摘要
目的
过度黑色素生成导致各种色素沉着障碍，而涉及酪氨酸酶抑制和抗氧化活性的策略对于调节此过程至关重要。
方法
本研究设计并合成了CV5，一种短头对尾环状肽，并评估了其结构特征和生物活性。
结果
CV5表现出优异的生物相容性（纯度>98%，无细胞毒性），其酪氨酸酶抑制活性比熊果苷高约1.6倍（IC₅₀: 336.7 ± 5.79 µM），在DPPH和ABTS自由基清除实验中，其抗氧化效果分别比两个对照组高出1.6倍和1.8倍（IC₅₀: 30.27 ± 1.06 µM, 282.4 ± 11.45 µM）。分子对接分析证实了其与酶活性位点相互作用的潜力。
结论
这些结果表明，基于天然酰胺的环化策略可以克服含非天然骨架拟肽的生物相容性和代谢限制，并验证CV5作为治疗色素沉着障碍和促进皮肤健康的潜在候选物。
引言
过度黑色素的生成和积累导致各种皮肤状况，如黄褐斑、老年斑和炎症后色素沉着；这些色素沉着障碍不仅仅是美容问题，还需要治疗干预（Shenoy和Madan，2020；Markiewicz等，2022；Kashetsky等，2024）。在黑色素生物合成过程中，酪氨酸酶是参与限速步骤的关键酶，通过氧化L-酪氨酸启动黑色素生成的早期阶段（Zolghadri等，2019；Kipouros等，2022）。因此，调节酪氨酸酶活性被认为是有效抑制黑色素生成的主要策略（Kang等，2025；Khongkarat等，2024）。此外，抗氧化剂已被报道在减轻与年龄相关的生理损伤和维持皮肤健康方面发挥关键作用。这指的是保护身体免受自由基和氧化物质的能力，而自由基清除能力被用作评估此抗氧化活性的主要指标（Hussen等，2025；Tumilaar等，2024）。
DPPH（2,2-二苯基-1-苦肼基）自由基清除活性是一种代表性的抗氧化测定方法，它基于样品的电子或氢供体能力稳定自由基，广泛用于评估化合物的抗氧化特性（Brand-Williams等，1995；Mishra等，2012；Prior等，2005）。此外，ABTS [2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]自由基清除活性是一种通过测量ABTS⁺自由基阳离子还原程度来评估抗氧化活性的方法，其优点是适用于亲水性和疏水性物质（Çelik等，2010）。通过这一机制，酪氨酸酶抑制和抗氧化活性被用作功能性化妆品和皮肤病药物开发中的重要评估指标（Hussen等，2025；Zolghadri等，2019）。
近年来，人们对基于不同机制同时表现出两种或更多功能的双功能材料越来越感兴趣，而非仅具有单一生物活性属性的材料。特别是，同时具有抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性的材料被视为促进皮肤健康和开发功能性化妆品的有前途的多功能平台，因为它们可以分别独立调节活性氧引起的氧化损伤和酶促色素沉着（Rischard等，2025；Kim和Kim，2025）。
尽管最近已报道具有酪氨酸酶抑制和抗氧化活性的肽基化合物（Yu等，2025；Li等，2024；Chang等，2025；Zhuang等，2025），但传统肽类由于容易受到蛋白水解酶的作用和结构灵活性的限制，表现出低稳定性和生物利用度，限制了它们作为治疗剂的应用（Al Musaimi等，2022；Li等，2025）。为解决这些问题，已提出了使用经过修饰肽结构的拟肽（peptidomimetics）策略（Pereira等，2024；Liu等，2025）。拟肽是指设计用于模拟天然肽的结构和生物功能同时改善药理学特性的分子，如增加半衰期和提高酶选择性（Khongkarat等，2024；Lenci和Trabocchi，2020）。特别是，已利用各种化学修饰策略，包括引入非天然氨基酸、主链修饰和环化，以改善肽的药理学特性（Li Petri等，2022；Sharma等，2024；Matsson和Kihlberg，2017）。
其中，非天然氨基酸的引入和主链修饰是提高肽的酶稳定性和结合亲和力的有力策略（He等，2025；Zhou和Obexer，2024），但它们存在合成复杂性增加、成本高、难以预测构效关系以及生物相容性和代谢方面的不确定性等局限性（Li等，2025；Zhang等，2025）。此外，改变酰胺键本身的主链修饰可能会降低肽的结构灵活性，可能阻碍其与靶蛋白的相互作用（Wang等，2021），而提高这种稳定性的策略反而可能导致体内积累和药代动力学问题（He等，2025；Ding等，2020）。
同样，使用非天然连接剂或人工键的环化策略也可能由于额外的化学修饰而产生生物相容性和代谢问题（Bechtler和Lamers，2021；He等，2022；Karami等，2023）。然而，基于酰胺键的头对尾环状肽完全由天然酰胺主链组成，因此在代谢和毒性方面被认为接近天然肽（Agouram等，2021；Costa等，2023；Jiang等，2024）。不过，这种基于酰胺的环化也可能存在环形成过程中反应效率低、寡聚化和二聚体形成以及取决于环大小的结构约束等问题；因此，优化高效的环化条件至关重要。
同时，即使确保了结构稳定性，肽类在药物递送和吸收方面仍然存在局限性。分子量和极性高的多肽具有有限的细胞通透性，而且在某些情况下，随着分子量的增加（高于700 Da），被动通透性会急剧下降（Matsson和Kihlberg，2017；Wang等，2019a，2019b）。此外，口服生物利用度低是一个限制因素，需要依赖注射给药（Liu等，2025；Xiao等，2025）。因此，短环状肽有望克服这些局限。
本研究设计并合成了环状CSYRV（环状Cys-Ser-Tyr-Arg-Val，命名为CV5），它具有酪氨酸酶抑制和自由基清除活性。CV5是基于胶原衍生序列设计的，考虑了功能和结构特性。Tyr与抗氧化活性和酪氨酸酶抑制相关（Yap和Gan，2021；Kim等，2024），而Cys可以参与氧化还原反应（Meng等，2021；Garrido Ruiz等，2022）。此外，Ser通过氢键增强溶解度和相互作用（Ranka和Deamer，2021；Liu等，2023），而Arg和Val分别通过静电和疏水相互作用提高结构稳定性（Lorenz-Ochoa等，2025）。这种设计旨在即使在短序列中也能诱导有效的生物活性。
在本研究中，作为设计的拟肽策略的一部分，旨在在不显著改变肽的固有化学结构的情况下赋予结构稳定性，本研究选择了基于酰胺的头对尾环化，以最小化人工修饰可能引起的潜在干扰。此外，通过应用利用短序列环化来实现结构稳定性和低分子量环状肽的策略，我们旨在识别有前景的治疗候选物。
材料和方法
细胞系
小鼠巨噬细胞系RAW 264.7从韩国细胞系库（KCLB，首尔，韩国）获得，并用于本研究。
试剂
肽合成和化学分析所需的样品购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）或东京化学工业（日本东京），而树脂和氨基酸则购自GL Biochem（中国上海）。使用EZ-CYTOX试剂（EZ-1000，Daeil Lab，韩国）测量细胞活力。
仪器
使用配备2998 PDA检测器的Waters 2545四泵模块进行合成肽的纯化。分析使用配备Waters e2695分离模块的高效液相色谱（HPLC）系统进行，该系统配备2998 PDA检测器（Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德）。肽HPLC分析的数据采集和处理使用Empower 3.0软件（Waters Corp.）进行。
此外，本研究使用了微天平（ARG4202，OHAUS Corp.，美国新泽西州帕西帕尼）、微孔板多模式阅读器（Synergy HTX，Bio-Tek Instruments，美国佛蒙特州威努斯基）、超低温冷冻箱（JSS-700 C，JS Research Inc.，韩国公州）和冻干机（FDB50B，IlShinBioBase Co.，Ltd.，韩国东斗川）。
固相肽合成
使用从GL Biochem（中国上海）购买的2-氯三苯甲基氯树脂（CTC，1.00 mmol/g）进行固相肽合成（SPPS）。
树脂溶胀
将CTC树脂在室温下用二氯甲烷（DCM）溶胀30分钟。将溶胀的树脂在减压下干燥以除去溶剂，并用DCM洗涤三次，为后续偶联反应做准备。
线性CV5的合成
使用CTC树脂和Fmoc保护的氨基酸进行肽合成。为了将第一个氨基酸连接到树脂上，在DCM溶液中进行了4小时的偶联反应，其中含有Fmoc-Val-OH（2 eq）和N,N-二异丙基乙胺（DIEA，5 eq）。随后，用DCM:MeOH:DIEA（15:3:2，v/v/v）溶液处理样品两次，每次10分钟，以封闭未反应的位点，然后使用第2.4节中描述的方法去除Fmoc。在第二次偶联反应中，Fmoc-Arg(Pbf)-OH（2 eq）与1-羟基苯并三唑水合物（HOBt）、DIEA（5 eq）和N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC，3 eq）在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中于室温下反应4小时，并进行Kaiser测试以确认反应完成。用DMF:乙酸酐:DIEA（8:1:1，v/v/v）溶液处理未反应的氨基基团10分钟以进行封闭。使用第2.4节中描述的方法去除Fmoc基团。在第三次偶联反应中，使用Fmoc-Tyr(tBu)-OH（2 eq）；在第四次偶联反应中，使用Fmoc-Ser(tBu)-OH（2 eq）；在第五次反应中，使用Fmoc-Cys(Trt)-OH（0.6 M，2 eq），在上述相同条件下进行反应。
Fmoc脱保护
为了去除Fmoc保护基，将树脂用20%哌啶/DMF溶液处理两次，每次10分钟，然后为后续偶联反应做准备。
侧链保护的线性肽切割
为了促进高效环化并最小化侧链的潜在副反应，在从树脂上切割线性肽时应用了保留侧链保护基的条件。为此，使用三氟乙酸（TFA）/DCM（1:99，v/v）溶液进行切割反应，每0.5 g树脂使用12 mL溶液，并进行总共1小时30分钟的反应（30分钟×3个循环）。
反应后，在减压下过滤以除去树脂，将得到的滤液加入到异丙基醚（IPE，66 mL）中以诱导沉淀，得到白色固体的线性肽（CSYRV）。将所得肽通过冷冻干燥干燥。
头对尾环化
为了抑制分子间寡聚形成并促进分子内环化，环化反应在高稀释条件下进行。将保留侧链保护基的线性肽CSYRV溶解在DMF中，稀释至最终浓度为0.5 mM，并在氮气氛围下进行反应。
随后，加入六氟磷酸氮杂苯并三唑四甲基脲（HATU，1.1 eq）作为偶联试剂，DIEA（4 eq）作为碱以诱导头对尾分子内环化。将反应混合物在室温下搅拌，并在4小时间隔监测反应进展。
总共12小时后，终止反应；将反应混合物在减压下部分浓缩，并通过加入过量IPE沉淀产物，随后收集。
侧链脱保护
将保护的环状肽用TFA/三异丙基硅烷（TIPS）/H₂O（95:2.5:2.5，v/v/v）混合物在室温下处理1小时以去除侧链保护基。反应后，向反应混合物中加入过量IPE以沉淀产物，然后通过离心收集。随后使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化产物，最终获得所需的环状肽CSYRV（CV5）。
HPLC纯化
使用配备YMC-Pack ODS-A-HG C18反相柱（250×20 mm I.D.，10 μm，30 nm，YMC，日本京都）的HPLC系统（Waters 2545四元梯度模块配备Waters 2998 PDA检测器）进行半制备HPLC纯化。流动相由含0.1% TFA的超纯水（流动相A）和含0.1% TFA的HPLC级乙腈（流动相B）组成。流速设定为20 mL/min，初始流动相组成为95% A和5% B。详细的梯度条件见补充表S1。
HPLC分析
使用配备XBridge C18反相柱（4.6×250 mm，5 μm，Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德）和Waters 2998光电二极管阵列检测器（PDA，Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德）的HPLC系统（Waters e2695分离模块）进行分析HPLC。流动相与纯化中使用的相同。流速设定为1 mL/min，初始条件为A 95%/B 5%。详细的梯度条件见补充表S2。
MALDI-TOF-MS
使用autoflex maX MALDI-TOF/TOF质谱仪（Bruker Daltonics，德国不莱梅）进行分子量分析，以确认肽的成功合成。该仪器配备了Smartbeam II激光器（355 nm）。
对于分析，将1 mg CV5样品溶解在100 μL溶剂中[0.1% TFA在H₂O和0.1% TFA在ACN（1:1，v/v）]。基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）的饱和溶液[TA50: 0.1% TFA在H₂O/0.1% TFA在ACN（1:1，v/v）]。样品和基质以1:1（v/v）的比例混合，点在MALDI靶板上，干燥，然后分析。
在正离子反射模式下采集质谱。激光功率设定为35-40%，激光频率设定为2000 Hz。离子源1和离子源2的电压分别设定为19 kV和16.8 kV，脉冲离子提取时间设定为110 ns。通过累积500次激光射击，在m/z范围300-4000内采集质谱。
使用FlexAnalysis软件（版本3.4，Bruker Daltonics）进行肽峰数据处理。使用肽校准标准（Bruker Daltonics）进行外部校准，校准标准包括血管紧张素II（MH⁺ = 1046.5418）、血管紧张素I（MH⁺ = 1296.6848）、P物质（MH⁺ = 1347.7354）、缓激肽（MH⁺ = 1619.8223）、ACTH片段1-17（MH⁺ = 2093.0862）、ACTH片段18-39（MH⁺ = 2465.1983）和生长抑素28（MH⁺ = 3147.4710）。
细胞培养
在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM中，在5% CO₂的培养箱中，将RAW 264.7小鼠巨噬细胞培养在100 mm细胞培养皿中。将汇合的细胞使用细胞刮刀进行传代以维持。
RAW 264.7中的细胞活力测定
活细胞中的线粒体存在脱氢酶，可将水溶性四唑盐-1（WST-1）生成显色产物甲臜。通过测量该产物，可以确定活细胞的数量。
将RAW 264.7细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔细胞培养板中，并在DMEM中培养24小时。然后将培养基替换为含有不同浓度测试样品的DMEM，并将细胞进一步培养24小时。
培养后，加入EZ-CYTOX试剂，并在450 nm处测量吸光度以确定细胞活力，根据公式（1）计算。
细胞活力（%） = （处理细胞的吸光度 / 对照细胞的吸光度） × 100
酪氨酸酶抑制测定
将样品和阳性对照β-熊果苷稀释至不同浓度。向100 μL 0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中加入10 μL样品，然后加入10 μL蘑菇酪氨酸酶（1500 U/mL）和20 μL L-酪氨酸（1.5 mM）。将反应混合物在37°C下孵育10分钟，并在490 nm处测量吸光度。根据公式（2）计算结果。
酪氨酸酶抑制（%） = 100 - （(b - b') / (a - a')） × 100
a: 反应后标准溶液的吸光度。b: 反应后样品溶液的吸光度。a'、b': 用缓冲液代替蘑菇酪氨酸酶后测得的吸光度。
DPPH自由基清除测定
将样品和阳性对照抗坏血酸稀释至不同浓度；将12.5 μL样品加入50 μL乙醇中，然后加入62.5 μL 0.1 mM DPPH。将混合物在4°C黑暗中反应30分钟。在520 nm处测量吸光度以评估DPPH自由基清除活性。根据公式（3）计算结果。
DPPH自由基清除活性（%） = 100 - （(b - b') / (a - a')） × 100
a: 反应后标准溶液的吸光度。b: 反应后样品溶液的吸光度。a'、b': 使用缓冲液代替0.1 mM DPPH测得的吸光度。
ABTS自由基清除测定
将样品和阳性对照抗坏血酸和Trolox稀释至0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中的不同浓度。加入10 μL样品后，加入20 μL过氧化物酶应用溶液和170 μL ABTS工作溶液。将混合物在室温黑暗中反应6分钟，并在414 nm处测量吸光度，根据公式（4）计算。
ABTS自由基清除活性（%） = 100 - （(b - b') / (a - a')） × 100
a: 反应后对照溶液的吸光度。b: 反应后样品溶液的吸光度。a'、b': 使用缓冲液代替ABTS工作溶液测得的吸光度。
数据分析和统计评估
生物活性测定重复三次进行，结果表示为平均值±标准差（平均值±SD）。使用单因素和双因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后进行Dunnett多重比较检验以评估对照组和各处理组之间的显著性。p值小于0.05（p < 0.05）被认为具有统计学意义。使用GraphPad Prism 8（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行统计分析和图表生成。
分子对接模拟
从RCSB蛋白质数据库（ ID: 2Y9X），并从PubChem数据库（ CID: 3840）。此外，从RCSB蛋白质数据库的配体数据库中获取在酪氨酸酶抑制测定中用作阳性对照的熊果苷（配体ID: 7OQ）（ 8.0 Ultra将肽结构转换为三维结构。
使用Molegro Virtual Docker（MVD，版本6.0）进行分子对接模拟。对接位点基于配体结合位置定义，坐标设定为x = -10.04 Å，y = -28.70 Å，z = -43.44 Å，半径为15 Å。对接评分表示配体和受体之间的结合能，负值越大（即绝对值越大）表示结合越强、越稳定。
为每个配体生成10个构象，并选择具有最低对接评分（即最负值）的排名最高的构象作为最终结合构象。使用Discovery Studio Visualizer 2025 Client以2D和3D形式可视化所选构象。
结果和讨论
CV5肽的结构
环状肽CV5通过将由Cys-Ser-Tyr-Arg-Val组成的线性肽的N端和C端通过酰胺键连接而合成。CV5的二维分子结构如图1a所示。此外，成功合成了用于比较活性分析的线性肽。（补充图S1）
MALDI-TOF质谱分析
使用MALDI-TOF质谱确认了合成的环状肽CSYRV的分子量。理论分子量计算为608.63 Da，观察到609.2 m/z处的主峰，对应于肽的[M+H]⁺离子（图1b）。
此外，631.1 m/z和647.1 m/z处的峰分别归因于[M+Na]⁺和[M+K]⁺加合离子。同时，m/z 798.2处观察到的峰归因于基质相关加合离子（[M+CHCA+H]⁺），源自MALDI-TOF分析中使用的CHCA，这在MALDI测量中常见（Beavis和Chait，1996）。
这些结果证实了合成的CSYRV肽与预期分子量匹配，证明了环状肽CV5的成功合成。原始MALDI-TOF质谱数据见补充图S2。
分子量为608 Da可以为拟用于皮肤局部应用的肽材料提供有利的物理化学特性。根据经皮药物递送领域广泛引用的"500道尔顿规则"，分子量为500 Da或更小的化合物被认为更可能有效穿透皮肤屏障（Bos和Meinardi，2000；Chatterjee等，2022；Souto等，2022）。尽管CV5（608 Da）的分子量略高于此标准，但与分子量从数千到数万Da的典型蛋白质或长链肽相比，它是一种相对较小的环状肽。因此，CV5预计相比大分子生物分子具有有利于皮肤屏障穿透的结构特征。
此外，据报道，通常由四个或更少氨基酸组成的短环状肽往往由于高环应变和空间位阻而表现出降低的环化反应效率或增加的副产物形成（Chen等，2024）。相比之下，CV5由五个氨基酸组成，设计为允许环化反应顺利进行，同时保持相对较小的分子量和结构稳定性。这些结果表明，CV5是一种在合成效率和分子大小之间取得平衡的环状肽。
CV5纯度分析
通过HPLC分析确认了纯化CV5的纯度。在酰胺键表现出强吸收的210 nm和230 nm处检测肽，并在约16分钟处观察到明显的单峰。在两个波长下，CV5的纯度分别为98.5%和99.1%，表明在两个波长下均具有超过98%的高纯度（图1c）。此外，没有观察到显著的杂质峰。详细色谱图见补充图S3。此外，环状CV5比线性CV5具有更长的保留时间（16.96分钟对比15.81分钟），表明环化后肽的极性降低（图1d）。这种变化可能是由于环化后肽的极性降低，因为酰胺键的形成伴随着水分子的损失。降低的极性增强了与C18固定相的疏水相互作用，导致洗脱延迟。
细胞活力
使用RAW 264.7巨噬细胞进行安全性评估的细胞活力测量。使用WST-1测定法评估细胞活力，该方法基于活细胞中线粒体脱氢酶将WST-1还原为甲臜。实验结果表明，CV5在浓度高达约657 ± 2.72 µM（n = 3）时表现出无细胞毒性，细胞活力保持在90%以上（图2a）。这些结果表明，CV5在非毒性条件下表现出生物活性。详细的细胞活力原始数据见补充表S3。此外，线性CV5在10.27-657.21 µM范围内显示出超过90%的细胞存活率，证实了其无毒性。这些结果和原始数据见补充图S4和补充表S4。
酪氨酸酶抑制活性
通过酪氨酸酶抑制测定评估了合成的CV5的美白活性，使用已知的酪氨酸酶抑制剂熊果苷作为阳性对照（补充图S5）。结果显示，CV5在浓度范围约为41-1,314 µM内表现出统计学上显著的（p < 0.05）浓度依赖性酪氨酸酶抑制活性增加（图2b）。
特别是，CV5的IC₅₀值为336.7 ± 5.79 µM（n = 3），比阳性对照熊果苷（535.7 ± 6.91 µM，n = 3）高出约1.6倍（图2c）。在最高浓度1314 ± 0.55 µM（n = 3）下，CV5表现出约95%的抑制率，确认了其强效的酶抑制活性。
此外，这种抑制活性在未检测到细胞毒性的浓度范围内观察到，表明CV5的疗效归因于酶抑制而非非特异性细胞损伤。这些结果证明了CV5作为改善色素沉着相关病理状况的治疗候选物的潜力。详细的原始数据见补充表S5和S6。
此外，线性CV5肽的酪氨酸酶抑制活性在1154 ± 38 µM浓度下约为53%。相比之下，环状CV5肽的IC₅₀值测量为336.7 ± 5.79 µM，显示出比线性肽高约3.4倍的酪氨酸酶抑制活性。这些结果表明，环形成导致的结构约束可能有助于CV5的增强酪氨酸酶抑制活性。详细结果和原始数据见补充图S6和补充表S7。
DPPH自由基清除活性
使用DPPH自由基清除测定评估了合成的CV5的抗氧化活性，以抗坏血酸作为阳性对照（补充图S7）。结果显示，CV5在5-329 µM范围内表现出统计学上显著的（p < 0.05）浓度依赖性自由基清除活性增加，在329 ± 1.09 µM（n = 3）下观察到约86%的清除活性（图2d）。此外，IC₅₀值确定为30.27 ± 1.06 µM（n = 3）。这些结果表明，CV5是一种具有自由基清除特性的抗氧化剂，有可能保护皮肤免受氧化损伤并有助于维持皮肤稳态。详细的原始数据见补充表S8和S9。
此外，线性CV5在相同浓度范围内表现出高达36%的DPPH自由基清除率——导致IC₅₀值无法计算，而环状CV5表现出30.27 ± 1.06 µM的IC₅₀值。这些结果表明，环形成导致的结构约束可能稳定了肽的构象，从而增强了其与自由基的相互作用。这表明环形成可以是增强肽抗氧化活性的有效策略。详细结果和原始数据见补充图S8和补充表S10。
ABTS自由基清除活性
使用ABTS自由基清除测定进一步评估了合成的CV5的抗氧化活性，以抗坏血酸（图3a）和Trolox（图3b）作为阳性对照。结果表明，CV5在41-1314 µM范围内表现出统计学上显著的（p < 0.05）ABTS自由基清除活性浓度依赖性增加（图3c），在1314 ± 0.03 µM（n = 3）下表现出约95%的清除活性。此外，IC₅₀值确定为282 ± 11.45 µM（n = 3）。特别是，与阳性对照抗坏血酸（445 ± 1.31 µM，n = 3）和Trolox（510 ± 1.82 µM，n = 3）相比，其IC₅₀值分别约低1.6倍和1.8倍（图3d）。这些结果表明，CV5具有通过其抗氧化活性减轻各种年龄相关氧化变化的潜力。
相比之下，关于线性CV5的ABTS自由基清除活性，在浓度增加时，在初始和中间浓度范围内观察到比环状CV5更高的活性。在线性浓度范围内相似浓度（41.06-164.27 µM）下，线性肽表现出比环状肽更高的自由基清除率，其IC₅₀值也较低，约为236.03 ± 23.76 µM，而环状肽为282.4 ± 11.45 µM。这些结果被认为归因于线性结构固有的高结构灵活性。
然而，在最高浓度范围内观察到相反的趋势。当线性CV5在1276.47 ± 1.96 µM下表现出87.08%的清除率时，环状CV5在1314.23 ± 0.03 µM下记录了更高的94.51%清除率。这被解释为：虽然线性肽由于高浓度下分子间相互作用增加导致的聚集限制了某些活性位点的暴露，从而在其清除功效上达到平台期，但环状肽即使在高浓度下也由于其强空间约束而保持结构稳定性，从而充分发挥其最大的热力学清除能力（Zai等，2021；Mourenza等，2023）。线性CV5的详细图表和原始数据见补充图S9和补充表S11。
分子对接模拟
酪氨酸酶是一种铜依赖性氧化酶，在黑色素生物合成中起关键作用，是美白化妆品的靶点。进行了分子对接研究以调查合成的CV5与酪氨酸酶活性位点之间的结合相互作用。
对接评分表示配体和受体之间的结合能，负值越大表示结合越强、越稳定（Jakhar等，2020）。CV5表现出最低的MolDock评分-129.49 kcal/mol（表1），表明在本研究使用的对接条件下，其与酪氨酸酶活性位点的预测相互作用有利。此外，Rerank评分和氢键能量分别确定为-98.16和-7.09 kcal/mol。相比之下，用作酪氨酸酶抑制测定阳性对照的曲酸和熊果苷表现出MolDock评分分别为-69.44和-90.27 kcal/mol，Rerank评分分别为-64.10和-76.52 kcal/mol，氢键能量分别为-4.48和-6.16 kcal/mol（表1）。在本研究使用的对接条件下，CV5表现出比曲酸和熊果苷更有利的对接评分。最终构象基于对接评分和关键相互作用的视觉检查进行评估。如图4所示，CV5与几个氨基酸残基形成非共价相互作用并表现出稳定结合。
首先，Ser282和His244等极性残基与肽形成常规氢键。此外，Gly281和His263形成碳氢键，有助于结合稳定性（图4a）。
此外，观察到与Phe264残基的π-π堆积相互作用，表明通过芳环相互作用增加了结合稳定性。通过与Val283、Pro284和Ala286的π-烷基和烷基相互作用加强了疏水相互作用。此外，观察到与His285残基的π-硫相互作用。
包括Asn81、Gly86、Tyr65、Glu256、Phe264和Met280在内的周围残基主要通过范德华相互作用促成配体结合口袋的形成，支持CV5在酪氨酸酶疏水口袋中的稳定定位（图4b）。
活性位点中的His263残基被认为是与铜离子形成直接配位键的关键氨基酸。对接结果表明，CV5位于His263残基附近并形成氢键和非共价相互作用。这些相互作用可能影响周围电子环境并抑制铜离子的催化活性（Shen等，2019），最终可能导致黑色素生物合成的抑制。
为了比较CV5与代表性酪氨酸酶抑制剂的结合特性，选择曲酸和熊果苷作为参考化合物，并在相同条件下进行对接分析。对接结果预测曲酸与催化口袋内的残基（包括His263、Met280和Ala286）相互作用（图4c，d），而熊果苷被预测与包括Asn260、His263、Phe264和Met280在内的残基相互作用（图4e，f）。值得注意的是，His263被确定为CV5、曲酸和熊果苷的共同相互作用残基。由于His263已知参与酪氨酸酶活性位点的铜离子配位，这些发现表明CV5和参考化合物占据酶催化口袋内的相似区域。
然而，本研究进行的对接分析基于单一静态结构，因此在充分反映肽和受体的动态灵活性和结合过程方面存在局限性。通过分子动力学（MD）模拟的进一步验证有望更精确地理解结合稳定性和相互作用机制（Wang等，2019a，2019b）。
结论
在本研究中，我们设计并合成了环状肽CV5，并评估了其结构特征和生物活性。通过MALDI-TOF质谱识别出与目标分子量对应的峰，证实了肽的成功合成。HPLC分析显示超过98%的高纯度，符合药物开发所需的质量标准（Raghupathi等，2025）。
在生物活性评估中，CV5在浓度高达657 ± 2.72 µM（n = 3）时表现出无细胞毒性，细胞活力保持在90%以上。这些结果表明，在后续评估中观察到的生物活性归因于化合物的内在活性而非非特异性细胞损伤。
在酪氨酸酶抑制测定中，CV5在最高浓度下表现出约95%的抑制活性（IC₅₀: 336.7 ± 5.79 µM），并证明比阳性对照熊果苷（IC₅₀: 535.7 ± 6.91 µM）高出约1.6倍的抑制活性，确认了其强效的酶抑制能力。这些结果表明，CV5作为酪氨酸酶相关障碍的治疗候选物具有潜力，特别是用于改善色素沉着。此外，与线性对应物相比，环状CV5表现出增强的酪氨酸酶抑制和抗氧化活性。特别是，环状CV5的酪氨酸酶抑制活性比线性肽高约3.4倍。在DPPH自由基清除测定中，环状CV5表现出可测量的IC₅₀值，而线性肽在测试浓度范围内未能达到50%的清除活性。这些发现表明，头对尾环化可以是通过结构约束和构象稳定化增强肽生物功能的有效策略。
此外，在DPPH自由基清除测定中，它表现出优异的抗氧化活性，在最高浓度下表现出约86%的清除活性（IC₅₀: 30.27 ± 1.06 µM），表明它可能在减轻与皮肤老化相关的氧化损伤和维持皮肤健康方面发挥关键作用。
此外，分子对接分析显示，CV5在酪氨酸酶的His263附近形成相互作用，His263是关键的铜结合残基，表明它可能通过干扰铜离子的催化活性来发挥其酶抑制作用（Shen等，2019；Ismaya等，2011）。与曲酸和熊果苷的比较对接分析进一步表明，这些化合物占据了酪氨酸酶催化口袋内的相似区域，支持了CV5预测结合的相关性。
特别是，本研究开发的环状肽具有重要意义，因为它与引入非天然骨架的常规拟肽不同，在通过结构约束增强生物活性的同时保持了天然酰胺骨架（Driggers等，2008；Zorzi等，2017）。这种方法可以作为增强功能同时保持生物相容性和合成可及性的拟肽策略（Rezai等，2006）。
总体而言，CV5被证实是一种有前途的候选化合物——一种同时表现出优异酪氨酸酶抑制活性和抗氧化活性的环状肽，未来可能用作色素沉着相关障碍的治疗剂或促进皮肤健康的材料。本研究证明，基于环状结构的肽可以表现出有效的生物活性，并为开发保留天然结构框架的功能性肽提供了有意义的设计方向（Craik等，2013）。此外，具有酪氨酸酶抑制和抗氧化活性的双功能材料可以同时提供皮肤保护和调节色素沉着，因此在功能性化妆品和皮肤病药物领域具有很高的应用前景（Rischard等，2025；Kim和Kim，2025）。
然而，本研究基于体外实验进行，仅限于在受限条件下评估酪氨酸酶抑制活性和抗氧化活性。此外，由于结果基于单一酶系统，因此在直接反映实际生物环境中的功效方面存在局限性。因此，需要进一步评估酪氨酸酶抑制活性并在各种条件下验证抗氧化活性，以及包括细胞和动物模型在内的生物活性和安全性的体内评估。此外，我们计划使用小鼠和人类血清以及皮肤匀浆具体评估代谢稳定性和半衰期。此外，预计通过基于构效关系（SAR）分析的衍生物设计和结构优化，将可能开发出具有增强功效的肽。
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