摘要
胰腺导管腺癌(PDAC)仍是一种高度侵袭性恶性肿瘤，治疗选择有限。靶向代谢脆弱点和破坏氧化还原应激通路已成为一种潜在的治疗策略。γ-谷氨酰-硒甲基硒代半胱氨酸(GGMSC)是一种含硒化合物，结构上与硒-L-甲基硒代半胱氨酸(MSC)相关，已在临床前模型中显示出抗癌潜力，尽管其在PDAC中的分子效应尚未明确定义。在本研究中，我们调查了高剂量GGMSC对两种PDAC细胞系CAPAN-2和HPAF-II的转录组反应。RNA测序和细胞毒性测定显示CAPAN-2细胞对GGMSC表现出明显敏感性，与氧化应激和铁死亡相关通路的激活有关，同时代谢和细胞周期基因下调。相比之下，HPAF-II细胞表现出有限的转录改变并维持了增殖和代谢程序。这些发现为GGMSC诱导的PDAC转录反应的分子机制提供了见解，并为基于硒的胰腺癌治疗的未来研究提供了潜在方向。
关键词：γ-谷氨酰-硒甲基硒代半胱氨酸；胰腺导管腺癌；硒细胞毒性；氧化还原调控；铁死亡；表观遗传修饰
1. 引言
胰腺导管腺癌(PDAC)是其中最具有侵袭性和致命性的恶性肿瘤之一，其特点是诊断较晚、转移潜力高以及对传统疗法的耐药性。尽管手术技术和化疗方案有所进步，PDAC的五年生存率仍低于10%。PDAC肿瘤中的致密基质环境、代谢可塑性和氧化还原失衡导致其治疗反应不佳，突显了对新型治疗方法的需求。靶向代谢脆弱点和氧化应激已成为PDAC治疗中的一种有前景的策略。最近的研究表明，调控氧化还原稳态的通路（如KEAP1-NRF2轴）以及细胞死亡机制（如铁死亡）在PDAC进展和治疗耐药中起着关键作用。能够同时调节氧化还原稳态并诱导铁死亡的药物可能通过选择性损害肿瘤细胞生存机制同时保护正常细胞而提供治疗益处。
基于硒的化合物因其调节氧化应激、抑制组蛋白脱乙酰酶(HDACs)以及触发多种形式细胞死亡（包括凋亡和铁死亡）的能力而引起了广泛关注。其中，硒-L-甲基硒代半胱氨酸(MSC)在多个临床前模型中已显示出有希望的抗癌效果，通过诱导凋亡、铁死亡和内质网(ER)应激以及抑制HDAC活性。结构相关的类似物γ-谷氨酰-硒甲基硒代半胱氨酸(GGMSC)也已显示出抗癌潜力。GGMSC是一种天然存在的有机硒化合物，主要存在于富硒大蒜中，是其中主要的硒形态。它也在硒积累植物如二裂黄芪中被鉴定出来。GGMSC和相关硒代氨基酸的天然存在支持其生物学相关性，并突显了它们在化学预防应用中的潜力。
GGMSC作为MSC的γ-谷氨酰化类似物，被认为是一种前药，在酶解后释放生物活性硒代谢物。尽管关于GGMSC的研究仍然有限，但现有证据表明它与MSC共享许多机制特性。在啮齿动物模型中，GGMSC显示出与MSC相当的肿瘤抑制活性和基因表达谱，包括抑制肿瘤生长和调节氧化还原通路。迄今为止，唯一测试GGMSC的体外研究是在COLO205结肠腺癌细胞中进行的，其中高达250 μM的浓度未产生显著细胞毒性。相比之下，相同研究中的MSC通过ER应激和死亡受体通路触发了凋亡。Dong等人的体内研究进一步证明GGMSC可从大蒜中生物利用，并在啮齿动物模型中表现出与MSC相当的消除动力学和肿瘤抑制活性。综合这些发现表明GGMSC具有生物活性，但可能需要更高浓度、更长时间暴露或特定的酶激活环境才能发挥细胞毒性作用。
鉴于这些观察结果，我们旨在研究GGMSC在PDAC细胞中的转录组效应，重点关注氧化还原信号传导、铁死亡、代谢重塑和细胞周期调控。我们选择了CAPAN-2和HPAF-II细胞系作为具有不同起源和分子特征的PDAC模型的代表。CAPAN-2是从原发性胰腺肿瘤中衍生的高分化腺癌系，携带常见的PDAC驱动突变，包括KRAS、TP53和SMAD4。相比之下，HPAF-II是从转移性腹水中衍生的高分化系，也携带KRAS和TP53突变，并以强上皮形态为特征，具有转移潜力。这些对比特征为比较原发性和转移性PDAC背景中GGMSC反应提供了依据。通过分析CAPAN-2和HPAF-II对高剂量GGMSC处理的转录反应，我们试图阐明其细胞毒性效应的分子机制，并确定可能导致差异敏感性的潜在因素。本研究进一步提供了GGMSC作为PDAC中氧化还原调节剂的治疗潜力及其与基于MSC的硒疗法关系的见解。
2. 材料与方法
2.1. 细胞培养和生长条件
人胰腺癌细胞系HPAF-II和CAPAN-2分别购自美国典型培养物保藏中心(ATCC; CRL-1997, 德国韦塞尔)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ; ACC-245, 布伦瑞克)。细胞在Eagle's最低必需培养基(EMEM; ATCC)中培养，补充10%热灭活胎牛血清(FBS; Gibco, 英国佩斯利)，并在37°C、5% CO2的加湿环境中培养。培养基中未添加抗生素。定期评估支原体污染情况。细胞数量使用TC20™自动细胞计数器(Bio-Rad, 美国波特兰)确定。
在RNA测序实验前，采用逐步血清再适应方案以最小化由细胞周期不同步引起的生物学变异性。细胞最初在不含胎牛血清(0% FBS)的EMEM中培养，以诱导短暂的静止(G0)状态。随后，FBS浓度逐渐增加(2%、5%、最后10%)，每种条件维持72小时，以允许受控的重新进入细胞周期。在完全再适应到10% FBS后，细胞在标准条件下再培养三个传代，然后进行GGMSC处理和RNA分离。类似的血清饥饿和再喂养方案已用于先前的转录组学和蛋白质组学研究，以同步癌细胞并减少背景转录变异性。该方法有助于同步细胞群体，并确保大多数细胞在处理时处于可比的生长阶段，从而减少转录噪声并提高下游RNA-seq分析的稳健性。
2.2. GGMSC处理和细胞毒性测定
γ-谷氨酰-硒甲基硒代半胱氨酸(GGMSC)由Sabinsa公司(批号129; 美国新泽西州伊斯特温莎)提供。通过将GGMSC溶解在无菌蒸馏水中制备250 mM储备溶液。对于RNA测序实验，CAPAN-2和HPAF-II细胞用500 μM GGMSC处理8小时或20小时。对照细胞在相同条件下培养，不进行处理。每组处理均进行三个独立的生物重复，以确保实验一致性。处理后，收集细胞并在-80°C下储存，用于后续RNA提取。
进行细胞毒性测定以确定GGMSC的半最大抑制浓度(IC50)。将细胞以400个细胞/mm²的密度接种在96孔板(BD Falcon, 美国达勒姆)中。24小时后，细胞暴露于GGMSC的系列稀释液中，浓度范围高达10 mM。使用CellTiter-Glo® 2.0发光细胞活力测定(Promega, 美国麦迪逊)在24、48和72小时测量细胞活力，该方法量化细胞内ATP作为代谢活性的指标。使用CLARIOstar®发光计(BMG Labtech, 德国奥滕贝格)收集发光读数。每次测定均进行三重实验，每种细胞系进行五次独立实验。使用GraphPad Prism 10.1.2版(GraphPad Software Inc., 美国圣地亚哥)计算IC50值。
2.3. RNA分离和mRNA文库构建
使用Maxwell® RSC simplyRNA Cells试剂盒(Promega, 美国麦迪逊)从CAPAN-2和HPAF-II细胞系中提取总RNA，该试剂盒采用基于顺磁珠的纯化方法。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, 美国沃尔瑟姆)评估RNA浓度和纯度。根据SMART™-seq2方案构建cDNA文库，该方案利用模板转换寡核苷酸(TSO_II)进行全长cDNA合成。简而言之，将200 ng总RNA与1 mM dNTP混合物和1 μM VN30 Poly-T寡核苷酸(5'端标记有特定接头序列)在72°C下孵育3分钟，然后冷却至4°C。接下来，制备第二种反应混合物，包含1×模板转换RT缓冲液、3.75 μM模板转换寡核苷酸II(Integrated DNA Technologies, 比利时鲁汶)和1×模板转换RT酶混合物(New England Biolabs, 美国伊普斯维奇)。将两种混合物结合，在42°C下孵育90分钟，然后在85°C下失活5分钟。将所得双链cDNA进行有限扩增，使用PCR_Oligo_II引物和1×Platinum SuperFi™ PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific, 美国沃尔瑟姆)进行15 μL反应。使用SPRIselect™基于珠的试剂(Beckman Coulter Life Sciences, 美国印第安纳波利斯)纯化扩增的cDNA，并使用Qubit™ 4.0荧光计(Thermo Fisher Scientific, 美国罗克福德)测量cDNA浓度。
2.4. Illumina文库制备和测序
使用50 ng纯化的cDNA，按照制造商的说明使用Illumina DNA Prep试剂盒(Illumina, 美国圣地亚哥)制备RNA-seq文库。该方案包括片段化、片段化后清洗、PCR扩增和索引文库的汇集。使用Qubit™ 4.0荧光计(Thermo Fisher Scientific, 美国罗克福德)确定文库浓度，并使用配备高灵敏度DNA试剂盒的Bioanalyzer™ 2100(Agilent Technologies, 美国圣克拉拉)评估片段大小和摩尔浓度。最终文库标准化至4 nM。按照Illumina NextSeq系统变性与稀释文库指南进行文库变性和稀释。测序在Illumina NextSeq™ 500平台上进行，使用中等输出流动池，根据制造商的标准工作流程，每轮生成约1.3亿簇。
2.5. 生物信息学和数据分析
使用芬兰IT科学中心(CSC)提供的Chipster虚拟平台处理和分析转录组数据。使用FastQC修剪接头序列并评估测序读质量。使用STAR比对器将高质量的双端读数(每个样本1500-2000万)比对到人类参考基因组(GRCh38.95)。使用HTSeq在基因水平上量化比对的读数(BAM文件)。使用Bioconductor的DESeq2包进行差异基因表达分析。将处理组和对照组的标准化计数矩阵结合，计算log2倍数变化。将调整后的p值(padj)≤0.01且绝对log2倍数变化≥1的基因视为显著差异表达。
使用DESeq2标准化的原始基因计数生成层次聚类、热图和树状图。使用ConsensusPathDB对差异表达基因进行超表达分析，整合来自30多个公开数据库的通路。使用Venny 2.1创建显示条件之间差异表达基因重叠的维恩图。对于通路富集和功能注释，使用Enrichr分析显著差异表达基因(padj < 0.01)，以识别来自基因本体论(生物过程、细胞组分和分子功能)、KEGG、Reactome和FerrDb数据库的富集术语。还使用Pathway Commons和STRING等额外通路资源进行功能聚类和相互作用分析。使用ChEA3、JASPAR、EPD-TALDO1和ChIP-Atlas数据库进行转录因子富集和调控网络分析。这些工具使能够识别与差异表达基因集相关的潜在上游转录调控因子和结合基序。
2.6. 统计分析
使用GraphPad Prism 10.1.2版(GraphPad Software, 美国圣地亚哥)进行适当的统计分析。使用Chipster平台内的DESeq2包评估RNA-seq数据的差异基因表达，统计显著性设定为调整后的p值(padj) < 0.01。从剂量反应曲线计算细胞毒性(IC50)值，结果以至少五次生物独立实验的平均值±标准差表示，每次实验均进行三重实验。
3. 结果
3.1. 全局转录组分析揭示PDAC细胞系中GGMSC处理后的独特基因表达变化
为了研究GGMSC的全局转录反应，我们对用500 μM GGMSC处理20小时的CAPAN-2和HPAF-II胰腺癌细胞系进行了RNA测序。主成分分析(PCA)表明两个细胞系中处理样本和对照样本之间存在明显分离，表明GGMSC暴露后发生了显著的转录变化(图1A,B)。在CAPAN-2中，第一主成分(PC1)占方差的89%(图1A)，而在HPAF-II中，PC1解释了82%的方差(图1B)。8小时处理的PCA图也显示了条件之间的明显聚类，尽管解释的方差较低，如补充图S1所示。差异基因表达分析显示了大量显著改变的基因(调整后的p值 < 0.01)(补充文件S1)。在CAPAN-2细胞中，火山图突出了GDF15、HERPUD1、HSPA5、NNMT和CORO1A等基因的上调，而PHF19、PMF1和HMGN2是最显著下调的转录本(图1C)。在HPAF-II细胞中，GGMSC处理导致HOXA3、RASSF3、HNRNPH1、EGR1和BROX等基因的强烈上调，而IDH2、RPUSD3、VGLL4和MDK显著下调(图1D)。在8小时和20小时时间点对差异表达基因的定量比较显示，两个细胞系中转录变化呈时间依赖性增加(图1E,F)。细胞在20小时表现出比8小时更多的差异表达基因(图1E)，HPAF-II中也观察到类似模式(图1F)。
3.2. GGMSC诱导的常见和细胞系特异性基因表达谱
为了评估GGMSC的共享与独特反应，我们使用调整后的p值 < 0.01的严格截止值，确定了8小时和20小时时间点的差异表达基因(DEGs)。表1总结了CAPAN-2和HPAF-II的DEG计数。我们随后关注在20小时处理后两个细胞系中一致改变的代表性基因。选定转录本的条形图显示了明显的细胞系特异性表达模式，ASFlA、LRPAP1和S100A16等基因在两个细胞系中均上调，而IDH2、CFD、GALK1和TMED1等其他基因表现出不同的调控(补充图S2A,B)。我们在两个细胞系中发现了392个共同调控的基因(14.7%重叠)，包括ASF1A、LRPAP1、ERRFI1和LENG8，表明这些可能代表GGMSC反应的核心成分(图2A)。应用额外的log2倍数变化截止值(|log2FC| > 1)精炼了这一列表，得到高置信度DEGs，涉及线粒体代谢、RNA加工和染色质重塑，包括IDH2、RPUSD3、VGLL4、MDK和RAMP1(图2B)。ERRFI1、IDH2、ASF1A、GALK1、S100A16、TMED1、TUBA1B和CFD等12个基因的子集在两个细胞系中表现出协调表达，反映了GGMSC触发的保守转录模块(图2C)。
3.3. GGMSC调控与氧化应激、代谢重编程和染色质调控相关的功能通路
为了揭示转录变化背后的潜在功能机制，我们使用CAPAN-2和HPAF-II在20小时的DEGs进行通路富集分析。显著富集的通路分为应激反应、氧化还原调控、线粒体功能和染色质动力学(表2)。CAPAN-2细胞显示未折叠蛋白反应(UPR)、ER应激和氧化应激信号的强烈激活，KEAP1-NFE2L2和核NRF2靶向通路上调。这些效应伴随着线粒体代谢和铁死亡相关基因表达的增强。相比之下，HPAF-II表现出较温和的应激诱导和铁死亡及谷胱甘肽代谢基因的下调，反映了部分耐药性。GGMSC还在CAPAN-2中抑制了细胞周期和DNA复制程序，与已知抑制组蛋白脱乙酰酶(HDACs)的活性代谢物β-甲基硒丙酮酸(MSP)的作用一致。参与染色体浓缩和组蛋白乙酰化的基因下调支持表观遗传抑制。CAPAN-2细胞还显示出自噬和铁死亡程序的富集，而HPAF-II下调凋亡调节因子，表明生存表型(表2)。
3.4. 转录因子反应反映应激敏感性和耐药性
接下来，我们分析了差异表达的转录因子(TFs)，以了解细胞系特异性调控变化。CAPAN-2上调了与应激相关的TFs，包括DDIT3(CHOP)、ATF4、NFE2L2(NRF2)和BACH1，同时抑制了NFKB1，表明向促死亡、氧化应激驱动的程序转变(表3)。相比之下，HPAF-II上调了HOXA3、HNF4A、CBX3和CHUK，与上皮身份和持续的NF-κB信号传导一致。HPAF-II中DDIT3的下调进一步表明ER应激诱导的凋亡通路减弱(表3)。这些对比的TF特征在补充图S2C中展示，支持一个模型：CAPAN-2激活转录抑制和死亡，而HPAF-II维持生存通路。
3.5. GGMSC在CAPAN-2细胞中诱导代谢应激和铁死亡
我们通过通路对DEGs进行分类，以探索GGMSC对代谢、应激和调控细胞死亡的影响。HPAF-II在糖酵解、PPP、TCA循环和OXPHOS中显示代谢基因的强烈下调，与抑制的能量代谢一致(图2D)。CAPAN-2保留了代谢基因表达，表明线粒体参与(图2D)。包括DDIT3、HIF1A和SLC2A1在内的应激相关转录本在CAPAN-2中高度富集(图3A)。补充图S2D显示额外的氧化应激基因(TXNRD1、GLRX、HMOX1)在CAPAN-2中选择性上调。CAPAN-2还上调了铁死亡诱导因子(ACSL4、CHAC1、ATF4、HMOX1)，而HPAF-II没有(图3B)。对细胞死亡和生存基因的更广泛分析显示，在CAPAN-2中抑制了铁死亡抑制因子(IDH2、ACSL3、HSPA5)并上调了凋亡和促死亡信号(图3C)。HPAF-II反而上调了促生存转录本。其中，ACSL4和CHAC1代表核心铁死亡效应因子，分别直接参与脂质过氧化和谷胱甘肽耗竭，因此最可能与铁死亡执行相关。ATF4和HMOX1虽然强烈上调，但被认为是更广泛的整合应激和抗氧化反应的一部分，可能在铁死亡上游或平行作用，而不是作为直接死亡效应因子。类似地，IDH2和ACSL3的下调移除了对脂质ROS和铁死亡的代谢缓冲，而HSPA5的抑制反映了ER应激参与与铁死亡敏感性的潜在交叉。综合起来，这些变化表明CAPAN-2同时参与直接铁死亡执行程序和汇聚于增强细胞死亡易感性的次级应激通路，而HPAF-II主要维持保护性转录状态。GGMSC还影响了脂质、铁和氨基酸代谢(补充图S3A-C)，CAPAN-2再次显示更强的转录激活。这些结果突显了CAPAN-2中更广泛的代谢脆弱性。
3.6. GGMSC抑制表观遗传和抗氧化程序，同时增强应激信号传导
为了评估GGMSC如何影响染色质和转录调控，我们评估了参与表观遗传重塑、细胞周期控制和NRF2/ATF4信号传导的基因(图4)。CAPAN-2细胞显示染色质重塑因子(SMARCC2、EZH2、DNMT1)、组蛋白修饰因子(ING5、HMGN2、SETD7、KAT6B)和核小体组装基因(ATRX、H2AZ1、ANP32B)的下调(图4A)。细胞周期调节因子，包括细胞周期蛋白(CCNAl、CCNB2、CCND1)、PSMCs(PSMC1至PSMC5)和DNA复制机制(MCM3、MCM4、MCM6、MCM10、PLK2)，在CAPAN-2中受到抑制(图4B)，与生长停滞一致。
CAPAN-2还强烈上调了参与氧化还原平衡、ER应激和氨基酸代谢的NRF2和ATF4靶向基因(HMOX1、GCLC、TXNRD1、SLC7A11、CHAC1、SLC1A5、DDIT3、HERPUD1和PSAT1)(图4C,D)。这些基因在未折叠蛋白反应、氨基酸代谢和铁死亡中至关重要，支持由ER应激和代谢适应塑造的转录程序。相比之下，HPAF-II对这些程序的诱导最小。细胞毒性测定证实CAPAN-2对GGMSC比HPAF-II更敏感，与其应激和死亡激活的转录谱一致(补充图S3D)。这些发现表明GGMSC在CAPAN-2中诱导深刻的代谢、转录和表观遗传应激，而HPAF-II通过保留的抗氧化和增殖信号传导维持耐药性。
4. 讨论
胰腺导管腺癌(PDAC)仍然是最致命的恶性肿瘤之一，5年生存率低于10%，构成了重大的临床挑战，突显了对新治疗策略的迫切需求。PDAC的侵袭性，加上其致密的基质环境和代谢可塑性，导致药物渗透不良和治疗耐药性。鉴于这些障碍，靶向PDAC特有的代谢脆弱点和氧化还原失衡的药物越来越受到关注。
基于硒的化合物，包括硒-L-甲基硒代半胱氨酸(MSC)及其结构类似物，因其调节氧化还原平衡和表观遗传调控的能力而成为有前景的抗癌剂。MSC已被证明可诱导凋亡、抑制组蛋白脱乙酰酶(HDACs)，并使癌细胞对铁死亡和ER应激敏感。GGMSC是MSC的谷氨酰化衍生物，保留了类似的生物活性，但需要更高剂量才能激活，表明代谢处理的差异。尽管关于GGMSC的文献有限，但其与MSC的结构相似性以及红氧化活性和生长抑制的初步报告使其成为进一步研究的有力候选者。支持这一点的是，GGMSC在大鼠模型中已证明抗癌功效，其中它产生了类似MSC的基因表达变化并抑制了肿瘤进展。
在本研究中，我们调查了高剂量GGMSC(500 μM)对两种PDAC细胞系CAPAN-2和HPAF-II的转录组反应，并揭示了其差异敏感性的潜在独特机制。我们的结果表明GGMSC在两个细胞系中都诱导广泛的基因表达变化，CAPAN-2表现出强烈的应激反应和细胞死亡特征，而HPAF-II维持代谢和增殖程序，表明耐药性。
氧化应激、铁死亡和ER应激成为CAPAN-2细胞中GGMSC处理后的关键主题。基于FerrDb和Enrichr通路富集选择了铁死亡相关基因。值得注意的是，由ATF4-CHOP(DDIT3)和NRF2(NFE2L2)通路调控的基因被强烈上调，包括HMOX1、GCLC、TXNRD1和CHAC1。ATF4和NRF2的这种双重激活表明对氧化还原和蛋白质毒性应激的协调反应，与研究表明它们在促进铁死亡和凋亡反应中的协同作用一致。此外，CAPAN-2细胞显示铁死亡诱导因子(例如ACSL4、ALOX5、CHAC1)的上调和铁死亡抑制因子的抑制，表明铁死亡细胞死亡通路的参与。从机制上讲，GGMSC在CAPAN-2中诱导的基因簇与已知的铁死亡、ER应激和代谢重编程调节因子一致。ATF4-DDIT3-CHAC1和NRF2-HMOX1-SLC7A11模块的上调反映了铁死亡执行通路，而糖酵解酶、TCA循环组分和氧化磷酸化基因表达的下调表明线粒体功能障碍。这些模式将GGMSC与主要驱动凋亡或细胞周期停滞的其他硒化合物区分开来，将GGMSC定位为铁死亡和代谢关闭的双重调节剂。此外，CAPAN-2中GGMSC诱导的代谢重编程以糖酵解酶的下调、TCA循环组分的抑制和氧化磷酸化基因表达的降低为标志，表明能量和生物合成限制加剧了氧化还原脆弱性。
相比之下，HPAF-II细胞表现出红氧化应激反应基因的有限诱导，并维持核心代谢和细胞周期调节因子的表达。转录因子HOXA3、HNF4A和CBX3以及NF-κB通路组分CHUK的上调表明更上皮和增殖的表型。HPAF-II中DDIT3(CHOP)的下调和有限的NRF2/ATF4激活可能反映保护性转录程序，缓冲氧化和蛋白质毒性应激。尽管在PDAC中直接证据有限，但低CHOP表达与不良临床结果相关，暗示对ER应激诱导的凋亡的耐药性和受限的NRF2活性可以促进适应性应激反应而不启动细胞死亡。这些机制可能部分解释了HPAF-II对GGMSC的降低敏感性。
GGMSC观察到的许多转录特征与先前报道的MSC相似，包括NRF2和ATF4激活、HDAC抑制以及铁死亡诱导。在我们之前的研究中，较低浓度(250 μM)的MSC在CAPAN-2和PANC1细胞中触发了类似的基因表达模式，暗示hKYAT1介导的生物激活是关键步骤。GGMSC似乎需要更高的浓度和更长的处理时间才能产生类似效果，可能是由于较低的酶裂解效率，表明涉及替代酶的激活。
我们假设GGMSC作为一种前药，被γ-谷氨酰转肽酶(GGT)裂解释放MSC，然后由hKYAT1代谢为甲基硒醇(CH3;SeH)和β-甲基硒丙酮酸(MSP)。尽管该酶级联反应在我们的研究中尚未通过实验验证，但该假设得到与其他γ-谷氨酰硒化合物的类比支持。GGTs众所周知可催化外源化合物和内源化合物(包括谷胱甘肽和GPNA)中γ-谷氨酰键的水解，释放进一步被二肽酶加工的半胱氨酰甘氨酸衍生物，以产生活性代谢物。因此，GGT介导的裂解仍然是GGMSC激活的合理途径。CAPAN-2和HPAF-II之间GGT活性的差异可能有助于其独特的细胞毒性反应。我们提出GGMSC可能由于许多癌症中GGT表达升高而对肿瘤表现出选择性毒性，正常组织中较低的GGT表达可能保护非肿瘤细胞。GGT在许多癌症中频繁过表达，并与肿瘤进展、化疗耐药和不良预后相关。这支持GGMSC激活可能在具有升高GGT活性的肿瘤中增强的假设，可能解释CAPAN-2的更高敏感性。
这些发现具有重要的治疗意义。关键增殖标志物，包括PCNA、MKI67、TOP2A、CHEK1和UBE2C，在GGMSC处理后在CAPAN-2中显著下调。这突显了强大的细胞周期停滞，强化了GGMSC在侵袭性PDAC中抑制增殖的潜力。CAPAN-2的脆弱性提出了这样的可能性：高水平ATF4/NRF2表达或铁死亡敏感性等生物标志物可在未来工作中探索用于患者分层。相比之下，HPAF-II的耐药性表明，进一步的研究可评估GGMSC与NF-κB抑制剂、铁死亡增强剂或染色质调节剂的组合。GGMSC诱导的广泛转录重编程，包括细胞周期基因、表观遗传调节因子和线粒体代谢的抑制，支持其作为多靶点抗癌剂的效用。
除了转录组分析外，代谢组学方法已为癌症相关代谢失调提供了有价值的见解。Soldevilla等人在神经内分泌肿瘤中的综合血浆代谢组学研究证明了代谢重编程在肿瘤学中的诊断和生物学相关性。在今后的工作中，将代谢组数据与转录组特征整合可能进一步阐明GGMSC利用的代谢脆弱性并加强转化相关性。
本研究有几个应予承认的局限性。首先，我们仅研究了两种PDAC细胞系，这可能无法完全捕获胰腺肿瘤的异质性。其次，转录组分析是在相对较高的GGMSC浓度(500 μM)下进行的，反映了这种γ-谷氨酰前药的体外激活需要，但限制了直接的生理外推。第三，虽然我们的RNA-seq分析揭示了稳健的和细胞系特异性的转录重编程，但我们没有进行蛋白质水平或功能验证(例如铁死亡测定或GGT活性测量)。未来在更大细胞系小组、患者来源模型和互补生化测定方面的工作将有必要加强这些发现的机制解释和转化相关性。
从临床角度看，国际指南(NCCN、ESMO、ASCO)推荐基于阶段的、多学科的PDAC管理，系统疗法如改良FOLFIRINOX或吉西他滨/白蛋白结合型紫杉醇作为标准治疗方案，最近NALIRIFOX作为额外的一线选择。建议进行BRCA/PALB2突变、MSI-H/dMMR状态和NTRK融合的分子检测，以指导精准治疗，强烈建议早期整合支持性护理。在这一既定治疗格局中，我们的研究强调GGMSC是一种实验性氧化还原调节策略，可能补充而不是取代现有治疗方法。
总之，我们的转录组分析表明GGMSC通过协调激活氧化还原和应激反应通路，特别是在CAPAN-2中，对PDAC细胞产生强大的细胞毒性效应。差异反应突显了理解细胞背景对治疗优化的重要性，并为探索PDAC中GGMSC的联合治疗提供了依据。
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