摘要
当前缺血性中风治疗聚焦于移除脑血管阻塞血栓，却忽视了随之而来的神经炎症反应。针对脑内浸润外周免疫细胞的临床试验未能改善预后，表明神经炎症机制仍不明确。虽有研究分析了中风后数天至数周的脑免疫细胞及细胞因子谱，但此时段的干预可能已错过脑损伤防治窗口。本研究通过小鼠缺血性中风模型，检测超急性期（3小时）及急性期（24小时）脑免疫细胞组成、细胞因子水平及神经功能障碍。有趣的是，我们在3小时即检测到脑组织炎性细胞因子升高，显著早于24小时出现的中性粒细胞和单核细胞浸润。通过抗体清除或基因改造外周免疫细胞未能减弱神经炎症或改善感觉运动功能。利用Cx3cr1^gfp/+小鼠的活体成像显示，作为脑内固有免疫细胞的小胶质细胞，在中风后超急性期迅速改变形态，并快速上调细胞因子分泌。本研究表明，小胶质细胞是早期神经炎症的关键驱动者，在临床相关时间点调控其功能或可改善中风预后。
引言
缺血性中风导致的脑动脉闭塞使脑组织缺氧缺糖，触发神经元死亡、神经炎症和脑损伤的连锁反应。现有治疗策略聚焦于移除阻塞血栓以恢复脑血流，但尚无针对性调控神经炎症的治疗手段来减轻"可挽救"的缺血半暗带损伤。虽然已有研究分别报道了中风后数天至数周浸润脑组织的多种外周免疫细胞，但缺乏有效治疗策略表明我们对缺血性中风后神经炎症发展机制的认知仍不足。因此，本研究提出通过表征中风超急性期全脑免疫组成及细胞因子水平，为炎症反应启动机制提供新见解。
在稳态条件下，血脑屏障（BBB）作为由内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞组成的神经血管单元，调控循环物质进入脑内。BBB完整性在局部创伤或感染引起的炎症反应中被破坏，导致血管通透性增加和细胞迁移。已有研究证实中性粒细胞在中风患者和实验模型脑组织中的浸润，其炎症活动对脑组织有害。动物模型显示，中性粒细胞在中风后12-24小时开始积聚在血管周围间隙和邻近实质区域，1-3天内更显著浸润脑实质。单核细胞来源的巨噬细胞浸润较慢，通常在48小时后变得明显。人类影像学和脑脊液数据显示类似的延迟浸润，但因样本采集的可变性难以精确定时。阻断外周髓系细胞向脑内募集的治疗策略在小鼠模型中可减少神经炎症，但在再灌注期减少中性粒细胞浸润的临床试验三次失败（EAST、AUSTIN和HALT试验）。事实上，研究显示脑内浸润的中性粒细胞需被小胶质细胞吞噬才能促进炎症消解。据我们所知，超急性期（<6小时）脑免疫组成尚未被表征。基于急性期（6-24小时）脑免疫组成主要由小胶质细胞主导的特性，我们推测超急性期同样如此。显然，需要更深入理解缺血性中风引发的神经炎症，特别是小胶质细胞功能。
作为脑内固有免疫细胞，小胶质细胞广泛分布且能有效监测脑损伤。稳态下，小胶质细胞呈分支状以促进组织监测、碎片清除和神经元修剪。它们是高度动态的细胞，可对创伤产生多样的形态、代谢和功能状态变化，并具备细胞因子分泌能力。细胞因子在中风后驱动神经炎症中起关键作用，但其来源和产生时间仍不明确。本研究旨在检测中风后超急性和急性期脑细胞因子谱，探究脑内浸润免疫细胞或固有细胞是否为这些细胞因子的关键生产者。该时间点具有临床相关性，因与使用重组组织型纤溶酶原激活剂（rtPA）治疗的"治疗窗"一致。NINDS试验显示，rtPA在中风发作3小时内使用疗效最佳。本研究证实，脑内浸润的中性粒细胞和单核细胞并不参与缺血性中风后的炎症启动。事实上，在这些外周髓系细胞浸润之前，脑组织已检测到显著的炎性细胞因子谱。本研究提供证据表明，小胶质细胞是超急性期检测到的主要炎性细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的主要来源，在临床相关时间点调控其功能或可改善中风恢复。
方法学
小鼠
使用7-10周龄雄性C57BL/6J小鼠（澳大利亚莫纳什健康转化医学中心饲养），环境温度湿度可控（12小时光暗循环），食物和水自由获取。小鼠在使用前适应环境≥7天。Cx3cr1^gfp/+小鼠通过Cx3cr1^gfp/gfp小鼠与C57BL/6J小鼠杂交获得。所有实验符合澳大利亚法律（1986年维多利亚防止虐待动物法），并经莫纳什医疗中心动物伦理委员会批准（MMCB/2021/32）。
中风模型
光化学血栓模型按既往方法建立。简言之，小鼠腹腔注射玫瑰红（20 mg/kg）后，用异氟烷麻醉，固定于立体定向仪，去毛后在顶骨平面做1cm切口暴露颅骨。玫瑰红注射10分钟后，将直径1500μm的光纤置于体感皮层（前囟后1mm，中线右侧2mm），用532nm冷激光照射15分钟。照射后缝合伤口，小鼠苏醒后置于保温垫恢复。假手术组除激光照射外操作相同。
血管完整性检测
中风后不同时间点检测血管完整性。小鼠腹腔注射麻醉剂（氯胺酮150 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg）后，静脉注射伊文思蓝染料（80 mg/kg）或70kDa葡聚糖-罗丹明B（20 mg/kg），允许循环10分钟后经心脏灌注冰PBS。伊文思蓝染色脑组织在颅骨去除后冠状切片（2mm），用ImageJ量化阳性区域。70kDa葡聚糖样本在同侧和对侧脑组织中匀浆，离心后用Tecan读板机检测罗丹明荧光。
梗死体积检测
每210μm间隔采集30μm冠状切片，0.1%硫堇染色可视化组织死亡。用ImageJ测量梗死体积。
水肿体积检测
使用Bruker 9.4T动物MRI扫描仪生成T2加权脑扫描。麻醉小鼠（1%异氟烷），使用Bruker 86mm发射线圈和单通道头线圈，参数：TE/TR=36ms/7000ms，RARE因子=8，视野=16.8×16.8mm²，切片数=26，厚度=0.5mm，矩阵=168×168，平均4次，方位轴向。用Mango v4.1分析图像。
神经功能评估
粘性胶带移除测试：实验终点时，将小鼠置于透明测试箱（22.5×16×10.5cm）适应5分钟。固定小鼠，在双前肢掌部粘贴3mm红色（右肢）和绿色（左肢）胶带。记录180秒内小鼠首次用口鼻接触胶带（检测）和完全移除胶带（移除）的时间。悬线测试：小鼠抓住40cm高悬线后，记录180秒内坠落时间，三次测试取平均值。
外周髓系细胞清除
小鼠在光化学中风前后24h和1h腹腔注射抗-Ly6C/Ly6G抗体（10mg/kg）或IgG2b同型对照。通过流式细胞术分析全血中性粒细胞和单核细胞数量验证清除效果。
脑组织炎性细胞因子检测
中风后3h和24h，小鼠麻醉后经心脏灌注PBS。脑组织（去除小脑）称重后，在含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀浆离心，上清液用LEGENDplex小鼠炎症面板检测。
流式细胞术
脑组织经30%/80% Percoll梯度离心后，用流式细胞术分析。具体步骤包括：FVS780染色活细胞，阻断非特异性结合后，用荧光抗体标记表面蛋白，固定破膜后检测胞内蛋白。使用Aurora光谱流式细胞仪获取数据，SpectroFlo软件解混，FlowJo v10.1分析。
免疫组化
脑组织在4%多聚甲醛和20%蔗糖中固定后，30μm切片，阻断后与一抗（1:100）孵育过夜，荧光二抗（1:500）标记，DAPI复染后用Olympus VS120滑动扫描仪成像。
显微镜及图像分析
双光子显微镜：Cx3cr1^gfp/+小鼠30μm切片在Olympus FVMPE-RS上采集图像。活体双光子显微镜：Cx3cr1^gfp/+小鼠麻醉后行颅骨减薄，在Olympus FVMPE-RS上采集图像。用Imaris v10.2进行形态学分析。
统计分析
使用Prism 10进行分析。数据正态性经Shapiro-Wilk检验，离群值经Grubb's检验（α≤0.05）排除。数据以均数±标准差表示，显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns无显著性差异。
结果
中风引发脑血管完整性快速丧失和运动功能障碍
光化学中风模型在皮层微血管生成可重复的类腔隙性梗死。玫瑰红注射后，用冷激光（532nm）照射初级运动皮层（前囟后1mm，中线右侧2mm）。中风后3小时梗死体积为2.7±0.6 mm³，24小时发展至15.2±4.0 mm³。血管完整性在中风30分钟内丧失，表现为伊文思蓝和罗丹明B葡聚糖（70kDa）渗入脑实质，且随着时间推移加剧。脑重量在24小时增加10%，MRI显示脑水肿明确界定的局部体积增加。
临床数据显示，30%缺血性中风幸存者存在永久性残疾。通过粘性胶带移除测试（评估感觉运动缺陷）和悬线测试（评估运动功能）发现，左肢（对侧）胶带检测和移除时间与右肢或假手术组无差异，表明24小时后感觉功能未受损。然而，中风3小时后悬线测试显示运动功能严重受损（73.8%），24小时后仍显著（81.5%）。
中风后炎症信号早于外周免疫细胞浸润
通过量化灌注脑匀浆中炎症细胞因子，发现在缺血核心区域，IL-1α、IL-1β和TNF-α浓度在3小时显著升高，24小时维持或进一步增加。IL-6在24小时升高，但3小时与假手术组无差异。流式细胞术显示，IL区域中性粒细胞（CD45hiCD11b+Ly6G+）在3小时轻度增加，但较24小时10倍增加仍属可忽略。单核细胞和单核细胞来源的巨噬细胞（mono-macs）在3小时轻度增加，24小时分别增加5和8倍。小胶质细胞数量无明显变化。通过中性粒细胞报告小鼠（CatchupIVM-red）观察到3小时后中风区中性粒细胞极低，24小时后在梗死核心及周边区域增加。
调控外周免疫细胞不改善急性期中风结局
抗-Ly6C/Ly6G抗体成功清除外周中性粒细胞（99.9%）和单核细胞（79.1%）。24小时后，缺血核心IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α浓度升高，但外周髓系细胞清除小鼠与对照组无差异。悬线测试亦无改善，表明清除外周髓系细胞不影响实验性中风结局。
进一步通过CCR2缺陷小鼠（Ccr2^rfp/rfp）研究单核细胞募集对神经炎症的影响。Ccr2^−/−小鼠中性粒细胞、单核细胞和mono-macs在24小时无明显浸润。脑匀浆细胞因子谱和运动功能与野生型无差异，表明外周髓系细胞不贡献于实验性中风后24小时的神经炎症或神经功能障碍。
小胶质细胞通过形态重塑快速响应中风
中风后3小时，IL区域小胶质细胞数量减少61.2%，细胞体体积增加，突起数量和复杂度降低。24小时后，周边区域也出现类似变化。双光子显微镜显示，3小时后小胶质细胞突起显著减少，细胞体增大，24小时后几乎完全消失。假手术组无形态差异。
小胶质细胞和神经元负责超急性期炎症因子产生
通过分离CD45midCX3CR1+小胶质细胞、CD45loCX3CR1−GLAST-1+星形胶质细胞、CD45loCX3CR1−CD31+内皮细胞、CD45loCX3CR1−PDGFRβ+周细胞和CD45loCX3CR1−NeuN+神经元发现：星形胶质细胞、内皮细胞和周细胞的IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α产生无明显变化。神经元显示IL-1β（增加34%）、IL-6（20%）和TNF-α（31%）轻度升高，而小胶质细胞IL-1β（50%）、IL-6（44%）和TNF-α（30%）显著上调。IL-1α在神经元和小胶质细胞中表达降低，推测其已原位释放。
讨论
本研究首次系统阐明缺血性中风超急性期炎症反应机制。现有观点认为外周免疫细胞是神经炎症主要驱动者，但阻断其浸润的临床试验未能获益。本研究发现，3小时已存在显著炎性细胞因子，且清除外周髓系细胞无法改善结局。相反，小胶质细胞在超急性期即通过形态重塑和细胞因子分泌启动神经炎症。
已有证据表明，小胶质细胞在感染性神经炎症中具有宿主保护功能，但在缺血性损伤中的作用存在争议。通过比较永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型和光化学模型，发现小胶质细胞在不同损伤模式中作用相异。本研究支持小胶质细胞介导光化学模型超急性期炎症，而MCAO模型中其可能通过吞噬损伤相关分子模式（DAMPs）抑制炎症。
值得注意的是，本研究显示小胶质细胞形态和细胞因子分泌变化早于经典激活标志物（CD80、MHC-II、CD206）改变，表明二元M1/M2分型的局限性。血脑屏障破坏释放的DAMPs如S100A8、血红素、HMGB1和纤维蛋白原，通过小胶质细胞膜上P2X7受体、RAGE、Mac-1和TLRs激活炎症反应。靶向脑-血管-免疫接口可能成为减弱神经炎症、挽救半暗带的新策略。
本研究存在局限性：1）小胶质细胞清除策略的特异性问题；2）未区分不同小胶质细胞亚群；3）实验模型与人体病理生理差异。未来研究需结合单细胞"组学"方法明确异质性及胶质细胞早期响应机制。
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