗体分泌浆母细胞的分化，我们使用分离的CXCR5hiPD-1hi GC-Tfh细胞和自体扁桃体B细胞（来自年轻和年老捐赠者）建立了Tfh-B细胞共培养，采用标准化的输入比例（图1I）。细胞用LAIV刺激，7天后通过流式细胞术测量向CD38hiCD27hi浆母细胞的分化（图S1C）。在年轻捐赠者中，将Tfh细胞添加到B细胞中引发了强烈的辅助反应，与单独培养的B细胞相比，浆母细胞频率增加了4-9倍（图1J）。值得注意的是，即使在没有Tfr细胞的情况下，使Tfh细胞输入标准化也未能完全恢复老年捐赠者的反应。浆母细胞诱导显著降低，仅显示3倍增加。这些结果共同表明，衰老对体液免疫的影响不能仅通过Tfh向Tfr亚群的转变来解释。相反，衰老似乎削弱了Tfh细胞帮助在实现强大的B细胞反应中的关键作用。
B细胞在人类衰老过程中保持对T细胞帮助的反应性
由于来自老年人的免疫类器官未能产生强烈的抗体反应，并且标准化B细胞和Tfh细胞的频率未能恢复缺陷，我们接下来询问衰老是否损害B细胞对T细胞衍生信号的反应性。为此，我们从外周血单个核细胞(PBMCs)中分离B细胞（来自老年和年轻捐赠者，n = 20，22-72岁）。我们在有或没有B细胞受体(BCR)激活信号（IgA/IgG/IgM交联剂）和/或模拟Tfh细胞帮助的信号（IL-21和CD40L）的情况下培养纯化的B细胞，以评估与年龄相关的B细胞变化（图2A）。7天后，我们使用流式细胞术测量分化的B细胞亚群频率（图2B和S2）。有趣的是，来自老年人和年轻人的B细胞对体外BCR和T细胞衍生信号表现出相似的反应。GC样B细胞和浆母细胞的频率均与未刺激条件相比显示出类似的增加（图2C和2D）。同样，CD138上调和IgD/CD95表达在任何测试条件下两组之间均无显著差异（图2E-2H）。这些结果表明，抗体诱导的年龄相关下降主要不是由于B细胞活化或分化的内在缺陷。相反，这些数据表明T细胞在衰老中体液免疫的衰减中起主导作用，这与小鼠研究一致³³,³⁴。
CXCL13+ GC-Tfh细胞在人类衰老过程中减少
由于来自老年人的B细胞对体外T细胞衍生信号表现出正常反应，并且标准化B细胞和Tfh细胞的频率未能恢复缺陷，我们假设与体液免疫相关的年龄相关缺陷可能源于Tfh细胞本身。为研究衰老如何影响人类扁桃体T细胞的组成和分子特征，我们从广泛年龄范围的捐赠者中纯化CD3+ T细胞并进行scRNA-seq（图3A和S3A）。经过初始质量控制后，我们确定了20,657个单细胞转录组（图S3B-S3D），它们聚类成15个不同的群体，代表典型的CD4+、CD8+和非常规T细胞亚群（图3B和S3E）。CD4+ T细胞主要由初始和中央记忆亚群组成，效应记忆和活化细胞的比例较小。一个独特部分表现出Tfh细胞的特征，由BCL6、CXCR5和PDCD1的升高表达定义，与在GC中的定位和功能一致。
重要的是，我们确定了三个转录上不同的扁桃体Tfh细胞群体（图3C），包括初始Tfh细胞（CXCR5、TOX和BCL6表达较低）；经典的GC-Tfh细胞（BCL6、CXCR5和PDCD1表达高）；以及一个独特但明显的CXCL13+ GC-Tfh细胞亚群，其特征是BCL6和IL6ST的最高表达以及稳健的CXCL13转录水平。为确定这些群体如何受年龄影响，我们比较了年轻和老年捐赠者之间的Tfh亚群组成，揭示了老年人中CXCL13+ GC-Tfh细胞的显著减少（图3D和3E）。在年轻捐赠者中，CXCL13+ GC-Tfh细胞占所有CD4+ T细胞的1%-8%，而在老年人中占<1%。
为验证年龄与CXCL13+ GC-Tfh细胞之间的关系，我们通过胞内细胞因子染色(ICS)分析了另一组扁桃体捐赠者（n = 10，5-61岁）（图3F和3G），使用CXCR5和PD-1作为Tfh细胞成熟的先前建立的标记（图S3F）⁷,³⁵。CXCL13表达仅限于CXCR5+PD-1hi GC-Tfh群体，不存在于非Tfh（CXCR5-）、前体Tfh（CXCR5+PD-1lo）和CXCR5+PD-1mid Tfh亚群中（图3H）。值得注意的是，只有部分GC-Tfh细胞表达CXCL13（4%-23%），表明这些细胞可能代表GC-Tfh谱系内的独特效应状态。与我们之前的scRNA-seq数据一致，CXCL13+ GC-Tfh细胞的频率随年龄显著下降（R² = 0.73，p = 0.0018，图3I和S3G）。通过ELISA测量的CXCL13分泌显示出与年龄的类似但较弱的负相关（R² = 0.34，p = 0.0783），而关键Tfh效应细胞因子IL-21的分泌保持不变（R² = 0.0998，p = 0.3740），表明其调控与CXCL13+ GC-Tfh程序分离（图S3H）。
作为使用公开的人类扁桃体图谱数据集的最终验证，我们确定了对应于CXCL13表达的群体（注释为GC-Tfh-SAP；图S4A），并确认其随年龄减少（图S4B；儿童：n = 6，3-5岁；年轻成年人：n = 8，19-35岁；老年成年人：n = 3，56-65岁）³⁶。有趣的是，IL21与CXCL13不同，IL21的表达增加在另一个Tfh群体中观察到（注释为GC-Tfh-OX4；图S4C）。
总体而言，这些数据揭示了衰老与CXCL13+ GC-Tfh细胞的丧失相关，这些细胞以其高BCL6和IL6ST表达和独特的效应潜力为特征，从而突显了这一独特的人类群体作为Tfh依赖性体液免疫的关键介质。
CXCL13+ GC-Tfh细胞构成独特的Tfh效应程序
Tfh细胞成熟是一个多步骤过程，由发育中GC内树突状细胞和B细胞的相互作用塑造。小鼠模型为理解Tfh细胞发育提供了基础框架；然而，物种之间存在关键差异。在小鼠中，成熟GC-Tfh细胞上调CXCR5和PD-1，但不表达CXCL13（图4A）³。相比之下，我们的数据表明人类Tfh细胞成熟更为复杂，并涉及CXCL13表达的额外效应阶段。
为更好地定义这些CXCL13+ GC-Tfh细胞，我们分析了我们的scRNA-seq扁桃体T细胞数据集，并比较了所有CD4+ T细胞群集的基因表达谱。有趣的是，CXCL13+ GC-Tfh细胞与发育中的Tfh和GC-Tfh细胞相比，表现出独特的转录组特征（图4B）。与其它GC-Tfh细胞相比，CXCL13+ GC-Tfh细胞中上调的差异表达基因(DEGs)包括生存和代谢调节因子（GIMAP5、GIMAP7、GIMAP2、BCL2L11、SESN1和BCAT1）、活化和GC驻留标记（ITGAE、LAG3和CD38）、T细胞信号分子（IL6ST、IL7R和FYB）以及转录调节因子（AFF3、ARID5A和TCF7；图4C）。相比之下，经典GC-Tfh细胞富集了TIGIT、EGR1、EGR2、CD40LG、BTLA4和NFKB1，反映了GC-Tfh区室内的转录分支。这通过关键效应基因（ICOS、IL6ST和ITGAE）的渐进增加得到进一步支持，CXCL13+ GC-Tfh细胞显示这些活化和Tfh信号相关转录本的最高表达（图4D）。为确定CXCL13+ GC-Tfh效应程序是否对应于任何已建立的小鼠Tfh亚群，我们将已发表的小鼠Tfh细胞基因特征与我们scRNA-seq数据集中的CD4+ T细胞转录本进行了比较³⁷⁻⁴¹。小鼠Tfh特征通常与非Tfh CD4+ T细胞的最小重叠，并且它们的富集在传统GC-Tfh细胞中最高，表明CXCL13+ GC-Tfh亚群代表一种独特的人类特异性效应状态（图S5）。
我们接下来检查了维持CXCL13+ GC-Tfh效应程序的体内功能要求。我们对不同的Tfh亚群进行流式分选，并在有或没有自体扁桃体B细胞的情况下培养它们（图4E和4F）。与我们之前的ICS实验一致，只有CXCR5+PD-1hi GC-Tfh细胞产生可测量的CXCL13（图4G）。然而，在没有B细胞的情况下，CXCL13产生完全被消除，表明CXCL13+效应状态的维持需要持续的B细胞相互作用。
为功能验证CXCL13分泌是由核心Tfh编程驱动的，我们接下来在原代扁桃体细胞中进行了靶向CRISPR敲除选定的Tfh相关转录因子(TFs)，随后用LAIV刺激7天（图4H）。BCL6、BATF、TCF7和LEF1的破坏每个都显著降低了CXCL13分泌（图4I；表S2和S3），证实了它们在维持CXCL13+ GC-Tfh效应表型中的关键作用。
这些结果共同确立CXCL13+ GC-Tfh细胞为人类Tfh谱系内晚期B细胞依赖性效应群体。该亚群在转录上与其他GC-Tfh细胞不同，并且独特地适应在体液免疫反应期间在GC内表达趋化因子分子CXCL13。
GC-Tfh细胞成熟在人类衰老过程中受损
在确定CXCL13+ GC-Tfh细胞代表在老年捐赠者中代表性不足的独特效应状态后，我们接下来询问衰老如何改变产生这些细胞的发育编程。流式细胞术分析显示，初始Tfh细胞（CXCR5+PD-1lo），代表Tfh成熟的最早阶段，随年龄显著增加（R² = 0.5476，p = 0.0092；图5A，S6A和S6B）。这一发现与Webb等人的研究一致，他们显示在病毒感染后，前体Tfh细胞在老年小鼠淋巴结中过度表达⁷。相比之下，更高级的Tfh亚群随年龄下降（CXCR5+PD-1mid：R² = 0.4653，p = 0.0208；GC-Tfh：R² = 0.5101，p = 0.0135）。值得注意的是，ICOS表达也与年龄呈负相关（R² = 0.5375，p = 0.0103），与CXCL13+ GC-Tfh细胞的丧失和该CXCL13+效应程序基因的受损表达一致，该基因介导T细胞对B细胞的帮助（图S6C）。这些发现表明，前体状态的积累是以成熟GC-Tfh细胞频率为代价的。
为进一步探索这一发育途径，我们使用我们的扁桃体scRNA-seq数据集构建了从初始CD4+ T细胞到CXCL13+ GC-Tfh细胞的伪时间轨迹（图5B）。沿着这一连续体，我们观察到转录因子（BCL6和TOX）、共抑制受体（TIGIT）和Tfh效应分子（IL-21和CXCL13）的协调上调（图5C）。比较年龄组之间的伪时间分布显示，尽管初始CD4+ T细胞的代表性相似，但老年人在活化的CD4+ T细胞状态积累，而在成熟GC-Tfh终点处减少（图5D）。累积分布分析（显示沿伪时间达到特定细胞状态的细胞比例）证实了年轻和老年捐赠者之间的分歧，这种分歧在活化的CD4+ T细胞阶段出现并在后期成熟步骤中持续（Kolmogorov-Smirnov检验，p < 2.2e−16）。总体而言，这些数据表明衰老限制了沿Tfh发育途径的进展，在早期T细胞活化和前体Tfh细胞状态中产生瓶颈。
年龄依赖性转录因子的敲除揭示了人类Tfh细胞成熟的调节因子
为确定衰老过程中Tfh细胞发育受损的分子特征，我们比较了伪时间仓中年轻和老年个体之间的基因表达。引人注目的是，大多数与年龄相关的差异出现在早期分化状态，甚至在GC-Tfh承诺之前（图6A）。这一发现表明，在老年人中观察到的效应GC-Tfh细胞频率降低可能是由招募到淋巴组织中的初始CD4+ T细胞中已经存在的变化引起的。
为更好地理解这一点，我们检查了早期伪时间阶段中年轻和老年捐赠者之间的DEGs。早期老年个体的转录程序富集了应激和效应相关基因，包括编码BLIMP-1（PRDM1）的基因，它反对BCL6功能；多个AP-1家族TFs（FOSB、JUNB、JUND和JUN）；以及AP-1家族结合伙伴IRF4（图6B）。相比之下，年轻个体的早期转录程序过表达了促进CD4+ T辅助细胞可塑性和维持的TFs，如BACH2、SOX4、LEF1和STAT1。
为功能评估这些与年龄相关的TFs在早期Tfh细胞极化过程中的作用，我们开发了一个基于阵列CRISPR的极化模型，使用初始CD4+ T细胞。在CRISPR-Cas9介导的选定与年龄相关的TFs敲除后，初始CD4+ T细胞在Tfh极化条件下培养7天（图6C，6D和S7A）。选择用于敲除的TFs包括规范的Tfh调节因子（BCL6和TCF7）以及从我们的轨迹分析中确定的与年龄相关的转录调节因子（表S4）。显示高编辑效率以及对BCL6敲除的非Tfh表型的样本保留用于下游分析（图S7B和S7C）。我们还通过靶向对替代CD4+ T辅助细胞命运至关重要的关键TFs验证了CRISPR敲除平台。STAT1和BATF的敲除分别选择性破坏了Th1和Th17极化，证实该检测准确捕捉谱系特异性分化（图6E，S7D和S7E）。
在Tfh极化条件下测试的TFs中，BACH2和SOX4的敲除显著减少了Tfh细胞分化，而SP110敲除产生了类似但不显著的趋势（p = 0.07；图6F）。LEF1或TCF7的敲除（从初始到Tfh细胞过渡的规范调节因子）显示了预期方向的效果，但未能达到显著性。总体而言，这些结果将BACH2和SOX4确定为早期人类Tfh细胞极化的关键调节因子，它们随年龄下调。这些发现表明，衰老改变了从活化前体到承诺Tfh细胞的转录开关，导致向效应CXCL13+ GC-Tfh细胞状态的进展受损。
讨论
持久的抗体反应起源于生发中心B细胞和T细胞的相互作用，但我们对这些相互作用如何受人类衰老影响的理解是不完整的。在这里，我们发现人类Tfh细胞发育包括一种成熟CXCL13+效应状态，这在近交系小鼠中不存在。这种独特的功能状态具有记忆和组织驻留基因IL6ST、IL7R、ITGAE和TCF7等的增加表达。最重要的是，我们表明这些特化的CXCL13+ GC-Tfh细胞在老年捐赠者中由于早期成熟阻断而显著减少。这些成熟Tfh细胞的丧失可能解释了老年人的抗体反应不佳。通过将缺陷归因于成熟而非B细胞或Tfh细胞频率的普遍下降，我们提供了一个框架来理解为什么疫苗在老年人中效果较差，并突出了一个无法仅从动物模型推断的人类特异性免疫衰老机制。
一个长期存在的问题是，老年人中疫苗反应受损主要是由于B细胞内在功能障碍还是Tfh细胞帮助缺陷。小鼠研究强调了老年B细胞中类别转换重组和体细胞高频突变的缺陷，但人类的治疗干预表明，来自老年人的B细胞在提供足够的Tfh细胞信号时仍能作出反应⁵,⁴²,⁴³。我们的发现支持这一点，因为来自老年人的外周B细胞对Tfh细胞帮助信号的反应与来自年轻捐赠者的B细胞相似。这些发现将Tfh细胞定位为关键的限制因素。重要的是，Tfh细胞存在于表型和功能不同的状态中，但这些状态对GC功能的相对贡献及其在人类生命周期中的稳定性仍未解决。在Tfh细胞亚群中，CXCL13+ GC-Tfh细胞正成为特别重要的调节因子。CXCL13通常由滤泡树突状细胞表达，并通过CXCR5受体作为趋化因子，建立典型的暗区和亮区结构。然而，人类Tfh细胞也可以表达CXCL13，而小鼠T细胞则不能。在人类研究中，CXCL13+ GC-Tfh细胞的丰度与疫苗反应性相关，疫苗接种后血液中的CXCL13水平与GC活性和抗体质量高度相关¹⁷,¹⁸。鉴于CXCL13+ GC-Tfh状态以记忆和组织驻留基因TCF7、IL7R和ITGAE（编码CD103）的显著增加表达为特征，可以推测这些细胞是长期抗体介导免疫的特别重要驱动因子。我们的研究现在将这些CXCL13+ GC-Tfh细胞定位为人类Tfh分化连续体中的关键成熟亚群，并显示这种成熟过程在衰老过程中受到破坏。这些结果有助于澄清为什么先前关于衰老中Tfh频率的报告不一致，表明缺陷不在于整体丰度，而在于未能有效产生成熟GC-Tfh细胞，特别是那些表达CXCL13的细胞。
此外，我们的研究表明，通过将人类个体间变异的彻底分析与体外干预模型相结合，可以发现新的人类生物学。尽管Tfh细胞被确定为纵向人类免疫衰老指标IMM-AGE的关键贡献者，但外周血在进行机制研究方面的能力有限¹⁶。在这里，通过检查随年龄下调的TFs，我们发现了人类Tfh细胞成熟的人类特异性调节因子。Tfh细胞分化的转录调控已被充分表征，主要通过在小鼠模型中识别调节因子，然后在人类细胞中验证³,⁴⁴⁻⁴⁸。这些研究确立了规范Tfh调节因子如BCL6、IRF4和BATF的作用。我们的研究扩展了人类Tfh细胞极化的这一框架，揭示了保守和不同的特征。例如，BACH2在小鼠中被描述为负调节因子，抑制Tfh命运⁴⁹，而在我们的人类系统中，它表现为促进向CXCL13+ GC-Tfh阶段早期进展的正调节因子，突显了潜在的阶段和物种特异性差异。SOX4先前被认为在慢性炎症期间驱动T外周辅助细胞中CXCL13的表达⁵⁰，在本研究中被证明对淋巴组织中的Tfh细胞分化是必需的，将与病理相关的程序与正常的疫苗诱导体液免疫联系起来。SP110最佳表征为NF-κB信号的共调节因子，以前未与Tfh生物学相关联，但在我们的研究中，它作为人类Tfh成熟潜在调节因子出现。值得注意的是，SP110突变与原发性免疫缺陷相关，导致成熟B细胞频率正常但缺乏浆细胞和记忆细胞⁵¹,⁵²。这些发现不仅扩展了控制人类Tfh细胞发育的转录网络，还突显了研究调节通路的重要性。通过将人类扁桃体的体外模型与CRISPR扰动相结合，我们建立了一个机制平台来剖析人类淋巴组织内运行的调节通路。通过这种方式，我们的系统为分析人类对疫苗接种的免疫反应提供了一个框架，并提供了一个多功能工具来揭示适应性免疫中的人类特异性检查点。
我们的发现具有测量免疫缺陷状态下疫苗功效的转化潜力。血浆CXCL13已在临床疫苗研究中被表征为GC活性的生物标志物。未来的工作有必要确定CXCL13+ GC-Tfh细胞对系统CXCL13水平的贡献，以及衰老是否也直接影响外周的CXCL13+ Tfh细胞。血浆CXCL13不仅可以作为GC完整性的标志物，还可以作为Tfh成熟能力的替代物，使老年人根据其产生有效疫苗反应的可能性在外周组织室中分层。转录调节因子如BACH2和SOX4的鉴定也指向旨在恢复Tfh细胞成熟的干预的直接分子靶点，无论是通过佐剂配方、细胞因子操作还是转录网络的药理学改变¹⁵,⁵³。
总之，我们的研究确定了一种人类特异性成熟CXCL13产生GC-Tfh细胞群体，该群体因衰老相关的Tfh成熟阻断而减少，重塑了我们对老年人抗体反应受损机制的理解。通过突出早期Tfh细胞成熟的缺陷并确定分子调节因子，我们为未来旨在恢复老年人群强大免疫的策略奠定了基础。
研究局限性
扁桃体组织是粘膜次级淋巴B细胞和T细胞的可获取来源；然而，它们可能无法完全反映淋巴结或脾脏的生物学。此外，我们的类器官系统重现了GC功能的许多特征，尽管它无法捕获体内发生的系统运输或长期回忆效应。尽管我们的全扁桃体敲除研究表明BCL6、BATF、TCF7和LEF1具有T细胞内在效应，但我们不能排除B细胞也可能导致这些实验中观察到的CXCL13表达降低。虽然初始CD4+ T细胞中单一TF扰动提供了重要见解，但Tfh谱系承诺可能源于多个TFs的相互作用。因此，我们的方法仅捕获了部分情况，因为多个TFs的组合敲除可能加剧或抵消我们观察到的效果，揭示尚未发现的调控层。最后，我们的CRISPR筛选是有针对性的而非无偏的，在体内可能还有其他调节因子有助于Tfh成熟。尽管存在这些注意事项，人类免疫类器官、单细胞分析和遗传扰动的整合为揭示动物模型无法获得的适应性免疫机制提供了一个强大的框架。
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